专利名称：：一种土壤羟胺还原酶活性检测时的显色方法
技术领域：
：本发明涉及应用分光光度法检测土壤中羟胺还原酶活性过程中的显色方法，具体地说是一种应用配合物显色方法间接测定土壤培养液中羟胺浓度的显色方法。
背景技术：
：土壤中的羟胺还原酶能将在土壤中氮代谢(亚硝酸盐的还原或者氨的氧化)过程中形成的中间产物羟胺还原成氨，土壤中的还原态化合物可作为氢的供体。因此，土壤中羟胺还原酶活性的强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素的氨挥发损失，间接影响氮肥的利用效率。土壤中羟胺还原酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中羟胺还原酶活性的检验有很重要的意义。而到目前为止，有关羟胺还原酶活性的测定基本都是参照①.x.哈兹耶夫[苏]著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活性》一书中的方法。该书中所推荐使用的方法为提取液中加入过量的乙酸酐和FeCh,显色机理为被羟胺还原所得的Fe"离子与醋酸酐的羰基作用而显褐色，测定F,离子的浓度，即可间接测定原溶液中羟胺的浓度。其不足之处在于应用此种显色方法所测得的羟胺的浓度较用碘量法所测得的浓度偏低，常形成较大的系统误差。这可能是由于醋酸酐和Fe"形成配合物时的稳定常数较低所导致。应用此法所测定的羟胺还原酶活性的在测量精确度方面也有所欠缺。另外，由于涉及到乙酸酐(冰毒前体)的应用，购买乙酸酐需要公安部门的毒品证明，无形中降低了分析的时效性。
发明内容本发明的目的在于提供一种检验土壤中羟胺还原酶活性时的显色方法。该方法是在借鉴前人所应用的显色方法的原理基础上，对羟胺还原酶活性的测定过程中的显色方法进行了改进。改进后的显色方法较乙酸酐-三氯化铁法更灵敏、系统误差较小、准确度和精密度更高、显色剂用量更少，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为参照①.X.哈兹耶夫[苏]著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活性》一书中的方法进行土壤培养，即l)取0.5-1.0g风干土壤置于100ml带磨口塞得瓶中，加入10-20mg碳酸钩，仔细混合均勾；然后加入1-2ml0.5-1%的盐酸羟胺溶液和1-2mliy。的葡萄糖溶液；在10-12mm水银柱的压力下抽出瓶中空气；将瓶伃细摇匀，并在30土rC恒温箱中放置5土0Jh;用灭菌土壤加试剂作为对照；在培养结束后，向瓶中加入50ml蒸馏水和2-3ml锘钾巩饱和溶液，摇均后用致密滤纸过滤得提取液；2)取土壤培养后的提取溶液lml于50ml容量瓶中，加入含Fe3+0.002-0.OlmolL/'的三价铁盐溶液1-5ml、0.8-2.GgL—'cx-a，联吡啶溶液l-5ml，然后用蒸馏水定容至刻度，显色反应在常温下进行，所得溶液显橙色，显色达到稳定，在520nm下用分光光度计比色测定其吸光值为A;3)在520腿下比色测定一系列两组或两组以上已知浓度的羟胺溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.OOg歸H1.L—'的吸光值A'，以羟胺溶液的浓度和测定的吸光值A'制作标准曲线，得到斜率b;4)根据吸光值A和斜率b,计算提取液中的羟胺浓度S:S=A*b,其中，A为提取液的吸光值，b为标准曲线的斜率；5)计算样品中的羟胺浓度；6)计算羟胺还原酶活性,计算公式为:[(S-S)V^/1000V:J/W,单位mgNH2OH.g—'soil5h-';式中，S,为对照中的歸H含量(mg.L1);S为样品中的肌OH含量(mgL");V!为提取液总体积(ml);V,为显色时定容后的溶液体积(ml);1000为单位转换系数；V3为测定时所取滤液体积，W为称土样重(g)。所述三价铁盐溶液为氯化铁溶液、溴化铁溶液、硫酸铁溶液或硫酸铁铵溶液均可；所述a-a，联吡啶溶液为cc-cc，联吡啶的乙醇溶液或95°/。乙醇(5%水)溶液；如果在40min内不能完成吸光值测定，应加入l-5ml0.01-0.lmolL-1的KF或NaF溶液作为掩蔽剂以阻止副反应发生。本发明方法改进的依据三价铁盐-联吡啶法的显色机理为铁盐溶液中的F,将溶液中的羟胺氧化为氮气，而自身被还原为Fe、Fe2+与加入的oc-a，联吡啶(Dipd)发生配合反应生成的Fe2+-a-oc，联吡啶配合物显橙色，而过量的cx-a，联吡啶与剩余Fe^配合生成无色的Fe3+-a-ot，联吡啶配合物，因而可以通过比色测定Fe"-a-oc'联吡嚏配合物的生成量衡量溶液中羟胺的量。已有研究Fe3++NH2OH+3Dipd-Fe(Dipd)32+(橙色)+1/2N2+H20+H+Fe3++3Dipd——Fe(Dipd)33+(无色)指出，在pH为4.6-6.6的范围内？62+-(1-cc，联吡啶配合物的吸光度不随pH值而变化，故本试验将显色pH调节至此范围。Fe3+-a-a，联吡嗖配合物可以经缓慢的光还原作用而转化为Fe2+-a-cc，联吡啶配合物导致羟胺测定浓度偏高。对此，我们可以通过减少显色时间或通过在待测溶液中加入少量NaF或KF溶液，掩蔽未被还原的Fe"离子，阻止光还原反应的发生来减小应用此法所造成的系统误差。此种方法的最佳测量浓度为羟胺含量在0.4-15mg'L—'范围内，而试验时的羟胺浓度恰好在此范围内。与过去的分析方法相比较，本发明的优点主要有1)所使用的显色方法灵敏度更高，将分析精确度提高了一个数量级。由于羟胺质量浓度在0.4-15ngmr的范围内与吸光度呈良好的线性关系，故本发明所涉及到的显色方法可将结果精确至0.lpg'ml、而原来方法的精确度为1.0iagmr，新方法将分析精度提高了一个数量级。2)准确度和精密度较高。原来的显色方法由于存在显色机理上的不足，使应用分光光度法测定的系统误差不可避免。本发明在显色过程中应用了pH调节、加入掩蔽剂等方法，有效地减少了由于显色机理而引起的测量误差，使检测的准确度和精密度较高。具体实施方式试剂配制1.三价铁盐溶液称取氯化铁0.032-G.162g或溴化铁0.059-Q.296g或硫酸铁0.040-0.200g或十二水合硫酸铁铵0.096-0.482g溶于100ml蒸馏水中即得含Fe3+0.002-0.OlmolL—1的铁盐溶液。2.cc-oc，联吡嚏溶液称取0.08-0.20gcc-a，-联吡啶溶于100ml95°/。乙醇中或无水乙醇中。3.掩蔽剂称取NaFO.042-0.420g或KFO.058-0.581g溶于100ml蒸馏水中。标准曲线制备2.1046g盐酸羟胺溶于1L水中，则得到lgL-'的贮备液。此贮备液需放入4。C的冰箱中保存，保存时间不宜超过数周。吸取上述标准贮备液lml，定容至100ml，得到0.Olg.L—'的溶液。再分别吸取该溶液O、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，所得羟胺溶液浓度为0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.OOg歸H.L加入含Fe3+0.002-0.OlmolL-1的三价铁盐溶液1-5ml、0.8-2.0g.L—'oc-oc，联吡嗖溶液1-5ml，加入1-5ml0.01-0.lmol'L—'的KF或NaF溶液作为掩蔽剂，然后用蒸馏水定容至刻度，显色一段时间达到稳定，在520nm下用分光光度计比色测定其吸光值为A'，以羟胺溶液的浓度和测定的吸光值A'制作标准曲线，得到斜率b。操作步骤1.取O.5g风干土壤置于100ml带磨口塞得瓶中，加入^mg碳酸钙，仔细混合均勾。然后加入lm10.5y。的盐酸羟胺溶液和imiiy。的葡萄糖溶液。在10-12mm水银柱的压力下抽出瓶中空气。将瓶仔细摇匀，并在3(TC恒温箱中放置5h。用灭菌土壤加试剂作为对照。在培养结東后，向瓶中加入S0ml蒸馏水和2ml铝钾巩饱和溶液，摇均后用致密滤纸过滤得提取液；2.取lml提取液于50n〗l容量瓶中，加入含Fe3+0.002-0.OlmolL-!的三价铁盐溶液l_5ml、0.8-2.0g.L—'oc-cc，-联吡啶溶液1-5ml,加入卜5ml0.01-0.lmol.L—1的KF或NaF溶液作为掩蔽剂，然后用蒸馏水定容至刻度，显色一段时间达到稳定，在520nm下用分光光度计比色测定其吸光值为A;3.根据吸光值A和斜率b,计算提取液中的羟胺浓度S:S=A*b,其中，A为提取液的吸光值，b为标准曲线的斜率；4.计算样品中的羟胺浓度；5.计算羟胺还原酶活性，计算公式为[(s,-s)vj/ioocng/w,单位mgNH2OH.g-lsoil.5h、式中，S,为对照中的NH湖錢(mg'L—1);S为样品中的風OH錄(mg-L—1>，V,为提M总体积(ml),本逸验为54ml;V2为显色时定容后的溶液体积(ml),本乱验为50ml;IOOO为单位转换系数；乂3为测定时所恥虑液#^,本乱睑为lml;W为称土样重(g),本i^睑为0.5g。实施例l供^i壤l为红壤，釆自中国科学院江西鹰潭逸睑站；土壤2为草甸棕壤，采自中国科学院沈阳生态站；土壤3为水稻土，采自江苏扬州良种场。规用分光光度法测定三种土壤中羟B原酶活性，用本发明的显色方ife^行显色和比色。取0.5g风干土i體于100ml带磨口塞得瓶中，力口入20rag碳酸钩，仔细混合均匀。然后力口入lm10.5%的盐^^溶液和lmliy。的葡萄糖溶液。在10-12咖水银柱的压力下抽出瓶中空气。糊瓦仔细摇勾，并在3(TC恒温箱中方燈5h。用灭菌土働喊剂作为对照。在培养结東后，向瓶中力口入50ml蒸馏7沖2ml铝钾石凡饱和溶液，摇均后用致密滤取lml提于50ml容量瓶中，加入lm10.OlmoiL—'的硫酸铁铵溶液、lmllOg-L—1的a-(x，联吡嚏溶液和1ml0.05moi.「'的KF溶液作为掩総ij，然后用蒸馏水定容至刻度，显色10min，在520nm下用分光计比色测定其吸光值为A;根据吸光值A和斜率b,计算提中的浓变3:S=A*b,其中，A为提tt的吸光值，b为标难曲线的斜率；计#^羊品中的#量。微结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表中数据可以看出，各处理之间结果差异达到显著水平，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。实施例2本实施例所使用的三种土壤分别为1号为对照，即不经过任何处理和不添加任何人土壤添加剂在25。C培养24h以上的普通土壤；2号为添加硝化抑制剂3,5-二甲基吡唑磷酸盐且在25'C培养24h以上的土壤；3号为添加硝化抑制剂l-羟甲基-3,5-二甲基吡唑且在25匸培养24h以上的土壤，土壤含水量均为20%。2号和3号添加硝化抑制剂的土壤，其中两种抑制剂的添加量都是1.15mgkg—'土。用上述方法检测三种土壤羟胺还原酶活性。每种土壤的具体分析过程如下取l.0g风干土壤置于100ml带磨口塞得瓶中，加入10mg碳酸钩，仔细混合均匀。然后加入2ml0.5%的盐酸羟胺溶液和2ml"/。的葡萄糖溶液。在10-12mm水银柱的压力下抽出瓶中空气。将瓶仔细摇匀，并在3(TC恒温箱中放置5h。用灭菌土壤加试剂作为对照。在培养结束后，向瓶中加入50ml蒸馏水和2.5ml铝钾巩饱和溶液，摇均后用致密滤纸过滤得提取液；取lml提取液于50ml容量瓶中，加入4ml0.005mol的硫酸铁铵溶液、4ml1.Og.L—'的cc-a，联吡啶溶液和5ml0.OlmolL'的NaF溶液作为掩蔽剂，然后用蒸馏水定容至刻度，显色10min,在520nm下用分光光度计比色测定其吸光值为A;根据吸光值A和斜率b,计算提取液中的羟胺浓度S:S=A*b,其中，A为提取液的吸光值，b为标准曲线的斜率；计算样品中的羟胺浓度量。试验结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。权利要求1.一种土壤羟胺还原酶活性检测时的显色方法，其特征在于1)取0.5-1.0g风干土壤置于100ml带磨口塞得瓶中，加入10-20mg碳酸钙，仔细混合均匀；然后加入1-2ml0.5-1％的盐酸羟胺溶液和1-2ml1％的葡萄糖溶液；在10-12mm水银柱的压力下抽出瓶中空气；将瓶仔细摇匀，并在30±1℃恒温箱中放置5±0.2h；用灭菌土壤加试剂作为对照；在培养结束后，向瓶中加入50ml蒸馏水和2-3ml铝钾矾饱和溶液，摇均后用致密滤纸过滤得提取液；2)取土壤培养后的提取溶液1ml于50ml容量瓶中，加入含Fe3+0.002-0.01mol·L-1的三价铁盐溶液1-5ml、0.8-2.0g·L-1α-α’联吡啶溶液1-5ml，然后用蒸馏水定容至刻度，显色反应在常温下进行，所得溶液显橙色，显色达到稳定，在520nm下用分光光度计比色测定其吸光值为A；3)在520nm下比色测定一系列两组或两组以上已知浓度的羟胺溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00gNH2OH1·L-1的吸光值A’，以羟胺溶液的浓度和测定的吸光值A’制作标准曲线，得到斜率b；4)根据吸光值A和斜率b，计算提取液中的羟胺浓度SS＝A*b，其中，A为提取液的吸光值，b为标准曲线的斜率；5)计算样品中的羟胺浓度；计算羟胺还原酶活性，计算公式为[(S1-S)V1V2/1000V3]/W，单位mgNH2OH·g-1soil·5h-1；式中，S1为对照中的NH2OH含量(mg·L-1)；S为样品中的NH2OH含量(mg·L-1)；V1为提取液总体积(ml)；V2为显色时定容后的溶液体积(ml)；1000为单位转换系数；V3为测定时所取滤液体积，W为称土样重(g)。2.根据权利要求l所述的显色方法，其特征在于如果在40min内不能完成吸光值测定，应加入l-5m10.01-0.lmol!/1的KF或NaF溶液作为掩蔽剂以阻止副反应发生。3.根据权利要求l所述的显色方法，其特征在于三价铁盐溶液为氯化铁溶液、溴化铁溶液、硫酸铁溶液或硫酸铁铵溶液，溶液中Fe"农度为0.002-0.Olmol.L-!,显色时加入量为l-5ml。4.根据权利要求1所述的显色方法，其特征在于oc-cc'联吡^^溶液为cc-a，联吡啶的乙醇溶液或cc-a，联吡啶的95%乙醇(5%水)溶液，其浓度为0.8-2.0g.L',显色时加入量为卜5ml。全文摘要本发明涉及一种土壤羟胺还原酶活性检测时的显色方法，具体地说是在土壤培养后的提取液中加入三价铁盐溶液和α-α’联吡啶溶液并在微酸性环境下显色，然后应用分光光度法比色测定提取液中的羟胺浓度。将其吸光值同标准曲线进行对比得到培养液中的羟胺浓度，从而计算得到土壤中羟胺还原酶的活性。显色反应在常温下进行，所得溶液显橙色，比色波长为520nm。如果在40min内不能完成比色，应加入掩蔽剂阻止副反应发生。改进后的显色方法同传统的显色方法比较，具有灵敏度高、系统误差较小、准确度和精密度高、显色剂用量较少等优点，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。文档编号G01N21/78GK101191772SQ200610134408公开日2008年6月4日申请日期2006年11月29日优先权日2006年11月29日发明者史云峰,武志杰,王殳屹,陈利军,隽英华申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所