专利名称：评价烟雾对细支气管的影响的方法
评价烟雾对细支气管的影响的方法发明领域本发明涉及评价从烟雾获得的脂溶性部分对细支气管的影响以及 鉴定生物活性剂的方法，该生物活性剂能够降低烟雾对血管或细支气 管中的平滑肌细胞的影响。发明背景长期以来认为吸烟是与动脉粥样硬化的高发病率相关的强危险因 素，与高血脂和高血压协同起作用。中风，心肌梗塞和跛行在吸烟者中是常见的(Wyngaarden & & Smith. Ce"7 7^由oi of歸/c/./7e, 1-2404 (W. B. Sauders company, Philadelphia, 1988 )。在西方 国家心血管疾病的直接医疗花费是巨大的并且已经发现吸烟导致全世 界每年5百万的过早死亡，令人感兴趣地，这些中的大部分是由于心血管事件引起的 (Lightwood. The economics of smoking and cardiovascular disease,户rc^ Csrd/op^c Z /s 46， 39-78 ( 2003 )。 认为烟雾颗粒引起对动脉壁的损伤，引起内皮的局部化功能障碍和增 强的斑块形成(Holden等，Endothelium-dependent effects of cigarette smoke components on tone of porcine intrapulmonary bronchioles in vitro( 7bi/co/ j卯/ 力sr则co/ 104， 191-9( 1990 ))。 然而，解释吸烟如何参与并恶化动脉粥样硬化过程的分子机理没有得到充分了解。因此，存在研发一种方法的需要，在该方法中可以在支 气管水平评价烟草烟雾的影响。通过发展这样的方法，可评价现有的 烟草以及新的烟草产品的影响，所述新的烟草产品可能对动脉壁和气 道具有较低的影响或根本没有影响并有希望降低对烟草消费者的危 害。该方法还可以用于筛选可以防止烟草产品在血管或气道的平滑肌 细胞中诱导的改变的物质，以及使用该方法来测定受体调控的表达，其可能由于吸烟而改变，即，可将该方法用作诊断方法。 发明概述本发明涉及评价从烟雾获得的脂溶性部分对解剖的(dissected) 细支气管如动脉或气道平滑肌细胞的影响以及鉴定生物活性剂的方 法，该生物活性剂能够降低烟雾对血管或细支气管的影响。因此，这 是第一次可以相互比较不同的烟雾，如来自不同的烟草或烟草产品的 不同烟雾，并鉴定哪种烟草对使用所述烟草的人具有较少的危害，以及在发现新烟草中使用该方法，该新的烟草不影响或低程度地影响所 有受到烟雾影响并存在于血管或细支气管平滑肌细胞内的受体的表 达，例如动脉壁或气道中的内皮缩血管肽受体，并因此降低血管或细 支气管中平滑肌细胞的收缩。根据第一个方面，本发明涉及评价脂溶性烟草烟雾颗粒对血管或 细支气管中的平滑肌细胞的影响的方法，包括步骤提供来自动物的 解剖的细支气管或血管，将所述解剖的细支气管或血管暴露于脂溶性 烟雾颗粒，在解剖所述细支气管或血管之前诱导一种或多种介导紧张 性的受体的上调，将所述解剖的细支气管或血管浸入介质中并对所述 细支气管或血管施加张力，测定所述解剖的细支气管或血管的收缩应 答和评价烟雾对血管或细支气管中的平滑肌细胞的影响。在第二个方面中，本发明涉及评价烟草烟雾对血管或细支气管中的平滑肌细胞的影响的方法，包括步骤提供来自动物的解剖的细支 气管或血管，将所迷解剖的细支气管或血管暴露于脂溶性烟雾颗粒， 在解剖所述细支气管或血管之前诱导一种或多种介导紧张性的受体的 上调，将所述解剖的细支气管或血管浸入介质中并对所述细支气管或 血管施加张力，加入生物活性剂，测定所述解剖的细支气管或血管的 收缩应答，和评价烟雾对血管或细支气管中的平滑肌细胞的影响和获 得生物活性剂。在第三个方面中，本发明涉及已经通过上述方法获得的生物活性 剂，以及所述生物活性剂的用途，用于治疗涉及血管或细支气管收缩的病症，例如在慢性阻塞性肺病或细支气管哞喘之后。 附图简述图l.烟碱与DSP相比较对ACh-诱导的血管舒张的影响。使用 0. llmg/L的烟碱浓度，这是DSP中的烟碱浓度。因为烟碱和烟雾颗粒 溶解于DMS0中，将相同体积的DMSO加入培养基中作为对照。用烟碱 或DSP处理动脉6小时(A)和12小时(B)。数据显示为平均值土S. E.M. n=8。 *p<0. 05和"p〈0. 01 vs.对照。发明详述 定义在本申请和本发明的上下文中，适用以下定义术语"脂溶性烟雾颗粒"用来表示实施例1中获得的部分。术语"生物活性剂，，用来表示能够作为蛋白激酶抑制剂起作用的 物质，该抑制剂能够通过降低血管收缩或提高血管舒张来使血管紧张 性正常化，如在缺血性脑损伤后的动脉中。术语"介质"用来表示溶液，在其中可以上调解剖的动脉或细支 气管的受体。受体的实例是内皮缩血管肽，如A,和A"血管紧张素， 如AT和AT" 5-羟色胺，如5HT1B,和緩激肽，如B!和B2。生理溶液 的实例是本领域^支术人员显而易见的。实例是改良的KREB， s, DMEM, 生理NaCl，磷酸盐緩冲液等。根据本发明的术语"治疗"意思是通过抑制导致转录和翻译的信 号，受体上调将得到阻止，因此，例如，导致半影区损伤和神经元丧 失的后遗症将得到消除。术语"上调"用来表示血管和气道中的受体在表型上改变和/或在 数目上增加，这将导致对循环和肺功能的有害影响。术语"细支气管"用来表示气管后的气道。本发明的方法本发明涉及评价烟雾对血管或细支气管中平滑肌细胞的影响的领 域，并因此获得关于烟雾中哪种颗粒引起特定影响的知识。脂溶性烟 雾颗粒可以来自不同的烟草产品，如常规的香烟或雪茄。然后可从烟 草中去除颗粒并因此可以获得更健康的烟草，其对烟草消费者具有较 少的负面影响。已经令人惊讶地发现烟草烟雾至少上调动脉和细支气管平滑肌细胞(SMC)中的内皮缩血管肽受体。该方法还可以用于鉴定 新的生物活性剂，该活性剂可以用来治疗涉及细支气管或血管的病症 以及用来测定受到脂溶性烟雾颗粒上调的受体的表达，并因此使用该 方法来测定由脂溶性烟雾颗粒引起的病症或疾病的程度。为了能够鉴定这样的烟草脂溶性烟雾颗粒，我们已经研发了 一种 方法，其中可以与一种或多种受体如内皮缩血管肽受体的上调平行或 顺次地诱导收缩和/或舒张。发明人已经令人惊讶地发现体内或体外遭 受缺血的组织的血管，如基底动脉和大脑中动脉，经历表型改变，使 得血管收缩受体群得到上调，其导致过度的动脉收缩，变得上调的受 体中有例如内皮缩血管肽，5-羟色胺和血管紧张素受体。使用烟草脂 溶性烟雾颗粒看到相同的效果，虽然强烈得多。该方法可以用于理解 涉及例如内皮缩血管肽受体上调的分子机理；该过程参与血管和肺疾 病。从这点，然后可以鉴定出生物活性剂，其可以用来治疗烟雾诱导 的疾病。生物活性剂可以担当蛋白质激酶抑制剂。可以从动物如大鼠，小鼠，豚鼠，狗，猫，马或其合成形式获得 动脉或气道SMC。通过使用Adner等^>开的技术，Plasticity of contractile endothelin-B receptors in human arteries after organ culture. Br J Pharmacol 119， 1159-66 ( 1996 )和气道如 Granstr6m等，Up-regulation of endothelin receptor function of mRNA expression in airway smooth muscle cells following sephadex-induced airway inflammation. Basic & Clinical Pharmacol Toxicol. 2004; 95: 43-48，来获得SMC。然后将分离的 动脉或支气管暴露于烟草烟雾或烟草脂溶性烟雾颗粒，后者已经从所 述烟雾中提取出来，如水溶性颗粒或脂溶性颗粒。 一种提取所述脂溶性烟雾颗粒的方法是实施例1。可以在暴露于烟草脂溶性烟雾颗粒之前或之后，将细支气管解剖 成更小的节段或圆片。细支气管将在暴露于脂溶性烟雾颗粒的过程中上调内皮缩血管肽 受体或内皮缩血管肽受体可以保持或多或少的活性。然而，迄今为止 已经评价的所有烟草都激活内皮缩血管肽受体，并且结论是如果从烟 草去除上调内皮缩血管肽受体的颗粒，可以获得更健康的烟草或组织 将不易于患病。因此，本发明的方法是重要的且应当是研发新烟草中 有用的工具。该方法还可以用于筛选可以防止烟草产品在气道中血管 平滑肌细胞中诱导的改变的物质，以及使用该方法来测定可由于吸烟 而改变的受体调节的表达，即，可将该方法用作诊断方法。包括以下实施例来进一步说明本发明，且本发明不应当限于此。实施例1Z 577 #炎承通过水抽吸器来"抽，，三支烟(每支烟0. 8mg烟碱)并且使烟雾 通过原棉过滤器。将过滤器中截留的烟雾颗粒溶解于lmlDMS0中。通 过气相色镨-火焰电离检测(GC-FID， Agilent 6890N， USA)来分析 DMS0可溶性烟雾颗粒(DSP )制剂，使用0. 23mm x 15mm x 0. 25m DB-5MS 毛细管柱(Agilent, USA )。将GC-FID温度编程，从50t:以51C/min 升高至280X:，并保持3分钟。根据标准烟碱峰值和面积来计算DSP 中烟碱的浓度。通过气相色镨分析DSP制剂后，用DMSO将它们稀释至 标准烟碱含量(0. llmg/L)并用于器官培养实验。实施例2 遂欢刺备用C02将Sprague-Dawley大鼠(250 ~ 300g，雄性或雌性)安乐 死，将头部切下并放血。温和地取出肠系膜上动脉，浸入冷的充氧緩 沖溶液(以mM计NaCl 119， NaHC03 15， KC1 4. 6， MgC12 1. 2， NaH2P041.2， CaC12 1.5，葡萄糖5.5， pH7.4)，并在光学显微镜下解剖成 无粘附组织。从Department of Forensic Medicine of Xian Jiaotong University (China)(西安交通大学法医系(中国))的3名对象获 得人大脑中动脉(MCA)。在由于交通事故死亡后4至6小时，从三名 男性收集动脉并用于器官培养。使用大鼠和人动脉的实验方案获得当 地Ethic， s Committee of Shaanxi province (China)(映西省伦 理委员会(中国))的批准。实施例3我们已经研发了诱导血管细胞中GPCR表型改变的体外方法，通过 将动l^片段培养一段时间(Ander等，Plasticity of contractile endothelin-B receptors in human bronchioles after organ culture./户力"鹏co/ 119， 1159-66 ( 1996 ))。在无血清的DMEM中在37 'C在富含5°化02的潮湿空气中培养1mm长的环状片段(除去了内皮和 外膜)24小时，含或不含0. 2 ju 1/ml的DSP。实施例4 沐斧秀理夢对于收缩实验，将细支气管安置在淹没在以下組成的控温緩冲溶 液(37"C )中的两个金属丝上(Myograph, J. P. Trading, Denmark): (mM)NaC1119， NaHC03 15， KC1 4. 6， MgCl2 1. 2， NaH具l. 2, CaCl2 1.5和葡萄糖5.5。将緩冲剂用富含5%0)2的氧气连续充气，使得pH 为7.4。通过用于个人电脑连续记录的PowerLab装置(AD Instruments, Hastings, England )记录观'J量值，并用软件程序Chart 分析(Ander等，Plasticity of contractile endothelin-B receptors in human bronchioles after organ culture. /尸/ arzi7sco7 119， 1159—66 ( 1996 ))。实施例4将血管片段，每组三个样品，置于Tissue TEK (Gibco)上，冷 冻并随后切成8pM厚的切片。所用的一抗是兔子抗人ETb(IBL， 16207 )， 1: 400稀释，山羊抗人ETA ( Santa Cruz Biotechnologis， sc-2 1194 ) , 1: 100稀释，小鼠抗大鼠平滑肌肌动蛋白(Serotec， MCA 1 905T) ， 1: 100稀释，和小鼠抗大鼠CD3 l( Serotec， MCA 1746 ), 1: 200稀释。所有稀释在含有10%胎牛血清的PBS中进行。所用的二 抗是缀合的驴-抗-小鼠CyTM5( Jackson ImmunoResearch， 715-175-150 ) 1:100,缀合的驴-抗-兔Cy 3( Jackson ImmunoResearch, 711-165-152 ) 1: 100,在含有10%胎牛血清的PBS中。然后在共焦显微镜(Zeiss, USA )合适波长下检测抗体。作为对照，只使用二抗。用Image J (http: 〃rsb. inf. nih. gov/i j )研究绝对荧光并减去背景荧光。在存 在平滑肌肌动蛋白阳性染色的地方，即因此在血管的肌肉部分中，进 行测量。获得的值是选定区域中的平均荧光。实施例5應冲^矛挣,砑充器官培养后，收集血管并置于水上，在含有蛋白酶-和磷酸酶抑制 剂的裂解緩冲剂(10mMTris pH7. 4, 50mM P-甘油磷酸，100 ju M Na3V04, 0. 5°/。脱氧胆酸，lmMEGTA， 1mMEDTA, lmMNaF， 20mM Na4P20" 1% Triton X-IOO， lmM DTT， 20jaM抑胃酶肽，20juM亮抑酶肽，0. lU/ml抑酶 肽，InM花萼海绵诱癌素(Calyculin)和lmM PMSF)中均浆。使用 BioRad DC试剂盒(Hercules, CA， USA)和Genesys 6分光光度计 (Thermo, Waltham， MA， U.S.A.)测定总蛋白浓度。在10% SDS-PAGE 凝胶上的每个泳道中上样45 jug总蛋白并以1.5mA/cm'印迹到Hybond PVDF膜上，持续30分钟。随后用5%脱脂奶将膜在室温(RT)封闭1 小时并用 一抗在4X:孵育过夜，用二抗(Pierce, Rockf ord, IL， U. S. A.) 在RT赙育1小时。用Supersignal Dura试剂盒(Pierce, Rockford,IL， U.S.A.)将膜显影并用Fujifilm LAS-1000 Luminiscent图象分 析仪(Stamford, CT， U.S.A.)观察。使用1: 1000的pAkts,， pJNK，磷酸-p38， ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA， U.S.A.)， pELKl， pPKC5 SBR645 5 pPKC ￡ SER729 (Biosource, Camari 1 lo， CA， U. S. A，)， ETA和ET"Chemicon， Temecula， CA， U.S.A.)。使用1: 2500的pERK (P謂ega， Madison, WI， U.S.A.)。实施例6 体外药理学从气管和支气管切下包括两个软骨节段的圆环片段。用1mm直径 的金属线剥除每个片段的上皮，并且表面作为finegraded file来避 免混淆扩张效果(Hadj-Kaddour等，1996 )。然后将它们安置在两个L-型的金属叉上。 一个叉连接力位移传感 器，该传感器连接用于等容张力连续记录的计算机，另一个叉连接位 移装置。然后将片段浸入小的(2. 5ffll )含有相同緩冲溶液的控温(37 °C )组织浴中。用02中5°化02平衡溶液，使得pH为7. 4。最初，将lmN 的张力施加至每个片段，然后使其稳定在该张力水平60分钟。首先通 过暴露于富钾(60mM)緩冲溶液(对于组成，参见以下)来检查每个 片段的收缩能力。只有已经引发两次强烈(>lmN)的可重复收缩(变 异<10%)后，将各个片段用于进一步的研究。将通过r-溶液(60mM) 诱导的收缩用作收缩参照。剥除上皮和上皮完整片段之间的比较实验 证明了收缩能力不受剥除影响或损害。以三个部分来进行浓度应答实验首先，气管中的内皮缩血管肽 受体，在内皮缩血管肽ETr拮抗剂FR 139317 ( 10|iM)，内皮缩血管 肽ETB-拮抗剂BQ 788 ( 10|liM)不存在或存在下，或在两种拮抗剂的 组合或混合的ET受体拮抗剂波生坦(10pM)存在下，使用内皮缩血 管肽-l和S6c表征。其次，在已经建立嗜酸性粒细胞炎症后(24h)， 在大鼠气道的两个水平-气管和支气管研究内皮缩血管肽-l和S6的效 果。通过内皮缩血管肽激动剂达到最大收缩时，加入乙酰胆碱(lmM)。在该研究中可以使用所有片段，即，没有片段通过除去上皮或由Sephadex诱导的炎症而受到损害。通过木棒机械除去气道上皮细胞， 并在实验后通过组织学研究来控制结果(苏木精-曙红染色)。緩冲溶液和药物标准緩冲溶液(mM): NaCl 119, NaHC03 15， KC1 4. 6, MgCl21.2， NaH2P041.2， CaCl21.5,葡萄糖5.5。使用分析级化学物质和双蒸馏 水制备所有的溶液。将S6c和ET-l (Auspeptide, Aus)溶解于含有 牛血清白蛋白(Kabi, Sweden)的水中(0.1% w/v )。将所有MAPK 抑制剂溶解于DMSO中并稀释于水中。PD98059, SB239063, SB408039, SB386023b和SB203580购自Sigma， St.Louis， USA。计算和统计将数据表示为平均值士S.E.M.将每个片段的收缩应答表示为r 诱导的收缩的百分比。Emax表示激动剂诱导的最大收缩，对于每个血管片段，以绝对值给出或表示为r诱导的应答的百分比。从浓度-应答曲线中点以上和以下的浓度之间的线计算出pECs。值。将Dunn， s post-hoc检验的Kruskal-Wallis非参数检验用于所有的统计分析。 在P<0. 05认为差异是显著的。实施例7 实时PCR将肺样品在获得后立即在液氮中快速冷冻并使用TRIzol试剂 (GibcoBRL)按照供应商的说明提取总细胞RNA。将所得到的RNA沉淀最后用70%冰冷乙醇洗涤，风千并再溶解于10 pi焦碳酸二乙酯 (DEPC)-处理的水中。使用分光光度法(DU64分光光度计；Beckman，Fullerton， CA, USA )观'J定RNA的量，i人为OD260: 280 > 1. 6的t匕侈'J为纯的。4吏用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin—Elmer， Foster City,CA， USA)在DNA热循环仪(Perkin-Elmer)上进行RT-PCR。如下设 计用于大鼠内皮缩血管肽ETA(产生264个碱基对产物)和内皮缩血管 肽ETs受体(产生560个碱基对产物)的特异性引物内皮缩血管肽ETA-受体正向5'-TACAAGGGCGAGCAGCACAGGA-3, 反向5' -CACAGGGCGAAGATGACAACCAA-3'内皮缩血管肽EL-受体正向5,-TGACGCCACCCACTAAGAC-3, 反向5'-GACAGCCAGAACCACAGAGA-3'用GeneAmp RNA PCR试齐寸盒(Perkin Elmer, Foster City, USA) 在Perkin Elmer DNA热循环4义中进行总RNA至cDNA的逆转录和随后 的PCR。使用随机六聚物作为引物在20-|u 1反应体积中从1 总RNA 合成第一链cDNA。将反应混合物在25C孵育IO分钟，42°C 15分钟， 加热至99。C 5分钟，并冷却至5°C 5分钟。对于每个引物对，通过 PCR在50|u 1终体积中扩增来自所得到cDNA的9 n 1部分。用以下的 方案进行PCR: 95" 5分钟，1个循环；接着95X: 1分钟，57C1分 钟和72X: 3Q秒钟，3Q个循环；在72C进行最后延伸7分钟。在所有 实验中包括空白(水)。对照实验显示出30个循环在PCR的指数期内 (未显示)。通过如下的限制分析证实PCR产物的鉴定用SpH I(Boehringer Mannheim, Germany)消化内皮缩血管肽EL产物，产生三个分别为27， 78和159个碱基对的片段。用Eco RV (Boehringer )切割内皮缩血管 肽ETr产物，产生两个分别为106和454个碱基对的片段。取出后将肺组织在-80r快速冷冻。使用FastRNA Kit-GREEN和 FastPrep FP120Cell Disrupter ( B皿Ol, Qbiogene， Carlsbad CA， USA)按照供应商的说明提取总细胞RNA。最后将所得到的沉淀再溶解于10pL焦磷酸二乙酯(DEPC)-处理的水中。使用GeneAmp RNA PCR 试剂盒(PE Applied Biosystems, Foster City, USA )在Perkin Elmer DNA热循环仪中进行总RNA至cDNA的逆转录。使用随机的六聚物作为 引物在20-ju 1反应体积中从1 ji g总RNA合成第一链cDNA。将反应混 合物在25匸孵育IO分钟，42X:i5分钟，加热至99。C5分钟，并冷却 至5匸5分钟。在GeneAmp 5700测序系统(Perkin-Elmer， Applied Biosystem， Foster City, CA， USA)中使用GeneAmp SYBR⑧Green试 剂盒(Perkin-Elmer， Applied Biosystems Foster City, CA， USA) 进行实时PCR,在50 jiL反应体积中使用如上合成的cDM作为模板。 在所有实验中包括无模板对照。GeneAmp 5700测序系统使用光学和成 像系统，通过荧光染料与双链DNA的结合，实时监测DNA的生长。如 下设计用于大鼠ETA和ETB受体的特异性引物EL受体正向5'-ATTGCCCTCAGCGAACAC-3' 反向S'-CAACCAAGCAGAAAGACGGTOEL受体正向5'-GATACGACAACTTCCGCTCCA-3' 反向5'-GTCCACGATGAGGACAATGAG-3'将延伸因子-1 ( EF-1 ) mRNA用作参照，因为这是管家基因的产物， 在细胞中连续表达至恒定的量。如下设计EF-l引物 EF-1正向5'-GCAAGCCCATGTGTGTTGAA-3' 反向5'-TGATGACACCCACAGCAACTG"^用以下方案进行实时PCR: 50匸2分钟，IO分钟，95°C 15 秒x 40，和60°C 1分钟。为了证明EF-1的cDNA和ET受体在实时PCR过程中以相同效率扩增，制备标准曲线，其中将CT-值对cDNA浓度作 图，基于等式CT- (lg (1 + E)rig (浓度)，其中E是扩增效率， 最佳值为1。为了证明每个引物对只产生一个PCR产物，进行对PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳。药物PCR:用于PCR测定的寡核苷酸和试剂购自Perkin-Elmer ， Appl ied Biosystems Fosty City, CA， USA。计算PCR:对n只sephadex处理的大鼠和n只盐水处理的大鼠进行PCR 实验。通过公式X。/R。-2etR—"x相对于相同样品中EF-lmRNA的量计算 EL和ETB受体mRNA的量，其中X。-ET受体mRNA的最初含量，R。=EF-1 mRNA的最初含量，CtR-对于EF-1的C广值，CtX-对于ET受体的CT-值。进行统计学分析，其中认为p<0. 05是显著的。实施例8其他受体的分子生物学数据表明了其他受体，实例为AL 5-耵18和也受到上调。可 能存在其他还没有明确的受体，这些受体在肺病的情况中得到改变或 过表达，其可能也引起了孝喘中的过度血管收缩。附带地，不仅是膜结合的受体引起肺流的调节，它们与不同类型 的离子通道的活性的偶联也是相关的。总地来看，鉴定潜在有益的生 物活性剂的有效方法需要留意不同机理的能力。,g ^炎承使用FastRNA -Kit-GREEN( BIO 101, Carlsbad CA， USA)按照供应商的说明提取总细胞RNA。最后用75%乙醇洗涤所得到 的沉淀，风干并再溶解于40juL焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中。用GeneAmp RM PCR试剂盒(PE Applied Biosystems,Foster City,USA)在Perkin Elmer DNA热循环仪中进行总RM至cDNA的逆转录。 使用随机六聚物作为引物在40 反应体积中从总RM合成第一链 cDNA。将反应混合物在25"C孵育IO分钟，加热至42X:i5分钟，进一 步加热至99C5分钟，并冷却至51C5分钟。在GeneAmp "00测序系 统中使用GeneAmp SYBR Green试剂盒(Perkin-Elmer ， Applied Biosystems Foster City, CA， USA)进行实时PCR,在50jnL反应体 积中使用如上合成的cDNA作为模板。在所有实验中包括无模板对照。 GeneAmp 5700测序系统使用光学和成像系统，通过荧光染料与双链DNA 的结合，实时监测DNA的生长。如下设计用于AT,和AL受体，ACE和 NF-kB的特异性引物 AL受体正向5' -GGATGGTTCTCAGAGAGAGTACAT-3, 反向y-CCTGCCCTCTTGTACCTGTTG -3'AT2受体正向5' -TCTGTTAGTGGGATGCATGTAATCA-3' 反向5'-TGTGGGCCTCCAAACCATT-3'ACE正向S'-CCCGGAAATACGAAGAATTGd 反向5'-GGCTCTCCCCACCTTGTCTC-3'NF-kB正向5'-GAGAGCCAGTAGCACGCATG-3, 反向5'-CCTGGGTTCGTGGAATGAGT-3'将延伸因子-1 UF-1)和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH) mRNA用 作内源标准，如下设计引物 EF-1正向5'-GCAAGCCCATGTGTGTTGAA-3' 反向5' -TGATGACACCCACAGCAACTG-3'GAPDH正向V-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3' 反向y-CGGCATGTCAGATCCACAAC-3'使用以下方案进行实时PCR: 50。C 2分钟，接着40个循环的95 °C 15秒钟和60t; 1分钟。计算户^:每个测试的引物，对5-6只大鼠进行PCR实验(每个样品一 式双份)。通过公式X。/R。= 2"H"相对于相同样品中EF-1和GAPDH mRNA 的含量计算mRNA的含量，其中X。-目标mRNA的最初含量， R。=EF-1/GAPDH mRNA的最初含量，CtR-对于EF-1/GAPDH的C广值，CtX= 对于目标的C广值。CT-值指的是在特定的时间点在一个样品中的每个 基因产物进行的PCR循环数。数据表示为平均值士SEM。用非配对的 Student' s t-检验进行统计学分析并且^人为P<0. 05是显著的。实施例9 蛋白质印迹使用蛋白质印迹来证实细支气管中激活的(磷酸化的)MAPK的存 在。将用于蛋白质印迹的细支气管的片段培养0. 5， 1， 2， 3或24h, 在液氮中快速冷冻，随后储存在-80'C直至使用。将用于蛋白质印迹的组织最初在500 |u L的Laemml i溶液中孵育并 用polytron ( IKA labor technik,德国)勻浆。将裂解物以5000 x g 4 。C离心5分钟并将上清液转移至新的管中。加入更多的Laemmli溶液 来获得大约75mg组织/mL的浓度。将裂解物存储在-20"C直至使用。将蛋白质加热至97-100°C 3-5分钟来使大多数蛋白质变性。将等量的煮过的上清液部分上样于10%聚丙烯酰胺凝胶上，通过电泳来分 离(Mini-protein 3, Bio-Rad， CA )，然后通过半干印迹(Trans-blot SD， Bio-Rad)转移至semi-blot PVDF膜(Bio-Rad)上。用TBS-T (TBS中0. 1%吐温-20)中5%脱脂乳溶液封闭蛋白质印迹并在含有脱 脂乳和合适稀释度的多克隆抗体的TBS-T中4C孵育过夜。将膜在 TBS-T中洗涤，与抗-兔子IgG辣根过氧化物酶-标记的二抗(1: 50 000 ) 孵育90分钟。进一步洗涤后，将PVDF膜接受SuperSignal West,并 通过Luminiscent图象分析仪(Fujifilm Science Imaging systems, 日本)检测化学发光。在p38和Akt-蛋白质激酶凝胶中，将来自大鼠 细支气管的细胞提取物施加至凝胶作为阳性对照。对于该方法的更多 详细内容参见(Frodin等，2002 )。将山羊多克隆抗体用于检测ERK1/2 ( Santa Cruz Biotechnology, USA),而将多克隆兔子抗体(Promega, USA)用于检测磷酸-ERK1/2 激酶。将兔子多克隆抗体(Cell Signaling Technology, USA)用来 检测p38 MAP激酶，磷酸-p38 MAP激酶(Thrl80/Tyr182 ) ， Akt蛋白 激酶，磷酸-Akt蛋白激酶(Thr308 )和磷酸-Akt (Ser473 )。将过氧 化物酶缀合的抗山羊(DAK0，丹麦)和抗-兔子(Amersham Pharmacia Biotech, UK )免疫球蛋白用作二抗。为了显影，我们使用了 SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce, Perbio, USA)。实施例10DSP与烟碱的比较DSP含有0. 11mg/L烟碱，因此将该浓度用于检查在DSP诱导的血 管舒张的降低中烟碱是否是关键物质。与烟碱相比较，DSP在降低Ach-诱导的扩张中具有显著更强烈的效果。然而，与DMSO(对照)相比较， 烟碱没有产生任何显著的血管扩张的降低(
图1)。
权利要求
1.评价脂溶性烟雾颗粒对血管或细支气管中的平滑肌细胞的影响的方法，包括步骤a.提供来自动物的细支气管或血管，b.将所述细支气管或血管暴露于脂溶性烟雾颗粒，c.在解剖所述细支气管之前诱导一种或多种介导紧张性的受体的上调，d.将所述解剖的细支气管浸入介质中并对所述细支气管或血管施加张力，e.测定所述解剖的细支气管或血管的收缩应答，和f.评价脂溶性烟雾颗粒对血管或细支气管中的平滑肌细胞的影响。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述脂溶性烟雾颗粒来自烟草烟雾。
3. 根据权利要求1或2任一项的方法，其中受体选自内皮缩血管 肽、血管紧张素、5-羟色胺和緩激肽。
4. 根据之前任一项权利要求的方法，其中该方法包括另外两个步 骤，在步骤d)和e )之间加入生物活性剂的第一个步骤和获得能够降 低烟雾对血管或细支气管中的平滑肌细胞的影响的生物活性剂的第二 个最终步骤。
5. 根据之前任一项权利要求的方法，其中生物活性剂是激酶抑制剂。
6. 根据之前任一项权利要求的方法，其中细支气管或血管选自大 鼠，小鼠，豚鼠，狗，猫，马或其合成形式。
7. 根据之前任一项权利要求的方法，其中该方法包括一个或多个 另外的步骤从所述解剖的细支气管或血管获得一片样品。
8. 根据权利要求7的方法，其中在所述样品片中在mRNA水平测 定所述受体的表达。
9. 通过根据任一项权利要求的方法获得的生物活性剂。
10. 根据权利要求9的生物活性剂的用途，用于治疗涉及细支气 管或血管收缩的病症，例如在慢性阻塞性肺病或细支气管哮喘之后。
全文摘要
本发明涉及评价烟雾对血管或细支气管中的平滑肌细胞的影响以及鉴定生物活性剂的方法，该活性剂能够降低烟雾对细支气管或血管的影响。
文档编号G01N33/50GK101223443SQ200680024948
公开日2008年7月16日 申请日期2006年7月7日 优先权日2005年7月8日
发明者L·埃德温松, 徐仓宝 申请人:普罗纳斯制药股份公司