专利名称：一种用于dna与蛋白质相互作用研究的新技术方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学研究领域，特别是指在DNA结合蛋白与相关生物探针相互作用研究实验技术创新。在细胞的生命活动过程中，DNA的复制与重组、RNA的转录与修饰，以及病毒的感染与增殖等等，都 是涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白质结合因子之间的相互作用。因此，长期以来人们就一直关注DNA结 合蛋白的研究。尤其是在重组DNA技术发展以来，已经相继分离到了大量具有生物学意义的基因，在这一 背景支撑下，人们开始探索揭示外环境因子及发育信号是如何影响或调控基因的转录活性这一类课题。凝 胶阻滞试验(gel retardation assay)是用于研究DNA或RNA与蛋白质相互作用的重要实验技术之一。在 凝胶实验中，传统的方法是用放射性同位素或其他生物素标记待检测的DNA片段(又称探针DNA， probe) 然后与细胞蛋白质提取物一道温育，于是便形成了 DNA蛋白质复合物。将其移入非变性的聚丙酰胺凝胶中， 控制蛋白质与探针保持结合状态，电泳。最后借助放射性自显影技术(或其它适当技术)显现DNA条带位 置。如果细胞蛋白质中不存在与探针结合的蛋白质，那么，所有DNA条带都将集中出现在凝胶底部；反之， 将会形成DM-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的的探针-蛋白质复合物条带就将滞后出现在 较靠后位置。凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞提取物中是否存在着能够同某一特定咖A片 段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，用来研究此种结合作用的DNA序列的特异性，而且还可 以用于捕捉在特定条件干预下，双方结合的变化及外界干预对其变化的影响等生物信息。不过，传统的试验方案中常常因为DNA探针需要标记而使实验过程变得比较繁琐，同时，也存在某种 程度的放射性核素污染和伤害。本发明提出了一种新技术方案，其目地是要克服传统方法的上述缺陷。为了弥补传统技术的上述不足，本发明提出了如下技术方案细胞蛋白质提取物先和相应抗体分子结 合为复合物，之后再与裸探针(null probe)结合,形成抗体-蛋白-裸探针三联复合物，再后将其移入非 变性的聚丙酰胺凝胶中，电泳，最后应用ECL法于暗室中发光检测。本发明方案虽然没有使用放射性核素或其它生物素标记探针，却同样捕捉到研究目地特异蛋白结合情 况的必要生物信息，达到了实验目的。由于抗体分子的加入使得蛋白质-探针二联复合物的分子量加大， 电泳后，在非变性的聚丙酰胺中形成的条带更加滞后，从而更加突出的显现了相关蛋白质结合的特异性。 这种方法同样可以用于鉴定未知蛋白，如加入蛋白无明显滞后的条带出现，说明该蛋白与抗体无关，反之, 亦然。本发明方法对疾病诊断和生物医学领域研究有重要实际意义。本发明技术方案是通过如下技术操作实现的。 1.试剂配制(1) Tris-SDS-甘氨酸电泳缓冲液背景技术发明内容3.03 g 1 g18.77 gTris base 5.8 gSDS0.37 g甘氨酸 2.98 g甲醇200 ml先用ddftO溶解甘氨酸，Tris base和SDS，然后加入200nd甲醇，最后定容至1000ml, (3) 5 XBanding Buffer20%甘油5mMMgCl22.5 mMEDTA2.5 mMDTT250.0 mMNaCl50 mMTris-HCL0.25vg/vlPolyDI-DC(4) TBS配制l咖l/LTris-HCLph7.5 10ml NaCL 8.8g 用ddH20定容至1000ml,配TBST时，每100ml TBS加入0.24ml的20%的Tween20混匀后4。C保存c(5) Strippingbufer二巯基乙醇 700 vlTris (PH6.8) 12.5 ml10% SDS 20ml 去离子水 66.8ml 总体积100ml洗膜过程50t:摇床30min。 PBS洗5min。在用ddFfeO洗膜5min。 洗膜前注意要将用过的膜于TBST中浸泡至少30min。摇床速度要温柔。2.电泳 (1)灌胶10%分离胶ddH20 4.0 ml30%Acr-Bis 3.3mlpH 8.8 Tris-HCL 2.5 ml10% SDS 0.1ml10%AP 0.1mlTEMED 0.01ml 室温下聚合50min或4t:过夜，胶聚合好后在电泳缓冲夜(Tris—SDS—甘氨酸)条件下以200V电压 预电泳30min。(2)上样体系15 vl核蛋白:DNA-lO:l5X结合缓冲液 3vl核蛋白 40 vgDNA 4 vgPolyDI-DC lvlddH20 Xvl于37度条件下抚育20—30min。孵育后加入3 vl的SDS上样缓冲液，200v条件下跑电泳。待目的蛋 白跑至胶的2/3时停止电泳。3.转膜及抗体结合3.1用转移缓冲液(Tris—SDS—甘氨酸-甲醇)转膜，转膜前将胶。滤纸和准备好的膜(都要剪成同 等大小)于转移缓冲液中浸泡5min。3.2转膜条件为100mA ， 1.5h。转膜产热，注意在冰室中进行效果更加。 3.3 5%的脱脂奶粉封闭过夜，于4t中。3.4—定比例稀释一抗，室温下孵育lh用TBST洗3次，每次5min^最后用TBS洗l次，时间5min。 然后染适当比例稀释的二抗，室温孵育50min，用TBST洗3次，每次5min^最后用TBS洗1次，时间5min。 然后采用ECL法于暗室内发光检测。如果觉得背景高可以用Stripping buffer洗膜，重新封闭染抗体，效果更加。实施例l，下面介绍的是在一个经过放射线千预后，以P53的5'端非翻译区的DNA片段和Nucleolin 核蛋白的结合情况研究，使用本发明之技术方案，达到了预期的实验目地。1. 材料与方法 1.1仪器和试剂l丄l细胞株MCF7人乳腺癌细胞株由基础免疫实验室获得。 l丄2照射仪器国产X.S.S.205(FZ)型固定式X射线深部治疗机。 l丄3试剂配制(1) Tris-SDS-甘氨酸电泳缓冲液(2) Tris-SDS-甘氨酸一甲醇转移缓冲液(3) 5XBanding Buffer (Glycerol, MgCl2, EDTA， DTT , NaCl, Tris-HCL， PolyDI-DC) 1.2实验部分1.2.1目的DNA片段的获取根据p53 tumor suppressormRNA序列设计p53基因的PCR引物(由联星生物公司合成IOD,OPC级。) 上游引物Sense:5 ' -AAGGATCCTCTAGAGCCACCGTCCAG-3 '下游引物Antisense:5 ' GGGAATTCCTCCTCCATGGCAGTGAC-3'利用PCR扩增目的片段。连入PCDNA3.1载体后拿去测序。 测序正确后转化、大提质粒。然后酶切电泳。切胶回收目的片段，定量备用。1.2.2胞核蛋白的提取(1) 4Gy X射线照射MCF7细胞后，分别于2h、 4h、 8h、 16h、 24h、 48h。收取细胞，用凯基胞浆胞 核蛋白提取试剂盒提取胞核蛋白。(2) 不同剂量X射线照射MCF7细胞4小时后，收取细胞，用凯基胞浆胞核蛋白提取试剂盒提取胞核蛋白。(3) 考马斯亮兰法蛋白定量。蛋白保存一70'C备用。 1.2.4电泳灌胶10%分离胶(ddH20 4ml, 30%Acr-Bis3.3ml， pH 8.8 Tris-HCL 2.5 ml, 10% SDS 0.1ml, 10 %AP0.1ml， TEMED0.01ml)室温下聚合，时间尽量长。胶聚合好后在电泳缓冲液(Tris—SDS—甘氨酸) 条件下以200V电压预电泳20—30min。上样体系15 vl:核蛋白:DNA-10:1(5X结合缓冲液3vl，核蛋白 40vg，蛋白4vg， Poly DI-DC 1 vl, ddH20 Xvl)。于37度条件下抚育20—30min。孵育后加入适量上样 缓冲液，200v条件下跑电泳。待目的蛋白跑至胶的2/3时停止电泳。1.2.5转膜及抗体结合用转移缓冲液(Tris—SDS—甘氨酸一甲醇)转膜，条件为100mA ， 1.5h。 5%的脱脂奶粉封闭过夜， 一定比例稀释一抗和二抗，然后采用ECL法于暗室内发光检测。2. 实验结果2.1 X射线照射MCF7细胞后Nucleolin蛋白的DNA结合活性的时程变化采用蛋白滞后实验方法检测了 4Gy X射线照射MCF7细胞后，核内nucleolin蛋白同P53基因5'端非 翻译区DNA片段结合活性的时程变化，附图
l.为强度4 Gy的X射线照射MCF7细胞后Nucleolin蛋白的 DNA结合活性的时程变化电泳结果示意图，附图2.为强度4 Gy的X射线照射MCF7细胞后Nucleolin蛋 白的DNA结合活性的时程变化结果的线形示意图，从附图l.、表l和附图2.可见4GyX射线照射后和假 照组(附图l.中C组)相比2h, 4h， 8h和16h结合活性下降，4h结合活性最弱提示nucleolin对p53的控制减小。表1. 4Gy X射线照射MCF7细胞后Nucleolin蛋白的DNA结合活性的时程变化分组假照射组248162448丝A 口 未结合 结合/未结合2.53 0.76 3.332.47 0.85 2.912.59 0.91 2.851.07 0.81 1.321.89 0.93 2.031.76 0.97 1.811.98 1.01 1.962.2照射MCF7细胞后Nucleolin蛋白的DNA结合活性的量效变化采用蛋白滞后实验方法检测了不同剂量X射线照射MCF7细胞4h后核内nucleolin蛋白同p53基因5' 端非翻译区DNA片段结合活性的量效变化,附图3.为时间4h不同强度X射线照射MCF7细胞后对Nucleolin 蛋白的DNA结合活性的量效变化的电泳结果示意图，附图4.为时间4h不同强度X射线照射MCF7细胞 后对Nucleolin蛋白的DNA结合活性的量效变化的条形示意图，从附图3.、表2.和附图4可见4h量效实 验显示不同剂量照射后和假照组相比随着剂量增加而结合活性减弱。提示随着剂量增加nucleolin对p53 的控制减弱。表2.不同剂量X-射线照射MCF7细胞4小时后Nucleolin蛋白的DNA结合活性的量效变化分组假照射组0.5124结合 *娃厶 木5q 口 结合/未结合2.38 0.68 3.502.26 0.76 2.972.41 0.85 2.842.25 0.73 3.082.45 0.73 2.95(全文止)
权利要求
1. 一种用于生物医学检验、诊断、研究的技术方案，它的技术特征是先将细胞蛋白质提取物与相应抗体分子结合为复合物，之后再与裸探针(null probe)结合,形成抗体-蛋白-裸探针三联复合物，将其移 入非变性的聚丙酰胺凝胶中，电泳，最后应用ECL法于暗室中发光检测。
全文摘要
本发明涉及一种用于生物学、医学检验、诊断和研究的新技术方案，其技术特征是将细胞蛋白质提取物先于相应抗体分子结合为复合物，之后再与裸探针(null probe)结合，形成抗体-蛋白-裸探针三联复合物，同样将其移入非变性的聚丙酰胺凝胶中，电泳，最后应用ECL法于暗室中发光检测。与传统方法比较，本技术操作简便、可靠、无放射性核素污染。
文档编号G01N33/68GK101144821SQ20071005555
公开日2008年3月19日 申请日期2007年4月23日 优先权日2007年4月23日
发明者刘晓东, 李文兴, 赵银龙 申请人:吉林大学