专利名称：：用表面等离子体子共振传感器研究药物与生物分子相互作用的方法
技术领域：
：本发明属于用波长检测型表面等离子体子共振(Surfaceplasmonresonance,SPR)传感器研究药物与生物分子相互作用的方法领域，特别涉及本课题组研制的波长检测型SPR分析仪及其应用方法。技术背景自从Liedberg等将SPR技术用于化学和生物传感器研究领域以来，SPR传感器逐渐成为国际传感器领域的研究热点。近年来在分子水平上进行功能研究的技术大量涌现，其中SPR技术比较引人注目。尤其自上世纪九十年代Pharmacia公司(现为BIAcoreAB公司)将这一技术商品化以来，SPR技术用于生物分子相互作用的研究取得了迅猛的发展。短短几年内，运用此新技术所发表的文献几乎包括了现代生物医学的各个领域，使分子相互作用的研究取得了前所未有的突破，进而全面推动了生命科学研究的各个领域的进展。由于SPR技术具有能实时监测反应动态过程、样品无需标记、灵敏度较高、无背景干扰等特点，主要应用于研究大分子之间的相互作用，可得到反应物分子之间每一步的键合信息，测定动力学常数，已在生物科学领域应用中取得了长足进展。据粗略的统计，在生物传感器领域发表的文章中，大约有70%报道了关于SPR传感器被应用到对生物分子间反应的检测。已报道的各类SPR商品仪器都是采用固定波长，测定共振角度变化的工作模式，这种工作模式，或者需要有一个机械传动装置来改变入射光角度，或者需要通过点光源的发散作用，测定角度的变化。前者在仪器中有一个可动部件，后者测量的角度范围较小，限制了方法的应用。这类市售的棱镜型SPR传感器仪器价格昂贵，不宜普及。自行设计组装的波长检测型SPR分析仪容易实现多波长同时检测，且检测的波长范围不受限制，这样不仅使传感器表面被检测物质量的范围不受限制，即折射率变化的范围不受限制，而且非常有益于分子间或分子与组织(如细胞)间相互作用的研究；其次，由于现在用于波长选择的器件比较成熟，且有的器件具有很高的波长分辨能力，所以有望进一步提高SPR分析仪的灵敏度。本仪器特别适于分子间相互作用的研究，对于研究药物与生物分子的作用、药物筛选及药物化学的发展具有重要意义，且对SPR传感器方法、仪器装置的发展及应用也具有重要意义。传统的药物与蛋白质结合的研究方法有平衡透析法和超滤法。其中平衡透析法为经典的参比方法，由于需建立结合平衡，运用此法耗时长(几个小时或几天)。超滤法则由于常需进行放射性或荧光标记而带来很大不便。这两种方法均存在膜对药物的吸附，以及Donnan效应(由于蛋白和药物均带电荷，使得膜两侧的游离药物浓度不相等)等问题，对于高结合率药物的游离药物浓度难以准确检测。其他方法还有免疫分析法，液相色谱法，荧光淬灭法和毛细管电泳法。其中免疫分析法耗时长，而且只能用于定性、半定量，无法满足深层次药物与蛋白质结合研究的要求；液相色谱法不仅需要样品量大、柱吸附严重，且常需添加改良溶剂，不能准确评价生理条件下的药物与蛋白质结合作用；当药物与白蛋白结合的位点远离色氨酸时，此时应用荧光淬灭法就不能检测到药物与蛋白的结合；毛细管电泳法最主要的缺点是它的灵敏度不高。近年来，SPR已经广泛应用于药物一蛋白的结合研究。将一系列药物作用在已固定的蛋白上，根据药物与蛋白作用的SPR信号强度来确定药物与蛋白的结合情况。在SPR的应用中，一般要求作敏感膜的分子一端为可与金或银键合的活性基团，而其另一端为具有分子识别功能的活性基团。巯基丙酸的巯基端可与金膜连接，另一末端的羧基可作为活性基团，用其连接抗体分子，结果良好。
发明内容本发明的目的是采用波K:检测型SPR传感器，研究药物分子与生物分于的相互作用。本发明通过以下技术方案来加以实现采用波长检测型SPR传感器，研究药物分子与生物分子相互作用的方法，涉及下列步骤1.釆用本课题组研制的波长检测型SPR分析仪由光源l、导光系统2，3，4,10，11、传感元件5，6、流通池7，8，9、分光检测系统12和数据处理系统组成；2.传感器的制备采用下列步骤在波长检测型SPR分析仪中，选用玻璃棱镜5作为传感器的传感元件；采用真空镀膜法，在棱镜5的传感面镀约50nm厚的金或银膜，作为传感器的传感膜6;3.在传感膜6底部的流通池7中注入巯基丙酸(MPA)溶液，待MPA在金膜表面自组装完成后，将磷酸盐(PBS)缓冲溶液注入到流通池7中反复冲洗，以清除传感器表面的非特异性结合；4.待共振波长不再变化后，向流通池7中注入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)隱carbodimidehydrochloride,C8H17N3'HC1，分子量为191.7，简称EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，C4H5N03，分子量为115.1，简称NHS)溶液，观察SPR光谱随时间的变化，当共振波长基本稳定时，用PBS缓冲溶液反复冲洗传感器表面至共振波长不再发生变化；5.注入血清白蛋白溶液，记录共振波长随时间的变化情况，当血清白蛋白形成稳定的单分子层后，共振波长稳定时，此时将PBS缓冲溶液注入到流通池7中反复冲洗至共振波长不再发生变化；6.将药物分别用PBS缓冲溶液稀释为n个不同浓度，依次注入到流通池7，记录共振波长随时间的变化。每个样品监测完毕后，均注入PBS缓冲溶液冲洗流通池7。7.通过药物的浓度[D]、波长变化A入、波长变化的响应信号AXmax,，通过以下方程(1)可计算出反映药物分子与生物分子相互作用的结合速率常数ka和解离速率常数kd。dA入/dt=ka[D](Almax—AX)—kdA人(1)本发明还可以在MPA自组装完毕后，引入用以提高传感器灵敏度的金纳米粒子。本发明还可以在MPA自组装完毕后，引入用以提高传感器灵敏度的一层或多层除血清白蛋白之外的蛋白，构成三明治夹心式传感器。本发明所采用的仪器由光源、导光系统(透镜、偏振片、光纤)、传感元件(玻璃棱镜、传感膜)、流通池、分光检测系统(CCD检测器)和数据处理系统组成用卤钨灯或发光二极管作为光源，从光源发出的白色光经过平行偏振光管(由二个透镜和一个偏振片组成)后变成平行偏振光，以一定的角度照射到棱镜的侧面上，经折射后光线到达棱镜的底部。采用真空镀膜法，在棱镜的传感面镀约50nm厚的金或银膜，采用分子自组装法在金属膜表面涂一层对待测物有特异结合能力的分子，组成敏感膜，光线在棱镜与金属的界面处发生全内反射，然后从棱镜的另一个侧面折射出去，通过下一个透镜聚焦耦合进入光导纤维，由光纤将信号光再传输至光栅和电荷耦合器件(CCD)检测器，当溶液中含有待测物及待测物浓度改变时，共振波长有明显变化，据此对待测物进行研究。实验方法是将传感器固定在流通池口上面，流动注射进样，当试样通过流通池时传感器镀膜一面与被分析试液接触，复色光通过偏振片及透镜后照射在棱镜上，发生共振，产生强烈的共振吸收，通过绘制反射光强度随波长的变化曲线，对被测物质进行研究。本发明研究的药物分子和生物分子相互作用的结合速率常数ka和解离速率常数kd的计算方法如下前述方程(1)中AX是共振波长的变化，即SPR的信号，其代表了传感器表面血清白蛋白(P)和药物(D)的浓度。dA入/dt是SPR信号的变化速率。A入max是传感器表面结合药物饱和时的响应信号，即相当于传感器表面形成的PD复合物的最大浓度。方程(1)的积分形式为AX={ka[D]A、ax/(ka[D]+kd)}{1-exp(-([D]ka+kd)t)(2)解离过程可用下列方程表示d扁t--kaA入(3)它的积分形式为InAVA入c^-kd(t-10)(4)式中t。是反应开始的时间，其所对应的SPR信号为AX。，而A人是任何时刻t的SPR信号。根据实验数据和方程(1)—(4),可求出动力学数据ka，kd和热力学数据结合常数KA和解离常数Ko。图1为波长检测型SPR分析仪的结构示意图；1为光源，2、3和10为透镜，4为偏振片，5为玻璃棱镜，6为传感膜，7为流通池，8为进样口，9为排废口，ll为光纤，12为CCD检测器。图2为流通池结构示意图；5为玻璃棱镜，6为传感膜，7为流通池，8为进样口，9为排废口，13为水浴，14为水浴入水口，15为水浴出水口。图3为传感器连接示意图，也是摘要附图；6为传感膜，16为玻璃基底(棱镜底面)，17为巯基丙酸和NHS、EDC修饰层，18为血清白蛋白层，19为药物分子连接层。图4为不含MPA及含有MPA溶液引入样品池时得到的SPR光谱；20为不含MPA时得到的SPR光谱；21为含有MPA时得到的SPR光谱。具体实施方式实施例l:抗生素类药物与人血清白蛋白相互作用的研究抗生素又称抗菌素。是由一些微生物合成的、能抑制或杀灭某些病原体的化学物质。抗生素是微生物的一种次生代谢产物，少量低浓度使用时能对另一种微生物的生长和代谢起抑制或杀灭作用。现已发现400多种抗生素，各种抗生素的抗菌机理和作用各不相同。如青霉素和杆菌肽能阻碍细菌细胞壁的合成；多肽类抗菌素可破坏细菌的质膜；氯霉素、链霉素等可抑制蛋白质的合成或干扰核酸的合成等。有的抗菌素作用范围小，如青霉素只对革兰氏阳性细菌有效，叫做狭谱抗菌素。有些抗生素作用范围较广，如四环素对多数细菌均有抑制作用，称做广谱性抗生素。目前广泛应用的抗生素约IOO多种，如青霉素、链霉素、庆大霉素等都普遍用于医疗。在农业上春雷霉素、井岗霉素已广泛用于水稻病菌的防治，灭瘟素用T防治稻瘟病，赤霉素用于促进植物的生长等等。但在使用抗生素时要针对病症、不可乱用。有的抗生素能产生一些副作用，如连续使用链霉素、庆大霉素都会引起耳聋，服用过量的氯霉素可造成白细胞减少等。也有些人对某种抗生素有过敏反应，严重时甚至有致命危险。本发明应用自行设计并组装的波长检测型SPR分析仪，釆用氨基耦联的方法将血清白蛋白固定在传感器表面，研究了青霉素VK,苯唑西林，阿莫西林，头孢哌酮，头孢噻肟钠，依诺沙星，诺氟沙星七种抗生素药物与人血清白蛋白(HSA)的相互作用。测定了反应的动力学常数及平衡常数，同时计算了它们的键合百分率。1.仪器采用本课题组研制的波长检测型SPR分析仪；试剂3—巯基丙酸(MPA)，NHS，EDC青霉素VK，苯唑西林，阿莫西林，头孢哌酮，头孢噻肟钠，依诺沙星，诺氟沙星标准品人血清白蛋白、牛血清白蛋白其它所有试剂均为国产分析纯试剂2.传感器的制备采用下列步骤在波长检测型SPR分析仪中，选用直角玻璃棱镜的底面作为传感器的传感元件；采用真空镀膜法，在棱镜的传感面镀约50nm厚的金或银膜，作为传感器的传感膜；3.将样品池中注入PBS缓冲溶液，记录共振波长，将10mmol/L的MPA溶液注入样品池中，通过观测SPR共振波长的位移，从而监测MPA与金结合的动力学过程。图4为不含MPA及含有MPA溶液引入样品池时得到的SPR光谱。将含有MPA的溶液注入样品池后，随着时间的推移，共振波长不断向长波方向移动，且在开始的几分钟内组装较为迅速。在5min内，SPR光谱共振波长位移值达总量的99%，30min左右组装基本完全，共振波长的最大位移值为11.67nm。用PBS缓冲溶液冲洗传感器表面至共振波长基本不再变化，说明MPA的巯基端与金形成的S-Au键很稳定。4.向流通池中加入浓度均为40mg/mL的EDC和NHS混合溶液，EDC可催化MPA和NHS的反应，使MPA的羧基端酰化，以利于血清白蛋白的连接。5.在MPA修饰膜组装完全后，用PBS缓冲液反复冲洗传感器表面，以清除特异性吸附。然后将血淸白蛋白注入样品池。因MPA的羧基端酰化后对血清白蛋白Fc段能特异性结合，可使血淸白蛋白在敏感膜上定向自组装。实验考察/人血清白蛋白(HSA)浓度对其在MPA上进行定向自组装的影响。将HSA配制成浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL的溶液，不同浓度的HSA在MPA上自组装的结果(12h)见表l。综合考虑，选择HSA的浓度为0.1mg/mL。表l不同浓度的HSA在MPA上自组装的结果(12h)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>6.当血清白蛋白存:敏感膜上自组装成稳定的分子膜后，用PBS缓冲液反复冲洗流通池，待共振波长不再改变时，向流通池中依次注入不同浓度的青霉素VK,苯唑两林，阿莫西林，头孢哌酮，头孢噻肟钠，依诺沙星或诺氟沙星(均用PBS配制)，实时监测并记录SPR光谱的共振波长位移值，测定时间为30min。7.根据监测所得数据，经过分析并计算，可得到这些药物与HSA以及BSA之间键合的动力学常数、热力学常数及键合百分率(见表2)。表2药物与HSA之间键合的热力学常数及键合百分率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>这7种抗生素类药物与HSA都有不同程度的结合，药物与《八的键合百分率范围是91.2—41.1%,它们的键合能力的顺序为，青霉素vio头抱哌酮〉头孢噻肟钠>苯唑西林>阿莫西林>依诺沙星>诺氟沙星。实施例2:蒽醌类药物与人血清白蛋白相互作用的研究大黄是我国的四大中药之一，始载于《神农本草经》。我国大黄的产量占世界第一位，并且质量最优。4600年前我国已开始应用大黄。目前已有十九个国家药典收载了大黄作为法定药物使用。人黄主要含蒽醌类衍生物，其含量为35%，一部分为游离状态，如人黄酸、大黄酚、大黄素、芦荟大黄素等；大部分为结合状态，其中属蒽醌甙类的有大黄酸、葡萄糖甙、大黄酚葡萄糖甙等。具有泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经的功能。用于实热便秘、积滞腹痛、泻痢不爽，湿热黄疸、血热吐衄、目赤、咽肿、肠痈腹痛、痈肿疔疮、瘀血经闭、跌打损伤等病症。现代临床可用于治疗流行性脑膜炎、大叶性肺炎、急性胆道感染、急性腮腺炎、急性阑尾炎、急性传染性黄疸型肝炎、急性肠炎、细菌性痢疾、消化道出血、咽喉炎、牙龈脓肿、皮炎、湿疹、淋病、带状疱疹等。研究蒽醌类药物与血清白蛋白的相互作用的有荧光光谱法、紫外光谱法。本发明应用自行设计并组装的波长检测型SPR分析仪，以3—巯基丙酸(MPA)作为固定HSA的连接层，研究了大黄中的主要成分大黄素、大黄酚、及大黄素甲醚与HSA的相互作用，并分别计算了它们的动力学常数、热力学常数及键合百分率。方法同实施例l。结果见表3。表3葱醌类药物与HSA的结合的动力学常数、热力学常数及结合百分率药物分子量结合速率常数解离速率常数解离常数么上a￡n口百分率大黄素270.232息1(^4.09x10"196,4677.43大黄酚244.234.43x101306.7568.69大黄素甲醚284.004.56x1019.71x10-321375.94实施例3:人参皂甙与血清A蛋白相互作用的研究人参，俗称"棒槌"，属五加科多年生草本植物，是我国重要特产之一，也是驰名中外的珍贵药材，被人们称为"百草之王"，属东北"三宝"之一。人参根、茎、叶、花及果实富含多种人参皂甙，此外人参根含挥发油0.12%，茎叶含挥发油0.13%,花含挥发油0.29%。人参根的非极性部分含人参炔醇、a—人参萜、卜人参萜以及甾醇化合物。人参还含有赖氨酸、组氨酸、精氨酸等多种氨基酸、维生素、多种有机酸、黄酮类化合物以及糖。经过中医多年的临床实验，人参能够补血养气、固津生液、调节神经、开心明目、益智安神、降低血糖、健胃、利尿等；对T治疗久病衰弱的患者，非常有效。主治神经衰弱症、各种神经病、植物性神经病失调、性神经衰弱、智力减退、贫血、糖尿病、胃病、肝病，以及心血管系统的疾病等。此外，适量久服，还可以使人增加对各种致病因子的抵抗力，对人体并不产生任何副作用和损害。人参的大部分年药理作用是由人参皂甙来决定的。迄今已分离到人参皂苷单体有40余种，它对人体的一些组织结构有很大的影响可以保护神经细胞免受一些有害化合物的侵害；可通过降低神经传导素来调节神经传输；在药物诱导睡眠方面起着很大的作用；还可通过不同的机理对癌细胞产生影响，抑制癌细胞的生长，或转移癌细胞素。本发明应用自行设计并组装的波长检测型SPR分析仪，以3—巯基丙酸(MPA)作为固定血清白蛋白的连接层，研究了6种人参皂甙单体(Rbl,Rb2,Rb3，Rc，Rd,Re)分别与人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。分别计算了它们的动力学常数、热力学常数及键合百分率，并比较了不同人参皂甙单体与血清白蛋白的键合能力。方法同实施例l。结果见表4。表4人参皂武与HSA和BSA结合的动力学常数、热力学常数及结合百分率蛋白人参皂甙分子里结合速率常数解离速率常数解离常数结合百分率HSARb,11104.74x1012.31xl0-348.71±3.093.19±0.9Rb210782.26xl039.18xl(T240.62±2.994.37±0.7Rb3翻2.35xl022.35xlO-2100.0±18.088.33±2.3Rc10783.13xl029.71xl0-331.00±2.595.58±0.5Rd9463.50xl022.84xl0-281.23±15.089.23±2.0Re9461.14xl032.31xl0-220.32±1.997.10±0.4BSARb,11106.27xl022.84xl0—245.26±2.993.71±0.8Rb2顧1.63xl047.37x10-345.26±3.193.71±1.0Rb310783.33xl026,76xl0-320.31±1.797.10±0.3Rc10789.40x102.91x10-2309.6±26.068.47±4.8Rd9466,59x109.71xlO-3147.3±23.082.05士4.5Re9461.67xl021.36xl(T281.23±13.089.23±1.8权利要求1.用表面等离子体子共振传感器研究药物与生物分子相互作用的方法，其特征在于采用下列步骤(1)采用本课题组研制的波长检测型SPR分析仪由光源(1)、导光系统(2，3，4，10，11)、传感元件(5，6)、流通池(7，8，9)、分光检测系统(12)和数据处理系统组成；(2)传感器的制备采用下列步骤在波长检测型SPR分析仪中，选用玻璃棱镜(5)作为传感器的传感元件；采用真空镀膜法，在棱镜(5)的传感面镀约50nm厚的金或银膜，作为传感器的传感膜(6)；(3)在传感膜(6)底部的流通池(7)中注入巯基丙酸(MPA)溶液，待MPA在金膜表面自组装完成后，将磷酸盐(PBS)缓冲溶液注入到流通池(7)中反复冲洗，以清除传感器表面的非特异性结合；(4)待共振波长不再变化后，向流通池(7)中注入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodimidehydrochloride，C8H17N3·HCl，分子量为191.7，简称EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，C4H5NO3，分子量为115.1，简称NHS)溶液，观察SPR光谱随时间的变化，当共振波长基本稳定时，用PBS缓冲溶液反复冲洗传感器表面至共振波长不再发生变化；(5)注入血清白蛋白溶液，记录共振波长随时间的变化情况，当血清白蛋白形成稳定的单分子层后，共振波长稳定时，此时将PBS缓冲溶液注入到流通池(7)中反复冲洗至共振波长不再发生变化；(6)将药物分别用PBS缓冲溶液稀释为n个不同浓度，依次注入到流通池(7)，记录共振波长随时间的变化，每个样品监测完毕后，均注入PBS缓冲溶液冲洗流通池(7)。(7)通过药物的浓度[D]、波长变化Δλ、波长变化的响应信号Δλmax，，通过以下方程(1)可计算出反映药物分子与生物分子相互作用的结合速率常数ka和解离速率常数kd。dΔλ/dt＝ka[D](Δλmax-Δλ)-kdΔλ(1)。2.根据权利要求1的方法，其特征在于MPA自组装完毕后，引入用以提高传感器灵敏度的金纳米粒子。3.根据权利要求l的方法，其特征在于MPA自组装完毕后，引入用以提高传感器灵敏度的一层或多层除血清白蛋白之外的蛋白，构成三明治夹心式传感器。全文摘要本发明属于用波长检测型表面等离子体子共振传感器研究药物与生物分子相互作用的方法领域。采用波长检测型SPR分析仪，选用玻璃棱镜作为传感器的传感元件，采用真空镀膜法，在棱镜的传感面镀约50nm厚的金或银膜，在传感膜底部的流通池中依次注入巯基丙酸(MPA)溶液，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)溶液，血清白蛋白溶液，当共振波长基本稳定时，用PBS缓冲溶液反复冲洗传感器表面至共振波长不再发生变化；将药物分别用PBS缓冲溶液稀释为n个不同浓度，依次注入到流通池，记录共振波长随时间的变化。通过计算，可以得到药物分子与蛋白分子相互作用的动力学常数、热力学常数以及结合百分率。文档编号G01N21/55GK101271066SQ20071005542公开日2008年9月24日申请日期2007年3月19日优先权日2007年3月19日发明者霞刘,颖孙,宋大千,张寒琦,曹彦波,媛田申请人:吉林大学