流式细胞术的自动分类方法和装置的制作方法

专利名称：流式细胞术的自动分类方法和装置的制作方法
流式细胞术的自动分类方法和装置技术领域：
本发明涉及粒子的分类统计方法和装置，尤其适用于流式细胞术的自 动分类统计方法和装置。背景技术：
流式细胞仪以及基于流式细胞术的血液分析仪、尿液分析仪以及粒子 分析仪等都是通过收集和分析粒子的二维或多维数据的方法来识别液体中 的不同粒子以将它们分成不同的类别。如图1所示，在流式细胞仪中，细胞或粒子102的悬液在鞘液的包裹之下逐个通过一个光照区域，在光照区 域中粒子102受到激光101的照射而产生不同的光信号，如前向散射信号 FSC 104、侧向散射信号SSC 106以及多路的荧光信号FL等，例如图中107 是绿色萤光FLl, 108是黄色荧光FL2， 109是红色荧光FL3，聚光透镜103 将这些光信号汇聚，光电二极管105收集前向散射光104，通过戴铜滤波 片lll、 113、 114和光电倍增管110、 112、 115分别收集绿色萤光107、 黄色荧光108和红色荧光109。分析系统将检测器(通常是PMT或者PD) 收集来的这些信号生成二维或者三维的散点图，在散点图上划分多个区域， 细胞或者粒子的多参数信号落在同一个区域的那些粒子被归为同一类，并 统计落在这些类别内的粒子数目和百分比，用以分析被测样本的统计特性， 见图2。传统的方法是在散点图上用固定边界进行分类，但是固定边界只 能体现大部分正常样本特征，其缺点是不能针对不同的样本进行边界调整, 那么当某些样本的粒子信号特征显著不同于固定边界所表达的特征时就会 出现较大误差。例如US. Pat. No. 4987086揭露了一种在前向散射光vs. 侧向散射光所形成的散点图上通过"设门"的方式从全血细胞中区分粒细 胞、单核细胞和淋巴细胞的方法，所谓"设门"其实就是在散点图上划分 出边界，落在某边界内部的细胞被认为是同一类细胞。US. Pat. No. 4727020、 4704891、 4599307、 4987086和6014904都揭露了一些用设门的方式识别和分类计数血液样本中的细胞的方法。用事先划分好的边界可以在散点图上生成不同的区域代表着不同的粒 子类别，然而这些离散的区域可能会有些重叠，那些落在重叠区域的粒子可能就会被错误的识别分类。U.S. Pat. No. 5627040用一种"重心引力 因子(gravitational attractor)"的方法解决了此问题。这种方法用尺 寸、形状和方位固定而位置不固定的边界在散点图上进行分类，用一种优 化算法根据每个类的引力因子将这个类的边界位置确定下来。但"重心引力因子(gravitational attractor)"的方法虽然边界的 位置可以自动调整但是尺寸、形状和方位还是固定的。利用这些固定边界 对粒子进行分类尤其是对人的血液细胞进行分类的时候，无法解决样本的 个体差异问题，也就是说这些固定边界只是针对大多数样本的共性而言的， 而人的血液样本会存在一些个体的差异，比如某些人的单核细胞、淋巴细 胞在经过试剂处理之后会比通常人的要大，这个时候如果还用通用的固定 边界来分类的话就会出现误差。当出现个体差异的时候可以通过在散点图上手动重新划边界的方法来 解决，这是一般的流式细胞仪的作法，但这会造成效率下降，对于高度自 动化仪器来说并不适合。US. Pat. No. 6944338揭露了一种自动分类的方 法，用修改后的Koonst and Fukimaga算法寻找二维数据的分界线(二维 数据的波谷)，用这些分界线将落在同一个界限包围中的粒子归为一类，以 此将粒子分成诸多个类别。但是这种方法使用中也存在一定的局限性(1) 散点图上的数据点不连续，非常离散，很多单个点或一小簇点的周围没有 数据，如图3中的区域a，按照此算法会对这些点的周围寻找边界并最终 将它们归为单独的一类，但实际上这些点并不是单独一类而是某个大类的 粒子只不过分散较开而已；(2)即使用bins (即采样格)将数据平滑化也 很难解决上述问题，并且平滑的越厉害(bins取的点越多)，计算出来的 波谷换算到原始数据上出现的偏差越大；(3)此算法对二维散点图上的每 个点都进行一次运算，但是事实上散点图上真正有效的点并不多，有很多 区域并没有数据，如图3中的区域A， 二维的散点图实际上是一个稀疏矩 阵，如果对每个点都进行査找会导致算法效率的下降。
发明内容本发明的主要目的就是为解决以上将粒子分类时容易出现偏差和效 率低的技术问题，提供一种流式细胞术的自动分类方法和装置，将粒子准 确、高效地自动分类。为实现上述目的，本发明提供一种流式细胞术的自动分类方法，包括 以下步骤Al、根据收集的每个细胞或粒子逐个通过光照区域时产生的至少两路光信号，将每个细胞或粒子表征为一个与其各路光信号强度有关的、至少 二维的向量；Bl、计算所有有效细胞或粒子两两之间的距离，且距离越近，两个细 胞或粒子之间的相似程度越高；Cl、将相似程度高的细胞或粒子聚集成同一个类；Dl、重复步骤C1，至少将所有有效细胞或粒子聚集成样本根据测量原 理所应有的类别数L。本发明的进一步改进是在步骤A1之后、步骤B1之前还包括以下步 骤设定阏值，将不符合阈值条件的细胞或粒子的数据删除。本发明的更进一步改进是所述步骤D1中，最后将所有有效细胞或粒子聚集成一个类别。本发明的更进一步改进是在所述步骤Dl之后还包括以下步骤 El、进行聚类效果评价，确定样本真正应有的类别数。 所述步骤E1包括以下步骤Ell、计算从1到L+r的各整数的聚类效果参数，其中L为样本根据 测量原理所应有的类别数，且L为大于或等于1的整数，r为根据经验所 得的大于0的整数；E12、査找出其聚类效果参数为最大的整数q;E13、将步骤E12中査找出的整数q和类别数L进行比较，如果q〉L， 则取该样本的分类数为q;如果L-0〈q《L，则取该样本的分类数为L;如 果q《L-o，则不进行分别，并结束运算。为实现上述目的，本发明还提供一种流式细胞术的自动分类装置，包 括用于根据收集每个细胞或粒子逐个通过光照区域时产生的至少两路光 信号将每个细胞或粒子表征为一个与其各路光信号强度有关的、至少二维 的向量的事件生成单元；用于根据事件生成单元生成的向量计算所有有效 细胞或粒子两两之间的距离的计算单元，且距离越近，两个细胞或粒子之 间的相似程度越高；用于将相似程度高的细胞或粒子聚集成同一个类的聚 类单元，所述聚类单元能够多次聚类，至少将所有有效细胞或粒子聚集成 样本根据测量原理所应有的类别数L。本发明的进一步改进是还包括用于设定阈值，将不符合阈值条件的 数据删除的设门单元。本发明的更进一步改进是所述聚类单元用于最后将所有有效细胞或 粒子聚集成一个类别。本发明的更进一步改进是还包括用于进行聚类效果评价以确定样本 真正应有的类别数的类别评价单元。所述类别评价单元包括用于计算从1到L+r的各整数的聚类效果参 数的第二计算模块，其中L为样本根据测量原理所应有的类别数，且L为 大于或等于1的整数，r为根据经验所得的大于0的整数；用于査找出其聚类效果参数为最大的整数q的第二查找模块；用于将第二查找模块查找 出的整数q和类别数L进行比较的比较模块，所述比较模块用于在q〉L时, 取该样本的分类数为q，在L-0〈q《L时，取该样本的分类数为L，在q《 L-o，不进行分别，并结束运算。为实现上述目的，本发明还提供一种流式细胞术的自动分类统计系 统，包括样本发生装置，所述样本发生装置进一步包括相互连接的气液 传输控制模块和流动室，所述气液传输控制模块用于使含有被测细胞或粒子的样本液被鞘液包裹着通过流动室；光照射装置，用于产生光束以照射 通过流动室的鞘流；检测器，用于收集细胞或粒子逐个通过光照区域时产 生的至少两路光信号；分类统计处理器，用于根据检测器收集的光信号，将每个细胞或粒子表征为一个与其各路光信号强度有关的、至少二维的向 量，计算所有有效细胞或粒子两两之间的距离的计算单元，且距离越近， 两个细胞或粒子之间的相似程度越高，将相似程度高的细胞或粒子聚集成 同一个类，经多次聚类后，至少将所有有效细胞或粒子聚集成样本根据测 量原理所应有的类别数L。本发明的进一步改进是所述分类统计处理器还用于在计算细胞或粒子两两之间的距离之前设定阈值，将不符合阈值条件的数据删除。本发明的更进一步改进是所述分类统计处理器用于最后将所有有效 细胞或粒子聚集成一个类别。本发明的更进一步改进是:所述分类统计处理器还用于计算从1到L+r 的各整数的聚类效果参数，査找出其聚类效果参数为最大的整数q，将査 找出的整数q和类别数L进行比较，在q〉L时，取该样本的分类数为q，在 L-o〈q《L时，取该样本的分类数为L，在q《L-o，不进行分别，并结束运 算，其中L为样本根据测量原理所应有的类别数，且L为大于或等于1的 整数，r为根据经验所得的大于O的整数。本发明的有益效果是1)本发明通过对流过的所有粒子的二维或多 维数据的集合进行分析处理，将某粒子归到某个类中。这种方法是基于数 据分析而不是在图形上(一维直方图或二维散点图)寻找边界，因此可以适用于更多维的数据。由于是对每个被测^^本都进行数据分析和分类计数， 相当于这种自动聚类的方法所产生的分类边界是根据样本的不同而变化 的，所以能够克服在散点图上用固定边界分类所带来的缺陷，即不能针对 被测样本的特异性进行边界调整的缺陷。同时本发明的分类方法只对粒子的数据进行计算，对于没有粒子的地方不计算，所以也克服了Koonstand Fukunaga算法在对不连续的数据进行波谷查找时的缺陷，使分类效率更 高。2)本发明在分类计算前先设门删除不合格的数据，进一步减少了计算 量，提高了分类效率。3)本发明在分类后还对分类效果进行分类效果评价， 提高分类结果的可信性，从而提高粒子分类统计的准确性。本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
图1是流式细胞术的信号通道示意图；图2是传统的在二维散点图上进行分类的示意图；图3是已有技术缺陷的示意图；图4是本发明一种实施例的系统结构图；图5是本发明一种实施例的流程图；图6-a、 6-b、 6-c是设门的示意图；图7是图5中聚类的一种实施例的流程图；图8是图4中分类统计处理器的一种实施例的组成结构图；图9、 IO是分别利用本发明对两个不同的样本分类的结果；图ll、 12是分别利用同一个固定边界进行分类的结果。
具体实施方式本发明适用于流式细胞仪以及基于流式细胞术的血液分析仪、尿液分 析仪以及其他粒子分析仪中，通过对流过的所有粒子的二维或多维数据的 集合进行分析处理，将某粒子归到某个类中，最终粒子被归为样本所应有 的类别。流式细胞术分类统计系统一般如图4所示，包括样本发生装置2、 光照射装置1、检测器3和分类统计处理器4。所述样本发生装置2进一步 包括相互连接的气液传输控制模块22和流动室21，所述气液传输控制模 块22用于使含有被测细胞或粒子的样本液被鞘液包裹着通过流动室21， 流动室，为一个光透明器件，内有一个方形导孔，被测的细胞或粒子在鞘 液的包裹下逐个通过这个导孔，接受光束的照射；光照射装置l用于产生 光束以照射通过流动室的鞘流，光照射装置1通常包括一个或几个波长不同的激光光源11和用于将散射光整理成所需要光束的光束整形模块12， 光通过光束整形模块12后在流动室21的导孔处形成一个光斑，被测细胞 或粒子的样本液被鞘液包裹着通过光斑时产生各种光信号，通常光信号至 少有两路，如前向散射信号FSC、侧向散射信号SSC以及多路荧光信号FL， 如图1所示；检测器3用于收集细胞或粒子逐个通过光照区域时产生的至 少两路光信号，检测器3通常是PMT (光电倍增管)或PD (光电二极管)； 分类统计处理器4用于根据检测器3收集的光信号，将每个细胞或粒子表 征为一个与其各路光信号强度有关的、至少二维的向量，计算所有有效细 胞或粒子两两之间的距离的计算单元，且距离越近，两个细胞或粒子之间 的相似程度越高，将相似程度高的细胞或粒子聚集成同一个类，经多次聚 类后，至少将所有有效细胞或粒子聚集成样本根据测量原理所应有的类别 数L。分类统计处理器4的一种实施例是包括信号提取模块41和分析模块 42，信号提取模块41用于提取检测器3收集到的各路光信号，分析模块 42用于根据各个细胞或粒子的光信号对细胞或离子进行分类，并对每类中 的细胞或粒子进行统计。在流式细胞术中，每个粒子通过光感应区时都会得到二维或多维信号， 用于表征这个粒子的特性，把某个粒子通过光感应区得到信号这个过程叫 做一个事件。如果仪器系统具有P维信号通道，则当第i个粒子通过光照区 时触发事件ei，得到一个p维向量ei二(xu， xi2， Xi:,，…，xip)，其中Xik表示第k 个信号强度，这些信号一般是前向散射光FSC、侧向散射光SSC或者多路的 荧光FL1， FL2，…。当一次测量过程共通过了n个粒子时，就触发了n次事件， 得到数据I，<formula>formula see original document page 12</formula>本发明就是对I进行分析处理，将一次测量过程的全部事件分成所需 要的类别。分析模块42对细胞或粒子进行分类的一种实施例包括以下步骤 第一步去除干扰数据，减少运算量。每个测量过程所触发的ri个事件中，有些事件并不是想要考察的粒子所触发的，这些无效事件的数量很大甚至比有效事件还要多，增加了运算量的开销，因此要将这些事件的数据从原始数据s中除去，得到一个具有m个有效事件的数据ImXp。这些无效事弊一般来自于粒子和试剂反应后的 碎片以及噪声等，其信号特征比较明显， 一般可以通过硬件或者软件"设 门"的方式将它们除去。所谓"设门"就是设定一个阈值，在这个阈值之 内的数据全都保留，而超过整个阈值之外的数据全部剔除，反之亦可，即 超过阈值的全部保留而低于阈值的全部剔除，对于二维数据来说可以理解 为设定一个区域，数据落在这个区域之内的保留，落在这个区域之外的剔 除，反之亦可。图6-a、图6-b和图6-c中给出了一个在二维数据上将有 效数据除去的实例，图6-b中的区域E可以理解为一个"门"，当数据落 在这个"门"内时就删除，不让它参与聚类运算，这样可以减少运算量， 提高运算效率。图6-a中无效事件出现的区域一般为图6-b中的区域E， 当一个事件k被触发之后首先对这个事件的数据进行判断，如果 (;c41，、2;)eJE则认为此事件为无效事件，将第k个数据剔除，最终得到了 一个容量相对较少的有效数据ImXp (图6-c)。 第二步对有效数据进行聚类分析i)计算各事件之间的距离，用这个距离来衡量事件之间的相似程度， 且距离越近，两个细胞或粒子之间的相似程度越高。设d(ei， ej)是事件ei和ej之间的距离， 一般要求它满足下列条件a) J(e一/)》0，当且仅当e^ej时，d(ei，ej)=0;b) d(ei， e》二 d", e》；c) d , e,)" ， ) + d (q, e,)通常的流式细胞术有效事件总数大概在几千到l万之间，我们把具有相 同特征数据的事件作为一个事件，即当两个事件ei(Xu，^…，Xip)， ej(Xjl, Xj2，…，xjp)当ei二ej时只让它们的其中之一参与聚类运算，而计数的时 候给它记成两次，这样则数据量会更少，进一步提高运算效率。计算距离的方法有多种，本领域技术人员可以根据分类效果来选择采 用己有技术中的欧氏距离、绝对距离、Minkowski距离、Chebyshev距离、 方差加权距离以及马氏距离等中的一种来计算距离，下面说明用欧氏距离 来表示相似度，ei、 ej的欧氏距离为<formula>formula see original document page 14</formula>将各事件之间的距离都计算出来，形成一个距离集合，例如一个距离矩阵DmXm<formula>formula see original document page 14</formula>ii)将相似程度高的细胞或粒子聚集成同一个类，多次聚类后，至少 将所有有效细胞或粒子聚集成样本根据测量原理所应有的类别数L。并且 在合并的过程中记录该次合并的编号及两个类合并时的水平。一般来说用流式细胞术进行样本测量时，事先都会知道样本在这样的 测量原理下会有多少类粒子出现，例如血液细胞分析仪在进行白细胞分类 计数的时候会出现4 5类白细胞的子类，如果知道了样本应具有的类数g， 那么可以在上述方法中得到的谱系图中只分到g类为止。分析模块42对细胞或粒子进行分类的另一种实施例如图5所示，包 括以下步骤在步骤S2，收集所有细胞或粒子的各路光信号，将每个细胞或粒子都 表征为一个与其各路光信号强度有关的、至少二维的向量，将细胞或粒子 在相应的二维或多维散点图上定位，然后执行步骤S4;在步骤S4，设门去除千扰数据，减少运算量，该步骤与上一实施例中 的消除干扰数据相同，然后执行步骤S6;在步骤S6，计算细胞或粒子两两之间的距离，如果两个细胞或粒子的 距离为零，则只允许一个细胞或粒子参与聚类，但在计数时记录为两个细 胞或粒子。将距离同上一实施例一样组成距离矩阵，然后执行步骤S8;在步骤S8，将相似程度高的细胞或粒子聚集成同一个类，聚类方法可 以是谱系聚类法，也可以是已有技术中的快速聚类法或者其他聚类方法如 模糊聚类或神经网络聚类等。下面说明用谱系聚类法进行聚类，其一种实施例的流程如图7所示，包括以下步骤在步骤S802，在计算出的所有距离的距离集合中査找出距离最小的两个细胞或粒子。选择D(。冲非对角线上的最小元素，设这个最小元素为(， 然后执行步骤S804;在步骤S804，将该两个细胞或粒子合并成一个维数相同的新的类，即 将eu和"合并成一个新的类G,k， ej，然后执行步骤S806;在步骤S806，在距离集合中将与该两个细胞或粒子相关的距离删除， 即在D(。,中消去eu和ev所在的行和列，然后执行步骤S808;在步骤S808，计算新类^与其他类、细胞或粒子两两之间的距离，并 将其加入到距离集合中，得到一个新的距离矩阵Du)。从D(n出发重复上述步骤得到D(2)……，直到m个事件聚为1个大类为止。其中，步骤S806和S808的顺序可以调换。在合并的过程中记下合并事件的编号及两个类合并时的水平(即距 离)并绘制聚类谱系图。在步骤S8之后执行步骤S10，根据样本的特征进行分类，在聚类谱系 图上取不同的谱系水平即可将整个数据分成不同数量的类，根据样本的特 征，可知其在某测量原理下会有多少类粒子出现，通过选择谱系水平，即 可得到相应的类别。然而由于样本个体的差异，有些样本的某个子类的特征一致性较差， 也就是说这类粒子比较分散，或者某子类与另外一个子类的差异不明显(距 离较近)，如果仍然强制分成g个类的话就会出现误差，导致分类结果的可 信度下降，因此要在步骤10之后对聚类的效果进行评价，执行步骤S12;在步骤S12，对分类效果进行评价，包括以下步骤1、计算从1到L+r的各整数的聚类效果参数，其中L为样本根据测 量原理所应有的类别数，且L为大于或等于1的整数，r为根据经验所得 的大于O的整数。设某谱系水平上(距离)共有r个类，类Gk中的类内离差平方和为其中^为事件61的特征数据向量^1，^2，... ;^， T表示矩阵的转置，& 是类Gk的重心，即类Gk中所有参与运算的事件的重心，重心的坐标是事件的 各个纬度的平均值，Sk越小说明Gk中各个事件越相似。定义&=1>,，所有事件的总离差平方和为hi其中，那么用伪F统计量PSF来评价将所有数据分成g个类的效果其中，m是距离矩阵中参与运算的事件的总数目，PSF越大表示这些事 件可以显著地分成g个类。假设通常情况下的样本在某测量原理下应具有L个类，计算分类数从l 到L+r (r>0)的PSF， r通常取3 5。2、査找出其聚类效果参数为最大的整数，若PSF的最大值出现在分 成q个类时，认为从聚类分析的角度将事件分成q个类最合适。3、如上所述，q往往并不等于L，因此在步骤S12后执行步骤S14,采取 如下策略判断分类是否合理将步骤2中查找出的整数q和类别数L进行比 较，如果分类合理，则执行步骤S16，如果分类不合理，则执行步骤S18。 在步骤S16，分类合理时有两种情况-i) 当q〉L时，取分类数为q，并报警出现新类(往往是异常细胞群)， 转入到异常样本处理程序，异常样本处理程序是例如将其中的L类进行统计 计算百分比，对于新类并不参与百分比的计算、新类要用一个固定便捷来 计算等处理；ii) 当<formula>formula see original document page 16</formula>时，取分类数为L，正常运算并输出分类结果，o的 取值决于对大量样本研究的经验值，该样本中只有q个类，其它类的数据为零。在步骤S18，当<formula>formula see original document page 16</formula>时，说明此次的样本异常，不能区分出类别， 则不运算，报警，转入到异常样本处理程序。这种情况对于血液细胞来说 可能说明仪器出现故障，或者白血病或试剂对血液不起作用了。评价分类效果的统计量除了可以如上述所述采用伪F统计量外，本领 域技术人员也可以采用已有技术中的R2统计量、半偏相关统计量或者伪 t2统计量等。为实现上述方法，流式细胞术的分类装置(即图4中的分析模块)的 结构示意图如图8所示，包括事件生成单元、计算单元和聚类单元。事件生成单元用于根据收集每个细胞或粒子逐个通过光照区域时产生的至少两 路光信号将每个细胞或粒子表征为一个与其各路光信号强度有关的、至少二维的向量；计算单元用于根据事件生成单元生成的向量计算所有有效细 胞或粒子两两之间的距离，且距离越近，两个细胞或粒子之间的相似程度 越高；聚类单元用于将相似程度高的细胞或粒子聚集成同一个类的，所述 聚类单元能够多次聚类，至少将所有有效细胞或粒子聚集成样本根据测量 原理所应有的类别数L，在另一种实施例中，聚类单元将所有有效细胞或 粒子聚集成一个类。为减少参与运算的数据，提高分类的效率，分类装置还包括用于设定阈 值、将不符合阈值条件的数据删除的设门单元。其中所述聚类单元包括用于在计算出的所有距离的距离集合中査找 出距离最小的两个细胞或粒子的第一査找模块；用于将该两个细胞或粒子 合并成一个维数相同的新的类的合并模块；用于在距离集合中将与该两个 细胞或粒子相关的距离删除的删除模块；用于计算新类与其他类、细胞或 粒子两两之间的距离，并将其加入到距离集合中的第一计算模块。分类装置还进一步包括用于进行聚类效果评价以确定样本真正应有 的类别数的类别评价单元。所述类别评价单元包括用于计算从1到L+r的各整数的聚类效果参 数的第二计算模块，其中L为样本根据测量原理所应有的类别数，且L为 大于或等于1的整数，r为根据经验所得的大于0的整数；用于査找出其 聚类效果参数为最大的整数q的第二査找模块；用于将第二査找模块查找 出的整数q和类别数L进行比较的比较模块，所述比较模块用于在q〉L时， 取该样本的分类数为q，在L-o〈q《L时，取该样本的分类数为L，在q《L-o，不进行分别，并结束运算。所述第二计算模块计算的聚类效果参数为伪F统计量，所述第二计算模块包括用于根据公式^=i:"-^f^)计算每个类的类内离差平方和的第三计算模块，其中，Sk为类Gk的类内离差平方和，^为类Gk 内第i个细胞或粒子的特征数据向量fe，x,.2，…x,J， ^是类Gk的重心；用于计算将样本分成g个类时的各类的类内离差平方和之和Pg的第四计算模其中，A。为常温下，宽谱光源透过晶体后的峰值波长。因为对于选定的晶 体，d、 /t、 / 、 A"等都是常数，所以我们可以很方便的通过测量出透过起偏器 11后的透过谱的峰值波长的变化测量温度。如果双折射晶体选用d-2mm长蓝宝石晶体，根据蓝宝石晶体的特性 ifc=5.8*10'7/K， / -5M0"/K和室温下A"-0.008，可计算出常温下的干涉光强输出 图，如图9所示，其中横坐标为波长，单位nm，纵坐标为归一化光强，峰值为lo选取图9中的一个峰值波长;i。为1523.8nm，该峰值波长和下一个峰值波长 的间距为76,2nm,则可探测到的最大温度变化范围Ar为645.1QC，并且温度变 化和峰值波长的偏移成线性关系，如图IO所示，其中横坐标为峰值波长的偏移， 单位为nm，纵坐标为变化的温度，单位为GC。若波长探测精度O.Olnrn，则温 度的探测精度为0.08°C。合适的选择蓝宝石晶体的长度J和峰值波长人，可探测 最高温度超过2000aC，其中探测精度在0.1^以内。基于双折射晶体的干涉原理，通过测量经过薄膜滤波器或晶体后的干涉相 长或相消所对应的波长的偏移来测量温度，温度探测范围取决于不同类型的晶 体以及晶体的长度，温度的探测精度取决于峰值波长的探测精度，如上述实施 例1和实施例2所示，温度探测上限可达2000QC以上，温度探测精度在0.1QC 左右。
权利要求
1. 一种流式细胞术的自动分类方法，其特征在于包括以下步骤A1、根据收集的每个细胞或粒子逐个通过光照区域时产生的至少两路光信号，将每个细胞或粒子表征为一个与其各路光信号强度有关的、至少二维的向量；B1、计算所有有效细胞或粒子两两之间的距离，且距离越近，两个细胞或粒子之间的相似程度越高；C1、将相似程度高的细胞或粒子聚集成同一个类；D1、重复步骤C1，至少将所有有效细胞或粒子聚集成样本根据测量原理所应有的类别数L。
2. 如权利要求1所述的流式细胞术的自动分类方法，其特征在于在步 骤A1之后、步骤B1之前还包括以下步骤设定阈值，将不符合阈值条件 的细胞或粒子的数据删除。
3. 如权利要求1所述的流式细胞术的自动分类方法，其特征在于所述 步骤B1中用选自于欧式距离、绝对距离、Minkowski距离、Chebyshev距离、方差加权距离和马氏距离中的一种方法来计算细胞或粒子两两之间的 距离。
4. 如权利要求3所述的流式细胞术的自动分类方法，其特征在于所述 步骤C1中的聚类采用谱系聚类法，所述谱系聚类法包括以下步骤Cll、在计算出的所有距离的距离集合中查找出距离最小的两个细胞 或粒子；C12、将该两个细胞或粒子合并成一个维数相同的新的类； C13、在距离集合中将与该两个细胞或粒子相关的距离删除； C14、计算步骤C12中合并成的新类与其他类、细胞或粒子两两之间 的距离，并将其加入到距离集合中。
5. 如权利要求4所述的流式细胞术的自动分类方法，其特征在于在所 述步骤C11中，当距离为0时，则只允许一个细胞或粒子参与聚类，并在 计数时记录为两个细胞或粒子。
6. 如权利要求4所述的流式细胞术的自动分类方法，其特征在于在所 述步骤C12中，在合并的过程中记录该次合并的编号及两个类合并时的水平。
7. 如权利要求1至6中任一项所述的流式细胞术的自动分类方法，其特征在于所述步骤D1中，最后将所有有效细胞或粒子聚集成一个类别。
8. 如权利要求7所述的流式细胞术的自动分类方法，其特征在于在所 述步骤Dl之后还包括以下步骤El、进行聚类效果评价，确定样本真正应有的类别数。
9. 如权利要求8所述的流式细胞术的自动分类方法，其特征在于所述 步骤E1包括以下步骤Ell、计算从1到L+r的各整数的聚类效果参数，其中L为样本根据 测量原理所应有的类别数，且L为大于或等于1的整数，r为根据经验所 得的大于0的整数；E12、査找出其聚类效果参数为最大的整数q;E13、将步骤E12中査找出的整数q和类别数L进行比较，如果q〉L， 则取该样本的分类数为q;如果L-o〈q《L，则取该样本的分类数为L;如 果q《L-o，则不进行分别，并结束运算。
10. 如权利要求9所述的流式细胞术的自动分类方法，其特征在于所述 步骤Ell之中所述的聚类效果参数为伪F统计量，所述伪F统计量的计算 包括以下步骤El 11 、根据公式& = Z" - -计算每个类的类内离差平方和，其中，Sk为类Gk的类内离差平方和，^为类Gk内第i个细胞或粒子的特E112、计算将样本分成g个类时的各类的类内离差平方和之和Pg; E113、计算将样本分成g个类时的伪F统计量PSF，
11.—种流式细胞术的自动分类装置，其特征在于包括用于根据收集每个细胞或粒子逐个通过光照区域时产生的至少两路 光信号将每个细胞或粒子表征为一个与其各路光信号强度有关的、至少二 维的向量的事件生成单元；用于根据事件生成单元生成的向量计算所有有效细胞或粒子两两之 间的距离的计算单元，且距离越近，两个细胞或粒子之间的相似程度越高;用于将相似程度高的细胞或粒子聚集成同一个类的聚类单元，所述聚 类单元能够多次聚类，至少将所有有效细胞或粒子聚集成样本根据测量原理所应有的类别数L。C1、测量内侧的两个探针上的电压值，进而计算出监测晶圆上四十九个 不同点的电阻值，并取其平均值。C1、测量内侧的两个探针上的电压值，进而计算出监测晶圆上四十九个 不同点的电阻值，并取其平均值。
12. 如权利要求ll所述的流式细胞术的自动分类装置，其特征在于还包 括用于设定阈值，将不符合阈值条件的数据删除的设门单元。
13. 如权利要求11所述的流式细胞术的自动分类装置，其特征在于所述 计算单元用选自于欧式距离、绝对距离、Minkowski距离、Chebyshev距 离、方差加权距离和马氏距离中的一种方法来计算细胞或粒子两两之间的 距离。
14. 如权利要求13所述的流式细胞术的自动分类装置，其特征在于所述聚类单元包括用于在计算出的所有距离的距离集合中査找出距离最小的两个细胞或粒子的第一査找模块；用于将该两个细胞或粒子合并成一个维数相同的新的类的合并模块；用于在距离集合中将与该两个细胞或粒子相关的距离删除的删除模块；用于计算新类与其他类、细胞或粒子两两之间的距离，并将其加入到 距离集合中的第一计算模块。
15. 如权利要求11至14中任一项所述的流式细胞术的自动分类装置，其特征在于所述聚类单元用于最后将所有有效细胞或粒子聚集成一个类别。
16. 如权利要求15所述的流式细胞术的自动分类装置，其特征在于还包括用于进行聚类效果评价以确定样本真正应有的类别数的类别评价单元。
17. 如权利要求16所述的流式细胞术的自动分类装置，其特征在于所述 类别评价单元包括用于计算从1到L+r的各整数的聚类效果参数的第二计算模块，其中 L为样本根据测量原理所应有的类别数，且L为大于或等于1的整数，r 为根据经验所得的大于0的整数；用于査找出其聚类效果参数为最大的整数q的第二査找模块； 用于将第二查找模块查找出的整数q和类别数L进行比较的比较模 块，所述比较模块用于在q〉L时，取该样本的分类数为q，在L-o〈q《L时， 取该样本的分类数为L，在q《L-o，不进行分别，并结束运算。
18. 如权利要求17所述的流式细胞术的自动分类装置,其特征在于所述大约有70%APL患者体内存PML-RARa融合基因，该融合基因是APL发 病以及应用全反式维甲酸治疗有效的分子基础，是一个特异的白血病抗原。表 达PML-RARa的细胞可诱导T细胞克隆性增殖，提示该细胞内的融合蛋白可以 被MHC分子加工和提呈到细胞表面，因此可以利用PML-RARa融合蛋白或融 合基因诱导机体产生特异性免疫应答，或者诱导机体产生针对PML-RARa的特 异性CTL，达到免疫治疗的目的。Padua等研究发现利用跨越PML-RARa融合 基因的融合点的基因片段构建的DNA疫苗能够在小鼠体内诱导产生特异性免疫 保护作用。目前对于制备PML-RARa基因疫苗特异性目的基因的选择尚无定论，如何 筛选出具有最佳免疫原性的PML-RARa基因片段仍是此类研究所面临的核心问 题。目前尚未有融合基因pIRES-PML-RARa (384bp) -hIL-2 (人白细胞介素2) 的构建。发明内容针对上述现有技术存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种急性 早幼粒细胞白血病DNA疫苗PML-RARa 384-ML-2 (即pIRES-PML-RARa(384 bp) -1111^2重组质粒)。该融合基因pIRES-PML-RARa (384 bp) -hIL-2是能够 在真核细胞内同时表达PML-RARa和hIL-2蛋白的质粒。本发明利用基因克隆 和重组技术构建了急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARa(384 bp) -1111^2重组质粒)，并研究了通过体外细胞转导后基因和蛋白表达；小鼠体 内注射免疫后不同时期的基因和蛋白表达、抗体产生和特异性CTL效应等的效 应。本发明的另一目的在于提供上述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的制备方法。本发明的再一 目的在于提供上述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗的应用。 所述急性早幼粒细胞白血病DNA疫苗是一种能够在真核细胞中同时表达 PML-RARa蛋白和ML-2蛋白的DNA疫苗，它能够诱导APL患者机体产生针 对APL细胞的特异性CTL从而清除患者体内的微小残留病变，达到治愈APL 的目的。本发明的目的通过下述技术方案来实现 一种急性早幼粒细胞白血病DNA 疫苗PML-RARa 384-hIL-2，所述DNA疫苗PML-RARa 384-ML-2 (即比较，在q>L时，取该样本的分类数为q，在L-0〈q《L时，取该样本的分 类数为L，在q《L-0，不进行分别，并结束运算，其中L为样本根据测量 原理所应有的类别数，且L为大于或等于1的整数，r为根据经验所得的 大于0的整数。
全文摘要
本发明公开了一种流式细胞术的自动分类方法及装置，包括以下步骤A1.根据收集地每个细胞或粒子逐个通过光照区域时产生的至少两路光信号，将每个细胞或粒子表征为一个与其各路光信号强度有关的、至少二维的向量；B1.计算所有有效细胞或粒子两两之间的距离，且距离越近，两个细胞或粒子之间的相似程度越高；C1.将相似程度高的细胞或粒子聚集成同一个类；D1.重复步骤C1，至少将所有有效细胞或粒子聚集成样本根据测量原理所应有的类别数L。本发明能够将粒子准确、高效地自动分类。
文档编号G01N33/49GK101226190SQ200710072878
公开日2008年7月23日 申请日期2007年1月17日 优先权日2007年1月17日
发明者易晗平, 楚建军, 问 顾 申请人:深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司