专利名称：氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨(离 子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用 最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。
扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler 反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造 成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散 法更准确，CV为8X 13X;离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引 起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5X 4.8X，回收率高。结 合具体实际，应以酶法测定为实用。
检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯， 却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟 酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨(离子) 浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨(离子)诊断/测定试 剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进 行氨(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推 广应用。
5本发明氨(离子)浓度测定方法原理如下
氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根 磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 二氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水 二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸
+辅酶
这种方法应用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶)联 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC 4.1.1.31)、异 柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1.1.1.41; EC 1.1.1.42)酶促反应终 点比色法。谷氨酰胺合成酶酶解氨(离子)反应产生磷酸根，再通过(偶)联 合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在 340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定 还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程 度，可以测算氨(离子)的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨(离子)诊断/测定试剂盒较 为理想
缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
谷氨酰胺合成酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
100mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L异柠檬酸脱氢酶 10000 U/L
谷氨酸 10mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
草酰乙酸 5mmol/L
酮戊二酸 3 mmol/L
本发明的氨(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂-试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮 戊二酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠 檬酸脱氢酶。
还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、 谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不 限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮 戊二酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶。
还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、 谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位 置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨(离子)浓度的方法，其还原型 辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶
谷氨酰胺合成酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
谷氨酸
0.25腿ol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000 U/L 10 mmol/L腺苷三磷酸
3 mmol/L
草酰乙酸 酮戊二酸
5 mmol/L 3 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8 ±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂的 体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，检测时间 5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。 实施例二
本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
腺苷三磷酸 草酰乙酸
酮戊二酸
画mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂
谷氨酰胺合成酶 磷酸烯醇式丙酮酸羧化
500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L
异柠檬酸脱氢酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8
士0.7，测试主波长340nm,测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂1、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，
检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应,最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。
实施例三
本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
腺苷三磷酸 草酰乙酸
洞戊二酸
10Ommol/L 50 mmol/L 0,25 mmol/L 10 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L 3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 8000 U/L
异柠檬酸脱氢酶 10000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定氨(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时 间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测氨(离子)样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向 为负反应(下降反应)，延迟时间O分钟，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器 得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015;吸光度时 间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(RX).99)线形范围可达2 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过士5 %;试剂测试的精密度 (重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.64 ± 0.2AA/mmol /L—一本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的氨(离子)浓度测定方法，其方法原理如下氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 谷氨酰胺+ 腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+草酰乙酸 <u>磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶</u> 二氧化碳+ 磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 <u>异柠檬酸脱氢酶</u> 异柠檬酸+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出氨(离子)的浓度大小测定结果。
2. —种氨(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20—一500 mmol/L稳定剂1———4000 mmol/L还原型辅酶0.1———0,35 mmol/L谷氨酰胺合成酶IOOO-——80000 U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶IOOO-——80000 U/L异柠檬酸脱氢酶1000-——80000 U/L谷氨酸1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L草酰乙酸1—50 mmol/L酮戊二酸l一50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成单剂 试剂。
4. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草 酰乙酸、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、磷 酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶组成。还原型辅酶、谷氨酰胺合成 酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草 酰乙酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成多剂 试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草 酰乙酸、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、磷酸烯醇式丙酮酸羧 化酶、异柠檬酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶 组成。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异拧檬酸 脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464351SQ20071019214
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司