专利名称：：改进的免疫测定方法
技术领域：
：本发明通常涉及诊断或预后测定的领域，并特别涉及用于在包含患者体液的样品中检测抗体的测定，其中这些抗体用作疾病状态或疾病易感性的生物标志物。
背景技术：
：许多诊断、预后和/或监测测定依赖于检测特定疾病状态或疾病易感性的生物标志物。此类生物标志物通常是作为特定疾病的特征或与疾病易感性相关的蛋白质或多肽。近年来显然抗体(尤其是自身抗体)也可用作疾病或疾病易感性的生物标志物。自身抗体是天然产生的抗体，其针对被个体的免疫系统识别为外源(尽管该抗原实际上来源于该个体)的抗原。它们可以作为循环的游离自身抗体或者以循环的免疫复合体的形式存在于循环中，所述循环免疫复合体由与其靶抗原结合在一起的自身抗体组成。在一些情况下，由"正常"细胞表达的野生型蛋白质与疾病细胞产生的或在疾病过程中产生的变异形式蛋白质之间的差异导致个体的免疫系统将所述改变蛋白质识别为"非自身的"，并因此在该个体中引发免疫应答。这可能是体液(即B细胞介导的)免疫应答，导致产生对该变异蛋白质具有免疫特异性的自身抗体。WO99/58978描述了用于检测/诊断癌症的方法，所述方法基于评估个体对两种或更多种不同肺瘤标志物的免疫应答。这些方法通常涉及以下步骤使从该个体中取得的体液样品与一组两种或更多种不同胂瘤标志物抗原接触，每种肺瘤标志物抗原来自不同的肺瘤标志物蛋白；以及检测所述肿瘤标志物抗原与对该肿瘤标志物蛋白具有免疫特异性的循环自身抗体结合的复合体的形成。将该循环自身抗体的存在视为癌症存在的指示。通过自身抗体产生来测定个体对肿瘤标志物蛋白存在的免疫应答的测定为直接测定或检测体液中的肺瘤标志物蛋白提供了替代方案。这种测定基本上构成了对肿瘤标志物蛋白存在的间接检测。由于免疫应答的性质，很可能自身抗体可被极少量的循环肿瘤标志物蛋白诱发，因而依赖于检测对肺瘤标志物的免疫应答的间接方法将比用于直接测定体液中肿瘤标志物的方法更为灵敏。因此，基于自身抗体检测的测定方法在疾病早期有特殊价值，并还可能用于筛选无症状患者，例如用于在无症状个体群中鉴定具有发生疾病"风险"的个体或者在无症状个体群中鉴定已患有疾病的个体的筛选中。此外，基于自身抗体检测的测定方法可能在疾病早期有特殊价值，并还可用于在无症状个体群中鉴定已患疾病的个体。此外，它们可用于复发性疾病的早期检测。所述测定方法还可能在疾病疗法的选择或监测中有价值。抗体和自身抗体还可用作其它疾病状态或疾病易感性的生物标志物，其中类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、原发性胆汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis,PBC)、自身免疫性甲状腺炎(例如桥本甲状腺炎)、自身免疫性胃炎(例如恶性贫血)、自身免疫性肾上腺炎(例如阿狄森氏病)、自身免疫性曱状旁腺功能减退症、自身免疫性糖尿病(例如l型糖尿病)、重症肌无力仅仅是所述疾病的一些实例。本发明人认识到，当在诊断或预后上使用基于抗体检测的测定来评估群体中个体的疾病状态、疾病进程或疾病易感性时，在设计适用于整个待筛选受试者群体的标准化测定法方面可能遇到困难，因为所存在抗体的绝对量在不同个体之间差异显著。例如在具有低抗体量的个体中，这可产生高频率的假阴性结果。类似地，因为抗体的绝对量在不同个体之间变化意味着难于为阳性测定结果设置适合于所筛选群体中所有个体的阈值，所以对真阳性结果的评分有困难。本发明人确定，可通过包括抗原滴定步骤而明显改善测定的表现，更尤其改善其临床效用及可靠性，所述测定基于检测作为疾病生物标志物的抗体(尤其是自身抗体)。通过检测怀疑含有针对一系列不同量抗原的抗体的样品并构建滴定曲线，可以不依赖样品中存在的抗体绝对量而可靠地鉴定真阳性筛选结果。这样的方法与现有技术的方法相反，现有技术的方法仅滴定抗原来构建标准曲线，以允许鉴定待用于检测实际患者样品中抗体的最适当抗原浓度。在这些方法中，仅有单个点测定被提出用于实际诊断。因此，这些方法不考虑待检抗体的量在不同个体之间的变化，这导致假阳性和假阴性的发生。本发明人发现，基于抗原滴定的测定方法比在单个抗原浓度下测定自身抗体反应性显示出更高的特异性和灵敏度。本发明人还确定，将抗原滴定与同时滴定测试样品相结合的测定方法甚至比单独基于抗原滴定的方法提供更大的优势，特别是在自身抗体检测的情况下。这些所谓的"交叉滴定"方法构成了本发明的主题。发明概述根据本发明的第一个方面，提供在哺乳动物受试者中检测疾病状态或疾病易感性的方法，所述方法包括在测试样品中检测抗体，其中所述测试样品包含来自所述哺乳动物受试者的体液，且其中所述抗体是疾病状态或疾病易感性的生物标志物，所述方法包括(a)制备所述测试样品的两种或更多种不同稀释液，并对每个测试样品稀释液进行以下步骤(i)和(ii):(i)使所述测试样品稀释液接触多种不同量的对所述抗体具有特异性的抗原，(ii)对步骤(i)中所用的每个抗原量，检测抗体与抗原之间特异性结合的量，(b)对步骤(a)中所用的每个测试样品稀释液，绘制或计算出特异性结合量相对于抗原量的各个曲线，和(c)对每个所测试的测试样品稀释液和抗原量，基于所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量来确定所述疾病状态或疾病易感性的存在与否。根据本发明的第二个方面，提供在包含来自哺乳动物受试者的体液的测试样品中检测抗体的方法，其中所述抗体是疾病状态或疾病易感性的生物标志物，所述方法包括(a)制备所述测试样品的两种或更多种不同稀释液，并就每个测试样品稀释液进行以下步骤(i)和(ii):(i)使所述测试样品稀释液接触多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原，(ii)对步骤(i)中所用的每个抗原量，检测抗体与抗原之间特异性结合的量，(b)对步骤(a)中所用的每个测试样品稀释度，绘制或计算出特异性结合量相对于抗原量的各个曲线，其中通过对所述测试样品的至少两种不同稀释度呈现总体为S形的曲线来表明测试样品中存在与测定中所用抗原具有反应性的抗体。根据本发明的第三个方面，提供在包含来自哺乳动物受试者的体液的测试样品中检测抗体的方法，其中所述抗体针对引入至所述哺乳动物受试者中的外源物质，所述方法包括(所述方法包括(a)制备所述测试样品的两种或更多种不同稀释液，并就每个测试样品稀释液进行以下步骤(i)和(ii):(i)使所述测试样品稀释液接触多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原，(ii)对步骤(i)中所用的每个抗原量，检测抗体与抗原之间特异性结合的量，(b)对步骤(a)中所用的每个测试样品稀释液，绘制或计算出特异性结合量相对于抗原量的各个曲线，其中通过对所述测试样品中至少两个不同稀释液而现总体为S形的曲线来表明测试样品中存在与测定中所用抗原具有反应性的抗体。在本发明的所有方面中，所述哺乳动物受试者优选为人类。在本发明的所有方面中，所述抗体可以是自身抗体。在本发明的所有方面中，所述方法优选在体外对测试样品进行，所述测试样品包含从所述哺乳动物受试者获得或制备的体液。在本发明的所有方面中，测定的步骤(a)将优选包括使每一种测试样品稀释液都与用于所述测定的每一种抗原量接触，以使测试样品稀释液与抗原量的所有可能组合均被测试。在其所有方面中，本发明的一个独特特征在于，对测试样品中是否存在相关抗体的判断是基于在测试样品稀释度与所测试抗原浓度的每一种不同组合中观察到的特异性结合的量，换言之是集合值，而不是仅在单个抗原浓度下的读数或单个测试样品稀释度的读数。因此，可以直接基于这些集合值来确定疾病状态或疾病易感性或患者样品中针对外源物质的抗体的存在与否。在一个实施方案中，该判断是基于对所述测试样品的至少两个不同稀释度而言，在将抗原量对特异性结合量进行作图时，存在总体为S形曲线。从本文实施例中将显而易见的是，本发明人观察到，本发明的方法比仅基于抗原滴定的诊断或检测方法具有更高的灵敏度，并与其具有至少同等的特异性，并且降低假阳性和假阴性测定的发生率。现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明多个方面的不同特征。结合本发明的一个方面这样定义的每个特征可与结合本发明任何其它方面进行描述的特征相结合，除非明确指出不是这样。特别地，指明为优选或有利的任何特征可与指明为优选或有利的任何其它特征结合，除非明确指出不是这样。图l显示用于在得自乳腺癌患者的血清样品中检测针对p53(图la至d)和c-myc(图le至h)的自身抗体的一系列交叉滴定曲线。在每个实验中，分别对患者血清的六个不同稀释度针对重组p53或c-myc的不同抗原量的滴定系列测试特异性结合(1/10,000的血清稀释液是有效的"无血清，，对照)。对于每种抗原，为患者血清的每个稀释度绘制了特异性结合(表述为在650nm处的吸光度)相对于抗原浓度的各个曲线。图2图示了根据实施例3用于进行最佳血清和抗原浓度(OptimalSerumandAntigenConcentration,OSAAC)测定的滴定板布局的实例。注意-血清及抗原的稀释度示于各个平板上，而实际上却是将血清及抗原的稀释液加入至同一平板的对应孔中。图3至7显示用于在得自原发性乳腺癌患者和正常对照受试者的血清样品中检测针对p53、ECD6(还称作HER2的胞外结构域)及ECD6的3，片段的自身抗体的一系列交叉滴定曲线。在每个实验中，分别对患者血清的六个不同稀释度针对重组p53、ECD6或ECD63'片段不同抗原量的滴定系列测试特异性结合。对于每种抗原，为患者血清的每个稀释度绘制了特异性结合(表述为在650nm处的吸光度)相对于抗原浓度的各个曲线。图3显示用于在来自原发性乳腺癌患者(图a)或正常对照受试者(图b)的血清中检测抗p53自身抗体的代表性滴定曲线。图4显示用于在来自原发性乳腺癌患者(图a)或正常对照受试者(图b)的血清中检测抗ECD6自身抗体(使用ECD6抗原)的代表性滴定曲线。图5显示用于在来自原发性乳腺癌患者(图a)或正常对照受试者(图b)的血清中检测抗ECD6自身抗体(使用ECD63'抗原)的代表性滴定曲线。图6显示使用p53抗原(图A)、ECD6抗原(图B)或ECD63，抗原(图C)在来自同一原发性乳腺癌患者的血清中检测抗p53自身抗体或抗ECD自身抗体的代表性滴定曲线。图7(图a至d)显示实施例3中提到的额外的滴定曲线。发明详述概括而言，本发明提供用于检测作为疾病状态或疾病易感性生物标志物的抗体的免疫测定方法，其特征在于对每种待检测抗体存在情况的样品(测试样品)的两种或更多种不同稀释液各自针对不同量的对所述抗体具有特异性的抗原来测试特异性结合，并对测试样品的每个不同稀释液制备抗体/抗原结合量相对于所测试抗原量的各个滴定曲线。筒言之，所述测定基于测试样品及在该免疫测定中用作试剂的抗原的交叉滴定。免疫测定(例如ELISA、放射性免疫测定等)的一般特征为本领域技术人员所熟知(参阅Immunoassay,E.Diamandis和T.Christopoulus，AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA,1996)。用于检测具有特殊免疫特异性的抗体的免疫测定法通常需要使用在测试中显示与抗体具有特异性免疫反应性的试剂(抗原)。根据测定的方式，可以将该抗原固定在固体支持物上。将待检测抗体存在情况的样品与该抗原接触，如果具有所需免疫特异性的抗体存在于所述样品中，它们将与抗原发生免疫反应，以形成随后可检测或定量测定的抗体-抗原复合体。本发明方法的特征在于将每一待检测抗体存在情况的样品的两种或更多种不同稀释液各自针对多种不同抗原量(本文中也称作抗原滴定系列)进行测试。所述测定必须包括测试所述测试样品的至少两种不同稀释液，但还可包括测试所述测试样品的三种、四种、五种或六至十种或甚至更多种不同稀释液。针对至少两种，并优选至少三种、四种、五种、六种、七种或更多不同抗原量来检测所述测试样品的每种不同稀释液。典型测定还可包括不含任何抗原的阴性对照和/或阴性测试样品对照，如所述测试样品的1/10,000稀释液。在本文的上下文中，术语"抗原"指包含至少一个抗原决定簇或表位的物质，所述抗原决定簇或表位能够与期望检测的靶抗体特异性相互作用，或者指与所述抗体的可变区或互补性决定区发生特异性相互作用的任何捕获试剂。所述抗原通常是天然或合成的生物大分子，如蛋白质或肽，多糖或核酸，并可包括抗体或其片段，如抗独特型抗体。技术人员读者将理解，在本发明的方法中，可供结合靶抗体的抗原决定簇或表位的量对于建立滴定系列是很重要的。在许多测试形式中，可供结合的抗原决定簇或表位的量与所存在的抗原分子量直接相关。然而，在另一些实施方案中，如某些固相测定系统中，暴露的抗原决定簇或表位的量可能与抗原量不直接相关联，而是可能取决于其它因素，如对所述固相表面的附着。在这些实施方案中，本文中提及滴定系列中的"不同抗原量"时可认为是指不同的抗原决定簇或表位量。针对测试样品稀释液与测试抗原(抗原决定簇或表位)量的每种不同组合来测定(存在于所述测试样品稀释液中的)抗体与抗原之间的特异性结合的相对量或绝对量。然后使用所得结果对每一测试抗原量绘制或计算出(相对或绝对)特异性结合量相对于抗原量的一系列曲线，对测定中所使用的每种测试样品稀释度产生了各自的曲线。附图中展示了用于检测许多不同抗体的典型结果，其仅用于举例。基于对测定中使用的每种测试样品稀释度在每种抗原量下观察到的特异性结合量来确定测试样品中与测定中所用抗原具有反应性的抗体的存在情况，这通常由在至少两个不同测试样品稀释度下存在总体为s形的曲线来指示。抗体与抗原之间特异性结合的绝对量通常并不是必要的，除非期望产生定量测定。对于抗体存在与否的简单是/非测定而言，只要对测定中所测试的至少两种不同测试样品稀释度产生正确形状的曲线就足够了。如果对所测试的任何测试样品稀释度而言，在所测试的不同抗原量中可检测到的结合没有变化的话，那么可将此评价为不存在可检测量的抗体。在本发明的一些优选的实施方案中，所述方法是非定量的。因而可使用不依赖于信号强度的无量纲比例关系来产生抗体存在与否的是/非测定。如需要，可从较差滴定测定的结果中产生对存在于特定样品中的抗体量的测定。在涉及患者群体的临床测试的非限制性实施方案中，可通过与得自正常受试者的对照组的结果进行比较来确定在特定患者中评价结果为阳性结果的截取值(cut-off),例如正常群体的均值+2倍标准差的截取值。可将这样的患者样品评价为阳性，其中在至少一种抗原浓值)高于该截取值。在本发明的另一些非限制性实施方案中，可使用校准系统，以将未知测试样品评价为阳性或阴性。一种这样的校准系统可以基于使用已知为阳性和阴性的对照样品。可使用本发明的测定方法将阳性及阴性对照/校准样品与测试样品平行进行分析。通过与用作校准样品的已知阳性及阴性对照样品进行比较，将未知测试样品判断为阳性或阴性。本发明的方法对于所存在靶抗体的绝对量可在不同患者之间有巨大变化的临床诊断、预后、预测和/或监测测定是有利的。本发明人观察到，如果这些测定基于使用单一测试抗原量/浓度来检测抗体结合，则含有处于群体中(抗体量的)正常生理学范围内极低或极高端抗体量的患者样品可能由于所述测定方法的局限性而被遗漏；含有少量抗体的样品可能被评价为假阴性结果，而那些含有很高水平抗体的样品可能超出所选测定方法可准确检测的范围之外。在本发明的所有实施方案中，使用交叉滴定测定方法检测的抗体可以是自身抗体。本发明的交叉滴定测定方法特别适合于检测作为疾病状态或易感性的生物标志物的抗体/自身抗体，其中在患者中所存在抗体/自身抗体的绝对量以及抗体/自身抗体的特异性(尤其是抗体/自身抗体对其靶抗原的亲和力)方面均都存在患者间的显著差异。由其特定性质引发的自身抗体应答在不同患者之间可能差异显著，并且所存在自身抗体的绝对量及自身抗体的特异性/亲和力方面均存在差异。本发明的方法可将这种患者间差异考虑在内，从而使得能够产生用于任何给定抗体/自身抗体的(适用于检测群体中所有个体的)标准测定形式。自身抗体与其靶抗原之间的相互作用通常是低亲和力的相互作用，但如上文所述，结合强度在不同患者之间可能存在差异。本发明的方法特别适合于检测低亲和力的结合，因为可以从对测定中所用的每个测试样品稀释度所产生的滴定曲线的形状中推断阳性结果。本发明方法与仅基于抗原滴定的测定方法(即涉及针对抗原滴定系列检测单个测试样品的测定)的不同在于，其允许检测由低丰度和/或低亲和力抗体的结合所产生的信号，所述信号在其他情况下可能会被与测试样品中非靶成分的(测定中所用抗原的)非特异性结合所掩盖。本发明人观察到，在靶抗体的最佳检测所需的最佳测试样品稀释度中存在显著的抗原间及抗原内差异。因此，同一患者测试样品可以具有用于检测针对第一种抗原的抗体的第一最佳稀释度，以及用于检测针对来自不同蛋白质的第二种抗原的抗体的不同最佳稀释度(抗原间差异性)。对来自不同蛋白质的两种抗原来说，最佳测试样品稀释度的"差异"可以是几个数量级。例如，给定的测试样品用于检测针对第一种抗原(A蛋白质)的抗体的最佳稀释度可以是1:800，但是同一测试样品可能需要1:50的最佳稀释度来检测针对第二种抗原的抗体(B蛋白质)。当所用抗原是同一蛋白质的不同片段或者是全长蛋白质和该蛋白质的亚片段时，可观察到类似的结果(抗原内差异性)。因此，如果将对测试样品测试对一组不同抗原(其来自不同的蛋白质或单个蛋白质的片段或其组合)的反应性，该组中每种抗原所需的测试样品最佳稀释度可能不同。本发明的方法通过每次在临床环境中进行该方法时针对该组中每种抗原的不同稀释度来测试所述测试样品的不同稀释度而避开了该问题。因此，该组中每种抗原将在其"最佳"测试样品稀释度下进行自动检测。本发明人还观察到，对于特定抗原，可能存在最佳测试样品稀释度的个体间差异。因此，对于任何给定抗原，来自第一个受试者的测试样品可能在第一种测试样品稀释度(例如1:100)下产生最佳结果，而当使用同一抗原检测来自第二个受试者的测试样品时，最佳测试样品稀释度(例如1:500)可能是不同的。本发明的方法能够将这种患者之间的差异考虑在内，因为对于所检测的每个抗原而言，每次在临床环境中进行测定时均针对一系列抗原稀释度来测试一系列测试样品稀释度。因此，本发明的方法将始终对每种测试抗原而言针对每个测试样品使用最佳测试样品稀释度。本发明的方法还在进行用于诊断、预后和/或监测(疾病状态或治疗)目的自身抗体/抗体检测的免疫测定时提供针对日期差异的保障。经常观察到，当进行用于在包含患者体液的样品中检测抗体的免疫测定时，信号强度存在显著的日期差异。该差异例如可能是由于在测试前获得及保存样品的方式不同而产生的。这些因素使得难于确定地评价临床测定的结果，例如在抗体/抗原结合的筒单阈值基础上进行评价。本发明使这种日期差异的影响降到最低，因为从滴定曲线的形状可清楚明显地得到抗体存在的阳性结果，所述滴定曲线针对用于测定的每个测试样品稀释度产生，不依赖于信号强度。本发明方法的另一优点在于，其允许稀释患者样品，而仍然产生一致的结果，并且其使用来自同一个体的不同来源(例如血液或血清以及腹水或胸腔积液)的体液通常产生相同的定性筛选结果(阳性/阴性)，即便抗体的绝对浓度在不同流体中可能不同。本发明方法可以以使怀疑含有抗体的样品的多种稀释液接触多种不同抗原量的任何合适形式来实施。方便地，样品的不同稀释液与不同抗原量之间的接触可在分开但平行的反应室(如微量滴定板的孔)中发生。可通过由抗原贮存液在微量滴定板的孔中制备连续稀释液而将不同量的抗原包被到微量滴定板的孔中。抗原贮存液的浓度可以是已知的或未知的。然后可以向平板的孔中加入所制备测试样品稀释液的等分试样，并使每个孔中测试样品的体积保持一致。如本领域技术人员将理解的，加入至微量滴定板的孔中的抗原绝对量可根据诸如靶抗体的性质、测试样品的性质、测试样品的稀释度等这些因素而变化。抗原量及测试样品的稀释度通常被选择成产生一系列信号强度，所述信号强度在选择用于在所述方法中检测抗体/抗原结合的读出值的可接受检测范围内。在所附实施例中给出了用于检测怀疑含有抗肿瘤标志物自身抗体的人类血清样品的典型量及稀释度。例如，测试样品的典型稀释度可为1/30至1/10,000(或1:50至1:1600)不等。抗原的测试量通常为0.01pg/ml至10照/ml(或0.16nM至160nM)不等，但这并不旨在限制。如上述，即便j^存液中抗原的绝对浓度未知，以抗原的单个贮存液开始对测试样品的两种或更多种稀释度构建滴定曲线也是可能的。假如使用相同的单个贮存溶液并以相同方式进行连续稀释，就有可能对在不同起始测试样品上进行的该抗原的各个滴定测定结果进行比较。在该测定的另一些实施方案中，不同量的抗原(抗原决定簇或表位)可固定在固体支持物上离散的位置或反应位点上。然后使整个支持物或其包含反应位点亚部分的离散区域与测试样品稀释液接触，并在每个离散位置或反应位点处分别检测或测定抗体与抗原的结合。合适的固体支持物还包括微阵列，例如其中阵列上的离散位点或点包含不同量的抗原的阵列。可通过将不同量的特定抗原固定在阵列上离散的可分辨的反应位点上来制备微阵列。在另一些实施方案中，固定抗原分子的实际量可保持基本一致，但阵列上位点或点的大小不同，以改变可供结合的表位量，提供具有不同量的可用结合表位的位点或点的滴定系列。在这些实施方案中，在滴定系列的制备中重要的是抗原上结合表位的二维表面浓度，而不是抗原的绝对量。用于制备和检测蛋白质/肽微阵列的技术为本领域所公知。从以上讨论中将会理解，在本发明的所有实施方案中，可通过改变检测测试样品稀释液的抗原或表位密度，或通过维持抗原或表位密度但增大固定抗原的表面积，或通过以上两种方法来实现抗原量的改变。微阵列可用于对不同特异性的抗体平行进行的多重测定。这可使用包含多组不同抗原的阵列来完成，每组包含多个不同量或浓度的特定抗原。术语"不同抗原"包括来自不同蛋白质或多肽的抗原(如来自不同基因所编码的无关蛋白质的抗原)以及来自一种蛋白质或多肽的不同肽表位的抗原。给定的微阵列可仅包括来自不同蛋白质或多肽的不同抗原组，或仅包括来自一种蛋白质或多肽的不同肽表位的抗原组，或者这二者任何比例的混合物。应该指出，在本发明所有实施方案中，优选每一个抗原滴定系列包含不同量或不同浓度的仅一种抗原类型，而不是抗原的混合物。本文所用的术语"体液"在指代使用本发明方法检测抗体存在的材料时，包括血浆、血清、全血、尿、汗、淋巴、粪便、脑脊液、腹水、胸腔积液、精液、唾液、乳头抽吸物、手术后血清肺或创伤引流液等。如上述，本发明方法优选在体外对包含从测试受试者中取得的体液的测试样品稀释液进行。所用体液的类型可以根据待测抗体的身份及使用该测定的临床情况而变化。通常，优选对血清或血浆样品进行测定。测试样品除体液外还可包含其它成分，例如稀释剂、防腐剂、稳定剂、緩冲剂等。可使用任何合适稀释剂制备测试样品的稀释液。技术人员读者将理解，制备测试样品稀释液的原因仅是为了产生测试样品系列，每一测试样品含有该免疫测定中不同绝对量的待检靶抗体。它不旨在排除获得含有不同量靶抗体的"测试样品"的其它方法。例如，实际上可使用透析来"浓缩，，而非稀释从患者中取得的测试样品，以获得比天然浓度更高的抗体的测试样品。在另一些实施方案中，如当从患者中取得的体液就靶抗体而言相对较稀时，首先应该浓缩所述体液(例如通过透析或类似技术)，以制备浓缩的贮存液，其随后用于制备用于本发明测定的一系列稀释液。本文中的术语"抗原"以广义使用，指显示与待检测的靶抗体具有特异性免疫反应性的任何物质。合适的抗原可包括但不局限于天然存在的蛋白质、重组或合成蛋白质或多肽、合成肽、肽模拟物等，还包括多糖及核酸。尤其是，此处所用的"抗原"旨在包括能够与待检抗体的可变区或互补性决定区发生特异性免疫反应的任何捕获剂，无论是人类来源、哺乳动物来源还是其它来源。例如，抗独特型抗体可被认为是用于该目的的抗原，其可由噬菌体展示产生。某些抗原可包含或来自从天然来源中分离的蛋白质或多肽，包括但不局限于从患者组织或体液中分离的蛋白质或多肽。在这种实施方案中，所述抗原可包含基本上该天然存在蛋白质的全部，即基本为从天然来源中分离时之形式的蛋白质，或者它可包含天然存在蛋白质的片段。为了作为本发明方法中的有效抗原，任何这种"片段"必须保留对测试所用抗体的免疫反应性。例如可通过对分离蛋白质的化学或酶促切割来制备合适的片段。根据待用测定的确切性质，抗原可包含与一个或多个其他分子连接的天然存在生物分子(例如，蛋白质或其片段)，所述其他分子赋予所述生物分子中非天然存在的一些期望特征。例如，所述生物分子(例如蛋白质或多肽片段)可缀合至指示标记，例如荧光标记、有色标记、发光标记、放射性标记或者重金属如胶体金。在另一些实施方案中，蛋白质或片段可表达为融合蛋白。例如，融合蛋白可包括N端或C端的标签肽，以协助重组表达抗原的纯化。才艮据法ffl孤l^始报:i'.始.庙"5T阅^在面汰古娃脉H.桐"4o微吾，;翁定板的孔、微阵列珠或芯片或磁珠。可通过非共价吸附或共价附着来实现固定。可使用任何合适的附着方法，只要其不对抗原与靶抗体发生免疫反应的能力产生显著负影响即可。本发明不局限于固相测定，而是还包括全部或部分在液相中进行的测定，例如溶液相珠测定。在一个实施方案中，可使用能有助于固定的配基(如生物素)标记抗原。然后可将抗原稀释到合适的滴定范围，随后使其与患者样品中的自身抗体在溶液中进行反应。然后可将所得的免疫复合体通过配基-受体相互作用(例如生物素-链霉抗生物素蛋白)固定到固体支持物上，如上所述进行测定的其余部分。为了便于产生用于本发明测定方法的生物素化多肽抗原，编码全长多肽抗原、其截短部分或其抗原片段的cDNA可表达为标记有蛋白质或多肽标签的融合蛋白，生物素辅因子可通过酶促反应附着到所述蛋白质或多肽标签上。用于产生重组生物素化抗原的载体可购自许多来源。使用以生物素化抗原进行的交叉滴定方法的另一优点是，所述测定能够区分生物素组分与抗生物素抗体的结合以及抗原与其相应抗体的真正结合。本发明人观察到，大量人群天然产生抗生物素抗体，其在基于使用生物素化抗原的测定中可能导致产生假阳性结果。如上述，根据本发明用于检测抗体的"免疫测定"可基于本领域已知的标准技术，只是使用多种抗原量产生滴定系列，所述滴定系列可与所选测试样品的多种不同稀释液反应。在一个非常优选的实施方案中，所述免疫测定可以是ELISA。ELISA通常为本领域所熟知。在典型的"间接"ELISA中，将对测试抗体具有特异性的抗原固定在固体表面(例如标准微量滴定测定板的孔，或者微珠或微阵列的表面)上，并使包含待检测抗体存在情况之体液的样品与固定化的抗原接触。样品中存在的具有期望特异性的任何抗体将结合到所述固定化的抗原上。然后使用合适的方法检测结合的抗体/抗原复合体。在一个优选的实施方案中，使用特异性识别一类或多类人免疫球蛋白常见表位的经标记第二抗人免疫球蛋白抗体来检测所述抗体/抗原复合体。通常，所述第二抗体将是抗IgG或抗IgM。第二抗体通常^f吏用可检测的标记物来标记，通常是酶标记(例如过氧化物酶或碱性磷酸酶)，以允许通过添加该酶的底物(其产生可检测到的产物，例如有色的、化学发光的或荧光产物)进行定量检测。可使用本领域已知的其它类型的可检测标记。本发明涉及检测抗体的方法，所述抗体是疾病状态或疾病易感性的生物标志物。本发明的这一特定方面优选排除设计用于检测因癌症标志物以外的疫苗攻击或免疫方法产生的抗体的测定。因此，本发明这一方面的测定优选不包括^:计用于在疫苗接种/免疫后检测抗病毒或抗细菌抗体存在的测定。在本发明某些实施方案中，抗体可以是自身抗体。如上所述，术语"自身抗体"指天然存在的抗体，该抗体针对被个体的免疫系统识别为外源的抗原(尽管该抗原实际上来自于所述个体)。自身抗体包括针对疾病细胞所产生或在疾病过程中产生的天然存在蛋白质的变异形式。所述蛋白质的变异形式来源于该个体，但可能被所述个体的免疫系统认为是"非自身的"，因而在该个体中引发免疫应答，其形式为对所述改变蛋白质具有免疫特异性的自身抗体。这种变异形式的蛋白质可包括，例如具有改变的氨基酸序列并任选地伴随二级、三级或四级结构改变的突变体、截短形式、剪切变体、改变的糖形(glycoform)等。在另一些实施方案中，自身抗体可针对在疾病状态中例如由于基因扩增或转录调节异常而过表达的蛋白质。免疫系统的细胞通常不会遇到的蛋白质的大量过表达可触发免疫应答，导致自身抗体产生。在另一些实施方案中，自身抗体可针对在疾病状态中开始表达的胚胎形式蛋白质。如果通常仅在发育早期阶段在免疫系统有功能之前表达的胚胎蛋白质在疾病状态中开始表达，那么所述免疫系统可将所述胚胎形式识别为"外源的"，从而触发免疫应答，导致自身抗体产生。在一个实施方案中，抗体可以是对肿瘤标志物蛋白具有特异性的自身抗体，更具体地是"癌症相关性的"抗肺瘤自身抗体。术语"癌症相关性的"抗肺瘤自身抗体指针对在癌症疾病状态中优先表达的肿瘤标志物蛋白质形式上所存在表位的自身抗体。这种自身抗体的存在是癌症疾病状态或无症状患者中癌症诱因的特征。在一些优选应用中，本发明方法将用于在来自人类受试者或患者的测试样品中检测癌症相关性抗肿瘤自身抗体的存在(但本方法也可用于来自其它非人类哺乳动物的测试样品)，并将最优选釆取体外免疫测定的形式，在包含从该受试者/患者中取得的体液样品的两种或更多种测试样品稀释液上进行。可在任何合适的緩冲液中稀释体液样品，并可对其进行处理以用于长期贮藏，或在测试前进行其他处理。体外免疫测定是非侵入性的，并且可以认为必要的频繁程度重复进行，以产生自身抗体产生特征镨，这可以是在疾病发病之前，例如在"风险"个体的筛选中；或者在疾病的整个病程中(在下文中就本方法的优选应用进一步进行讨论)。特别但非限制性的是，本发明方法的实施方案可包含免疫测定，以(同时)检测两种或更多种类型的自身抗体，每种自身抗体对相同或相关肺瘤标志物蛋白(例如由单个基因编码的不同同工型或变体)上的不同表位或者对不同肿瘤标志物蛋白(指由不同基因编码的蛋白质)上的表位具有特异性。这些方法将通常包括使用两组或更多组抗原的组合，每组抗原通常来自不同的肿瘤标志物蛋白("不同，，在该上下文中指作为不同基因之产物的蛋白质)，但如上文指出，一组抗原也可包括同一肿瘤标志物蛋白上的不同表位。"一组"抗原指有待于在本发明方法中以不同量/浓度检测的单个抗原。在下文中称作"组合测定"的这些方法利用两组或更多组抗原的组合来监测个体对胂瘤或其它致癌/赘生性改变的总体免疫应答。这样，这些方法检测给定个体中的免疫应答"镨"，指出哪一肺瘤标志物引发了导致自身抗体产生的免疫应答。使用两种或更多种抗原的组合来监测针对两种或更多种不同肺瘤标志物的自身抗体的产生通常比检测单个标志物的自身抗体更为灵敏，并且给出频率低得多的假阴性结果(参阅WO99/58978和WO2004/0445卯，所述内容以引用方式整体并入本文)。因而，在本发明的非限制性实施方案中提供了在包含来自哺乳动物受试者之体液的测试样品中检测两种或更多种抗体的方法，其中至少一种所述抗体是疾病状态或疾病易感性的生物标志物，该方法包括(a)制备所述测试样品的两种或更多种不同稀释液，并就每个测试样品稀释液进行以下步骤(0和(ii):(i)使所述测试样品稀释液与对两组或更多组抗原接触，其中所述组中的每一种抗原对测试样品中待检测抗体之一具有特异性，并且其中每一组抗原包含多个不同量的相同抗原，(ii)对步骤(i)中所用的每一组抗原中每种抗原量，检测抗体与抗原之间特异性结合的量，(b)对步骤(a)中所用的每一样品组中的每种测试样品稀释度，绘制或计算出特异性结合量相对于抗原量的各个曲线，其中测试样品中与至少一组抗原具有反应性之抗体的存在是通过对所述测试样品的至少两种不同稀释度和该组而言呈现总体为S形的曲线来表明。在该方法的一个实施方案中，所述两种或更多种抗体中的每一种都将是疾病状态或疾病易感性的生物标志物，但将用于疾病标志物抗原的交叉滴定测定与用于同一测试样品中任何其它类型抗体(可能是或不是疾病标志物)的交叉滴定测定相结合，这也在本发明的范围内。无论如何，对于测试样品中是否存在相关抗体的判断都是基于就测试中每种不同抗原而言在每个不同抗原浓度下观察到的特异性结合量，换言之，是每种抗原的集合值，而不是每种抗原在单个浓度下的读数。因此，可以在每种抗原的这些集合值的基础上，基于患者样品中两种或更多种抗体类型的存在情况来确定疾病状态或疾病易感性是否存在。优选地，基于对测试中存在的任何或全部抗原而言在至少两个不同测试样品稀释度下显示总体为s形的曲线来做出判断。为了避免混淆，基于使用单个类型抗原来检测抗体的测定在本文中可称作"单标志物测定"，而基于使用两种或更多种抗体之组合的测定称作"组合测定"。在组合测定法的一个优选实施方案中，在测定中检测的至少一个(优选所有)抗体是与肺瘤标志物蛋白反应的自身抗体。本发明的交叉滴定测定可适用于检测针对基本上任何可制备合适抗原的肿瘤标志物蛋白的自身抗体，作为单标志物测定或组合测定之成分的合适抗原。具体地，通过使用相应的抗原，所述方法可适用于检测/测定对两种或更多种以下肺瘤标志物蛋白中的任何一种或任何组合具有免疫特异性的自身抗体表皮生长因子受体蛋白EGFR(Downward等(1984)Nature.307:521-527;Robertson等(2001)ArchivesofPathologyandLaboratoryMedicine126;177-81);MUC1(Batra，S.K.等(1992)Int.J.Pancreatology.12:271-283);Myc(c画myc)(Blackwood,E.M.等(1994)MolecularBiologyoftheCell5:597-609);p53(Matlashewski,G.等(1984)EMBOJ.3:3257-3262;Wolf,D.等(1985)Mol.Cell.Biol.5:1887-1893);ras(或Ras)(Capella，G.等(1991)EnvironHealthPerspectives.93:125-131);BRCA1(Scully,R.等(1997)PNAS94:5605-10);BRCA2(Sharan，S.K.等(1997)Nature.386:804-810);APC(Su，L.K.等(1993)CancerRes.53:2728-2731;M廳mitsu，S.等(1995)PNAS92:3046-50);CA125(Nouwen,E.J.等(19卯)Differentiation.45:192-8;NorumLF,等，TumourBiol.2001Jul-Aug;22(4):223國8;PereyL,等，BrJCancer.1990Oct;62(4):668画70;DevinePL,等，AnticancerRes.1992May画Jun;12(3):709画17);PSA(Rosenberg,R.S.等(1998)BiochemBiophysResCommun.248:935-939);癌胚抗原CEA(Duffy，M丄(2001)ClinChem，Apr47(4):624國30);CA19.9(Haga,Y.等(1989)ClinBiochem(1989)Oct22(5):363-8);NY-ESO國l(癌/睾丸抗原；Chen,Y.-T.等，Proc.Nat.Acad.Sci.94:1914-1918,1997);PSMA(前列腺特异性膜抗原；Israeli,R.S.等，CancerRes.53:227-230，1993);PSCA(前列腺干细胞抗原;Reiter，R.E.等,Proc.Nat.Acad.Sci.95:1735-1740，1998);EpCam(上皮细胞粘附分子；Szala，S.等,Proc.Nat.Acad.Sci.87:3542-3546，1990);HER2-neu(也称为c國erbB2)(Coussens,L.等，Science230:1132-1139,1985);EDC6,其为HER2胞外结构域的另一名称。CAGE(JagerD，等，CancerRes.1999Dec15;59(24):6197画204;MashinoK,等，BrJCancer.2001Sep1;85(5):713國20);细胞角蛋白(MollR，等，Cell.1982Nov;31(l):ll-24;BraunS，等，NEnglJMed.2000;342:525-533)。术语"细胞角蛋白"宽泛地用于指其相应自身抗体发挥肿瘤标志物功能的任何细胞角蛋白家族成员。优选实例是细胞角蛋白5/14、8/18(KimMJ,RoJY，AhnSH,KimHH,KimSB,GongGHumPathol.2006Sep;37(9):1217-26.Epub2006Jul18);细胞角蛋白7、20(VangR，GownAM,BarryTS，WheelerDT，YemelyanovaA，SeidmanJD，RonnettBM.AmJSurgPathol.2006Sep;30(9):1130國1139);和细胞角蛋白8/18/19(BarakV，GoikeH，PanaretakisKW，EinarssonR.ClinBiochem.2004Jul;37(7):529-40)。恢复蛋白(recoverin)(MaedaA，等,CancerRes.2000Apr1;60(7):1914画20);激肽释放酶(KimH,等，BrJCancer2001;84:643-650;YousefGM，等，TumorBiol2002;23:185-192)。术语"激肽释放酶"宽泛地用于指其相应自身抗体发挥肿瘤标志物功能的任何激肽释放酶家族成员。优选实例是激肽释放酶1至15(KLKl-15/Hkl國Hkl5)(ObiezuCV，DiamandisEP.CancerLett.2005Jun16;224(1):1國22;DiamandisEP，YousefGM.ClinChem.2002Aug;48(8):1198-205)，特别是KLK4-7(PrezasP，ArltMJ，ViktorovP,SoosaipillaiA,HolzscheiterL,SchmittM,TalieriM,DiamandisEP，KrugerA,MagdolenV.BiolChem.2006Jun;387(6):807國ll;DiamandisEP，YousefGM，LuoLY，MagklaraA,ObiezuCV.Thenewhumankallikreingenefamily:implicationsincarcinogenesis.TrendsEndocrinolMetab.2000Mar;ll(2):54誦60.综述)；膜联蛋白(HudelistG，等,BreastCancerResTreat.2004Aug;86(3):281國91;Gerke，V.&Moss,S.E.PhysiologicalReviews200282:331-371)。术语"膜联蛋白，，宽泛地用于指其相应自身抗体发挥肿瘤标志物功能的任何膜联蛋白家族成员。优选实例是膜联蛋白1和2(Pedrero,J.M.G"Fernandez,M.P"Morgan,O.,Zapatero,A.H"Gonzalez,M.V"Nieto,C.S.&Rodrigo,J.P.AmericanJournalofPathology2004164(1):73-79;Brichory,F.M.,Misek,D.E.，Yim,A.,Krause,M.C.，Giordano,T.J.,Beer,D.G"Ha腦h,S.M.2001MedicalSciences98(17):9824國9829)和膜联蛋白XI-A(Fern在ndez-Madrid，F"Tang，N.,Alansari,H.,Granda,J丄.,Tait,L.，Amirikia，K.C.，Moroianu，M.，Wang，X.&Karvonen,R.L.CancerResearch200464:5089-5096);甲胎蛋白(AFP)(StillerD，等，ActaHistochemSuppl.1986;33:225-31);GRP78(BlockTM，等，ProcNatlAcadSciUSA.2005Jan18;102(3):779-84;HsuWM,等,IntJCancer.2005Marl;113(6):920-7);乳腺珠蛋白(Mammaglobin)(ZehentnerBK，等，ClinChem.2004Nov;50(ll):2069-76;ZehentnerBK,CarterD.ClinBiochem.2004Apr;37(4):249-57);raf(CallansLS.等，AnnSurgOncol.1995Jan;2(l):38-42;PrattMA,等，MolCellBiochem.1998Dec;189(l國2):119-25);P-人绒毛膜促性腺激素b-HCG(AyalaAR,等，AmJReprodImmunol.1983Apr-May;3(3):149-51;GregoryJJJr，等，Drugs.1999Apr;57(4):463-7);4國5抗原(KrauseP,等，JImmunolMethods.2003Dec;283(l國2):261誦7);NY画BR画l(JageD,StockertE,GureAO,ScenlanMJ,KarbachJ，JageE，KnuthA,OldLJ,ChenYT.(2001)Identificationofatissue-specificputativetranscriptionfactorinbreasttissuebyserologicalscreeningofabreastca&cerlibrary.CancerRes61(5):2055-61);Livin(KasofGM,GomesBC(2001)Livin，anovelinhibitorofapoptosisproteinfamily.JBiolChem,276(5):3238-46);存活素(AmbrosiniG，AdidaC,AltieriDC(1997)Anovelanti陽apoptoisgene,survivin，expressedincancerandlymphoma.NatureMed,3(8):917-21);MUC2(糖蛋白)GriffithsB,MatthewsDJ,WestL，AttwoodJ，PoveyS，SwallowDM,GumJRKimYS(1990)AssignmentofthepolymorphicintestinalmucingeneMUC2tochromosome-llp15.AnnHumGenet,54:277-85.内皮抑制素(StandkerL,SchraderM,KanseSM,JurgensM,ForssmannWG，PreissnerKT(1997)Isolationandcharacterisationofthecirculatingformofhumanendostatin.FEBSLett,420(2-3):129-33;Bcl-2(TsujimotoY,CroceCM(1986)Analysisofthestructure,transcripts,andproteinproductsofBcl-2，thegeneinvolvedinhumanfollicularlymphoma.PNASUSA,83(14):5214-8);BIRC7(WuHy,MaYh,ZhuYk,ShenY,GuCM,YeZY,LinHL(2006)TheexpressionofBIRC7proteinandmRNAinnon-Hodgkin,slymphoma.Leukemia&Lymphoma47(6):1110-6);热激蛋白(术语热激蛋白宽泛地用于指其相应自身抗体发挥肿瘤标志物功能的任何热激蛋白)包括但不仅限于HSP70(TauchiK，TsutsumiY，HoriS,YoshimuraS,OsamuraRy，WatanabeK(1991)Expressionofheatshockprotein-70andc-mycproteininhumanbreast-cancer-animmunohistochemicalstudy.JapJClinOncol,21(4):256-63);HSP27(DifferentialexpressionofalphaB-crystallinandHsp27-1inanaplasticthyroidcarcinomasbecauseoftumor-specificalphaB-crystallingene(CRYAB)silencing.MinevaI,GartnerW,HauserP,KainzA,LofflerM,WolfG，OberbauerR,WeisselM，WagnerL.CellStressChaperones.2005Autumn;10(3):171画84);和CRYAB(SeitzS，KorschingE，WeimerJ,JacobsenA,ArnoldN，MeindlA,ArnoldW,GustavusD,KlebigC,PetersenI,ScherneckS.GenesChromosomesCancer.2006Jun;45(6):612國27).No55(FossaA,SiebertR，AasheimHC，MaelandsmoGM，BernerA，FossaSD,SmelandEBGaudernackG(2000)IdentificationofanucleolarproteinNo55asatumour-associatedauto-antigeninpatientswithprostatecancer.BrJCancer83(6):743-9).尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)(BooyseFM，OsikowiczFederS，ScheinbuksJ(1984)Isolationandcharacterisationofaurokinase-typeplasminogenactivator(MR=54，000)fromcultureshumanepithelialcellsindistinguishablefromurinaryurokinase.JBiolChem259(11):7198-205);四连蛋白(tetranectin)(纤溶酶原结合蛋白)(ClemmensenI，PetersenLC，KluftC(1986)Purificationandcharacterizationofanovel,Oligomeric，PlasminogenKringle4binding-proteinfromhuman27plasma-Tetranectin.EurJBiochem156(2):237-333);催乳素(RiddleO,batesRW，DykshornSW(1933)Thepreparation,identificationandasseyofprolactin-Ahormoneoftheanteriorpituitary.AmJPhysiol105(1):191-216);骨桥蛋白(ButlerWT,MartinTJ,RaiszLG，SlavkinHCTermineJD,RodanGA,VeisA(1988)Osteopontin-Structureandbiologicalactivity.CBAFoundationSymposia136:203-206;KieferMC,BauerDM,BarrPJ(1989)TheCDNAandderivedamino-acidsequenceforhumanOsteopontin.NucleiAcidsRes17(8):3306-3306);人附睾特异性蛋白(HE4)KirchoffC,HabbenI,IvellR,KruUN(1991)Amajorhumanepididymis-specificcDNAencodesaproteinwithsequencehomologytoextracellularproteinase國inhibitors.BiologyofReproduction45(2):350-357);肺瘤相关性胰蛋白酶抑制剂(TATI)(HuhtalaML,KahanpaaK，SeppalaM,HalilaH,StenmanUH(1983)Excretionofatumourassociatedtrypsin國inhibitor(TATI)inurineofpatientswithGynecologicalMalignancy.IntJCancer31(6):711-714,1983;抑制素(ChariS，HopkinsonCRN,FritzeE,SturmHirschhauserC.(1977)Partial-PurificationofInhibinfromHumanTesticularExtracts.ACTAEndocrinologia85(Suppl212):215-219);波形蛋白(YangYC，LiX，ChenW.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai).2006Sep;38(9):602画10);Cox-1和Cox-2(XuZ,ChoudharyS,VoznesenskyO,MehrotraM,WoodardM,HansenM,HerschmanH,PilbeamC.CancerRes.2006Jul1;66(13):6657-64;CervelloM，MontaltoG.WorldJGastroenterol.2006Aug28;12(28):5113國5121)。应该理解，本发明不旨在仅限于检测上文中用于举例而列出的特定肿瘤标志物的自身抗体。基于检测抗肿瘤标志物自身抗体(单标志物或组合测定形式)的本发明测定方法可应用于多种不同的临床状况中。具体地，所述方法可用于检测或诊断有症状或无症状的人类受试者中的癌症，用于评估诊断为癌症的患者的预后，用于预测对治疗的反应，用于监测患者中癌症或其它赘生性疾病的发展，用于检测无症状人类受试者中的早期赘生性变化或早期致癌性变化，用于筛选无症状人类受试者群体以鉴定癌症发生风险升高的受试者或诊断癌症的存在，用于预测癌症患者对抗癌治疗(例如疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学疗法)的反应，用于监测癌症患者对抗癌治疗(例如疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学疗法)的反应，用于在先前诊断为患有癌症且已接受抗癌治疗以减少所存在之癌量的患者中检测复发性疾病，或者用于选择用于特定患者的抗癌治疗(例如疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学疗法)。本发明人一般性地观察到，癌症相关性自身抗体显示与疾病状态正相关(也参阅WO99/58979，其内容以参考方式并入本文)。因此，当本发明方法用于临床应用时，一般将与适当对照相比提高的抗肿瘤标志物自身抗体水平作为癌症疾病状态的指示，除非本文中另有^L明。当所述免疫测定用于诊断人类个体(有癌症症状或无癌症症状)中的癌症时，通常将与"正常"对照个体相比存在升高的自身抗体水平作为所述个体患有癌症的指示。"正常"对照个体将优选为年龄匹配的对照，其基于临床、成像和/或生物化学标准未诊断出任何癌症。该方法十分有用的应用是用于测试已出现癌症症状(例如基于临床、成像和/或生物化学标准)的人类受试者，以帮助作出或证实癌症诊断。当所述免疫测定用于预测癌症患者对抗癌治疗(例如疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学疗法)的反应时，可将与"正常"对照个体相比存在升高的自身抗体水平作为该个体是否很可能响应于该抗癌治疗的指示。"正常"对照个体将优选为年龄匹配的对照，其基于临床、成像和/或生物化学标准未诊断出任何癌症。对于上文列出的每一种治疗，与对照相比的自身抗体水平与治疗可能成功之间的关系可通过观察患者中该治疗的结果来确定，在整个治疗期间对所述患者的自身抗体状态进行监测。接着可使用之前确定的关系，基于对自身抗体状态的评估来预测给定患者中每一种治疗的成功可能性。当所述免疫测定用于监测患者中癌症或其它赘生性疾病的发展时，可将与"正常对照"相比存在升高的自身抗体水平作为该患者中存在癌症的指示。所述"正常对照"可以是基于临床、成像和/或生物化学标准未诊断出任何癌症的对照个体(优选年龄匹配的)中存在的自身抗体水平。或者，所述"正常对照"可以是对在测试中特定患者所确定的"基线，，水平。所述"基线"水平可以是例如首次癌症诊断或复发癌症诊断时存在的自身抗体水平。可将基线水平以上的任何升高视为患者中存在的癌量已经升高的指示，而将基线以下的任何减少视为患者中存在的癌量已经减少的指示。所述"基线"值还可以是例如新治疗开始前的水平。可将自身抗体水平的改变视为有效性的指示。指示对治疗阳性反应的"改变，，方向(即提高或降低)将取决于治疗的确切性质。对于任何给定的治疗而言，例如可通过监测自身抗体水平，与治疗反应的其它临床或生物化学指标进行比较而容易地确定指示阳性结果的自身抗体水平"改变"方向。当所述免疫测定用于筛选无症状人类受试者群体时，它可用于被鉴定为发生癌症的风险升高的受试者，可将与"正常"对照个体相比自身抗体水平升高的个体鉴定为具有发生癌症的"风险"。"正常"对照个体将优选为未鉴定出具有发生癌症的任何诱因或任何显著升高的癌症发生风险的年龄匹配对照。其例外可能是年龄本身是主要风险因素的情况。当所述免疫测定用于筛选无症状人类受试者群体时，它可用于在已发生癌症的受试者中诊断癌症，将与"正常，，对照个体相比具有升高的自身抗体水平的个体评价为患有癌症或某些形式的赘生性变化。所述"正常"对照个体将优选为未鉴定出具有发生癌症的任何诱因或任何显著升高的癌症发生风险的年龄匹配对照。其例外可能是年龄本身是主要风险因素的情况。或者，所述"正常对照，，可以是为所测试的特定患者确定的"基线"水平。所述"基线，，水平可以是例如患者被首次测试并发现具有不高于"正常对照"群体的水平时所存在的自身抗体水平。可将其后针对该基线测定的任何升高视为该个体中存在癌症的指示。因此，所述个体可通过该基线测试而成为其自身的对照，用于进一步的自身抗体测定。当所述免疫测定用于监测癌症患者对抗癌治疗(例如疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗、化学疗法)的反应时，将治疗后存在改变的自身抗体水平视为所述患者已经对该治疗做出阳性反应的指示。可将治疗开始前所取的自身抗体基线水平用于比较目的，以确定治疗是否导致自身抗体水平的升高或降低。可将自身抗体水平的改变视为治疗效果的指示。指示对治疗的阳性反应的"改变"方向(即提高或降低)将取决于治疗的确切性质。对于任何给定的治疗而言，可通过例如监测自身抗体水平，与治疗反应的其它临床或生物化学指示进行比较而容易地确定指示阳性结果的自身抗体水平"改变"方向。本发明方法可用于预测和/或监测个体对基本上任何已知抗癌治疗的反应。例如，这包括人抗体治疗，其中将单克隆或多克隆抗体输注到患者中，一个非限制性的具体实例是利用抗生长因子抗体HerceptinTM(Baselga,J.,D.Tripathy等，JClinOncol"14(3),737-744,1996)进行治疗。天然自身抗体应答的存在可增强或抑制人工注入治疗性抗体的有效性。使用本发明方法，有可能在任何患者或患者群中将对任何抗癌治疗(包括抗体治疗)的应答与治疗前或治疗过程中自身抗体的天然水平相关联。然后可将这一了解反过来用于预测其它患者(或在重复治疗情况下的同一患者)将怎样响应于相同的治疗。当所述免疫测定用于检测复发性疾病时，可将与"正常对照"相比患者中存在升高的自身抗体水平视为疾病已经复发的指示。所述"正常对照"可以是对照个体(优选基于临床、成像和/或生物化学标准未诊断出任何癌症的年龄匹配的对照个体)中存在的自身抗体水平。或者，所述"正常对照"可以是对测试中的特定患者确定的"基线"水平。例如，所述"基线，，水平可以是基于临床、成像和/或生物化学标准在疾病緩和期间存在的自身抗体水平。本发明方法可应用于检测许多不同类型的癌症，其实例为乳腺、膀胱、结肠、前列腺、肺、胰和卵巢的癌症。所述测定可补充现有的筛选31和监控方法。例如，对于原发性乳腺癌的情况，对自身抗体的免疫测定可用于提醒临床医师对乳房X线照片上在X线摄影中不显得可疑的小损伤进行活检，或者比计划更早地来进行胸部成像或重复成像。在临床上，预计本发明的测定方法比目前成功依赖于操作者的显像技术(即乳房造影法和超声)更具目的性并更具再现性。可根据具体的临床应用来修改"组合测定"。用于检测至少p53和HER2-neu(c-erbB2)的自身抗体的抗原组合对许多癌症类型都十分有用，并可任选地补充以用已知与待检测的特定癌症或特定癌症阶段有关联的其它标志物。例如对于乳腺癌，该组合可额外地包括MUCl和/或c-myc和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或乳腺珠蛋白和/或EpCam和/或EGFR和/或细胞角蛋白和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或膜联蛋白11A和/或存活素；而对于膀胱癌，该组可任选地包括MUC1和/或c-mycj对于直肠癌可包括ras和/或APC和/或MUC2;对于前列腺癌可包括PSA和/或BRCA1和/或BRCA2和/或p62;对于卵巢癌可包括BRCA1和/或BRCA2和/或CA125和/或p-HCG和/或激肽释放酶和/或APC;对于肺癌可包括livin和/或存活素和/或EpCam和/或恢复蛋白和/或细胞角蛋白和/或l-myc和/或CEA和/或MUC1和/或恢复蛋白；对于肝癌可包括AFP和/或p-HCG和/或gp78和/或p62和/或存活素。也存在其中p53或HER2-neii不一定必需的其他实施方案。在乳腺癌的情况下，合适的组合可选自以下p53和MUCl，以及任选的HER2-neu和/或c-myc，和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜联蛋白11A和/或细胞角蛋白和/或EpCam;p53和c-myc，以及任选的HER2-neu和/或MUC1和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜联蛋白11A和/或细胞角蛋白和/或EpCam;p53和BRCA1，以及4壬选的c-erB2和/或MUC1和/或c-myc和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或32乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜联蛋白11A和/或细胞角蛋白和/或EpCam;p53和BRCA2,以及4壬选的HER2-neu和/或MUC1和/或c-myc和/或BRCA1和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜联蛋白11A和/或细胞角蛋白和/或EpCam;HER2-neu和MUC1，以及4壬选的p53和/或c-myc,和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜联蛋白11A和/或细胞角蛋白和/或EpCam;HER2-neu和c-myc，以及任选的p53和/或MUC1和/或BRCA1和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜联蛋白11A和/或细胞角蛋白和/或EpCam;HER2-neu和BRCA1，以及4壬选的p53和/或MUC1和/或c-myc和/或BRCA2和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜联蛋白11A和/或细胞角蛋白和/或EpCam;HER2-neu和BRCA2,以及4壬选的p53和/或MUC1和/或c-myc和/或BRCA1和/或PSA和/或NY-ESO-l和/或NY-BR-1和/或EpCam和/或乳腺珠蛋白和/或存活素和/或膜联蛋白11A和/或细胞角蛋白和/或EpCam。这样的组合还可包括p53和/或c-myc和/或NY-ESO-l和/或BRCA2。在直肠癌的情况下，合适的组合例如可选自以下p53和ras，以及4壬选的HER2-neu和/或APC和/或MUC2;p53和APC，以及4壬选的HER2-neu和/或Ras和/或MUC2;Ras和APC,以及4壬选的p53和/或HER2-neu和/或MUC2这样的组合还可包括CEA和/或CA19誦9。在前列腺癌的情况下，合适的组合例如可选自以下p53和PSA，以及4壬选的BRCA1和/或BRCA2和/或HER2-neu和/或p62;HER2-neu和PSA，以及^f壬选的p53和/或BRCA1和/或BRCA2和/或p62。这样的组合还可包括PSMA和/或PSCA和/或激肽释放酶。在卵巢癌的情况下，合适的组合例如可选自以下p53和CA125，以及4壬选的HER2-neu和/或BRCA1和/或BRCA2和/或APC;HER2-neu和CA125，以及任选的p53和/或BRCA1和/或BRCA2和/或APC。这样的组合还可包括膜联蛋白和/或CAGE和/或4-5。在肺癌的情况下，合适的组合例如可选自以下p53和NY-ESO-l，以及任选的其它标志物；HER2、膜联蛋白、livin、存活素、恢复蛋白、MUC1、c画myc、l画myc、CEA、阳CG、CAGE和4-5。当本发明方法用于基于来自不同蛋白质的两种或更多种肿瘤标志物抗原进行"组合测定"时，则该组合中的至少一种抗原必须在本发明的交叉滴定中进行测试，所述测试基于将测试样品的两种或更多种稀释度针对多种不同抗原量进行检测，以形成一系列滴定曲线，其中每种所用测试样品稀释度各一条曲线。优选地，构成该组合中的每种抗原均根据本发明的交叉滴定测定进行测试，并对该组中的每一单个抗原绘制/计算出一系列滴定曲线。本发明还考虑到，用于检测至少一种抗肿瘤标志物抗体的交叉滴定测定可与设计用于检测同一患者样品中至少一种肿瘤标志物蛋白(其与交叉滴定测定中所用的抗原相关或不相关)的测定结合使用。这样，可对单个患者样品平行进行用于抗肿瘤标志物自身抗体的测定及用于肿瘤标志物蛋白的测定。在另一实施方案中，本发明测定方法可用于选择在特定患者中使用的抗癌疫苗。在该实施方案中，使用两种或更多种抗原的组合来检测从患者中取得的体液样品(每种抗原对应于不同的肿瘤标志物蛋白)，以确定患者对每一不同肿瘤标志物蛋白质的免疫应答。对给定肿瘤标志物蛋白的"免疫应答强度"由对使用免疫测定检测的肺瘤标志物蛋白质特异性的癌症相关性自身抗体的存在和/或量来表示；对自身抗体进行定量时，癌症相关性自身抗体的水平越高，免疫应答越强。然后选择鉴定为诱发患者中最强免疫应答或强应答的肿瘤标志物蛋白(即自身抗体水平最高)，以形成用于所述患者的抗癌疫苗的基础。本发明方法的用途不限于检测抗肿瘤自身抗体，虽然所述测定对该目的特别有用。癌症仅是其中自身抗体的检测可用作疾病状态/疾病易感性的生物标志物的一个疾病实例。本发明人已显示，通过使用交叉滴定方法来检测患者样品中的自身抗体可获得显著的优势。因此可以合理地推断，通过使用交叉滴定方法检测作为除癌症以外疾病的生物标志物的自身抗体将会获得类似的优势。因此，所述方法适用于在任何已经显示(或可显示)与自身抗体产生相关的疾病中检测疾病状态或疾病易感性的生物标志物。本发明方法的其它应用包括但不局限于检测作为自身免疫病之生物标志物的自身抗体，所述自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性曱状腺炎(例如桥本甲状腺炎)、自身免疫性胃炎(例如恶性贫血)、自身免疫性肾上腺炎(例如阿狄森氏病)、自身免疫性甲状旁腺功能减退症、自身免疫性糖尿病(例如1型糖尿病)或重症肌无力；在患者样品中筛选导致任何器官机能不全或衰竭的肾病或肝病；以及用于筛选移植后患者样品，以检测是否存在针对疾病组织(其在移植后保留在原位)或针对移植组织的抗体。在本发明的另一方面中提供了在测试样品中检测抗体的方法，所述测试样品包含来自哺乳动物受试者的体液，其中所述抗体针对引入所述哺乳动物受试者中的外源物质，所述方法包括(a)分别使所述测试样品的两种或更多种不同稀释液与对所述抗体具有特异性的多种不同抗原量接触，(b)对于步骤(a)中所使用的测试样品与抗原的每种组合，检测所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量，(c)对步骤(a)中所用的每个测试样品稀释度，绘制或计算出特异性结合量相对于抗原量的各个曲线，其中通过对所述测试样品的至少两种不同稀释度呈现总体为S形的曲线来指示测试样品中存在与测定中所用抗原具有反应性的抗体。在本发明的这一方面，所述交叉滴定方法可用于评估哺乳动物受试者(优选人类受试者)对引入该受试者中的任何外源物质的免疫应答。在一个实施方案中，所述外源物质可以是治疗剂，例如药物或前药，人抗体治疗剂或疫苗。本发明方法可用于评估对患者施用治疗剂是否触发了免疫应答，导致产生对该治疗剂或与该治疗剂一起施用的递送媒介物、赋形剂、载体等成分上的表位具有特异性的抗体。用于本发明该实施方案的抗原可以是合成的或天然存在的。治疗剂的确切性质在本发明中没有限制。在非限制性实施方案中，本发明的方法可用于评估针对合成小分子、天然存在的物质、天然存在或合成产生的生物制剂、或两种或更多种上述物质的任何组合(任选地与赋形剂、载体或送递媒介物组合)的免疫应答。在一个有用的实施方案中，本发明的方法可用于评估对治疗剂或疫苗中非靶部分的免疫应答。"非靶"部分指所施用的治疗剂或疫苗的组成部分，其在治疗剂的情况下不直接形成治疗活性，或在疫苗的情况下不旨在诱发宿主中产生抗体。可存在所述非靶部分，从而例如有利于治疗剂或疫苗的纯化，或可设计用于帮助治疗剂或疫苗的递送、摄取或靶向。这种"非耙"部分的实例包括但不局限于通常附着到重组表达的多肽上的接头或标志物，如生物素标签、组氨酸标签等。36在本发明该方面的另一个实施方案中，所述外源物质可以是感染因子，如真菌、细菌、病毒或寄生虫。将参考以下非限制性试验性实施例进一步理解本发明实施例1-用于在自身抗体测定中产生抗原滴定的最佳血清和抗原浓度(OptimalSerumandAntigenConcentration,OSAAC)的一般性方案可按照与WO99/58978中描述的类似方法，通过重组表达来制备肺瘤标志物抗原的样品。简言之，将编码目标标志物抗原的cDNA克隆进pET21载体(Invitrogen)中，所述载体经过修饰以编码生物素标签和6x组氨酸标签，从而辅助所表达蛋白质的纯化。使所得克隆在合适的细菌宿主细胞(在包含体中)中生长，裂解细菌并变性，并通过镍螯合物亲和柱(Hi-trap，从Amersham购得，按照制造商的方案)回收所表达的抗原。通过在适当緩沖液中透析来将所表达的抗原复性，通过SDS-PAGE、蛋白质印迹和ELISA来评估所表达蛋白质的产量，并在保存前进行定量。除非另有说明，否则用于以下实施例的所有抗原均通过从经修饰的pET21载体中重组表达来制备，因而表达为包含N端生物素化标签(来自pET21)和C端His标签的融合蛋白。许多标志物cDNA(或所编码的蛋白质)的GenBank登录号如下p53:B003596c國myc:V00568HER2(erbB-2)同工型a:NP—0044391.在0.1M碳酸盐緩冲液中将抗原稀释至适当浓度，然后连续稀释以形成半对数滴定范围(见表l)。使用TecanEvolyzer机械手移液操作台将抗原稀释液根据平板布局以50jtl/孔分配在Falcon微量滴定板的行中。盖上平板并在4。C保存48小时。2.使用自动平板洗涤机在PBS+0.1%tween20中洗涤平板一次，然后在面巾纸上轻扣干燥。3.用高盐孵育緩冲液(HSB，PBS+0.5MNaCl+0.1%酪蛋白)以200^1/孔封闭平板卯分钟(于4°C下加盖保存)。4.在封闭孵育过程中，将血清样品解冻、涡旋，并在室温下以HSB中从1/30至1/10,000的半对数系列将其连续稀释在管中。5.在吸水纸上将平板倒空并轻叩干燥。使用电子多通道移液器将稀释的血清样品以50jil/孔分配到微量滴定板的所有孔中，以形成半对数滴定范围(参阅表l)。盖上平板并在室温下摇动孵育90分钟。6.洗涤步骤使用自动平板洗涤机在PBS+0.1%tween20中将平板洗涤3次，然后在吸水纸上轻叩干燥。7.将缀合辣才艮过氧化物酶的兔抗人Ig(Jackson,在HSB中为1/10,000)以50pl/孔分配到微量滴定板的所有孔中。将缀合HRP的兔抗鼠Ig(在HSB+为1/1000)分配到含有抗抗原之抗体的对照孔中。然后将平板在室温摇动孵育1小时。8.如步骤6洗涤平板。9.以50pl/孔加入预先制备的TMB底物，并在桌面上孵育10分钟。轻轻叩击平板以混匀。10.使用标准的平板读数方案在650nm处确定孔的吸光度。表l:标准的平板布局123456789101112A抗原10吗/ml抗原10吗/ml抗原10將/ml抗原10照/ml抗原10fig/ml抗原10|ug/ml血清1/30血清1/100血清1/300血清1/1000血清1/3000血清1/10000B抗原3吗/ml抗原3jig/ml3將/ml抗原3吗/ml抗原3ng/ml抗原3照/ml血清1/30血清1/100血清1/300血清1/1000血清1/3000血清1/10000C抗原1fig/ml抗原lpg/ml抗原1fig/ml抗原1照/ml抗原1ng/ml抗原1fig/ml血清1/30血清1/100血清1/300血清1/1000血清1/3000血清1/10000D抗原0.3ftg/ml抗原0.3照/ml抗原0.03ng/ml抗原0.03抗原0.03抗原0.03血清1/30血清1/100血清1/300jig/mlfig/mlHg/ml血清1/1000血清1/3000血清1/10000E抗原0.1^g/ml抗原0.1照/ml抗原0.1fig/ml抗原0.1fig/ml抗原0.1fig/ml抗原0.1fig/ml血清1/30血清1/100血清l膽血清1/1000血清1/3000血清1/10000F抗原0.03抗原0.03抗原0.03吗/ml抗原0.03抗原0.03抗原0,03fig/ml38<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>使用重复实验的平均值对整个血清稀释度范围内的每个样品构建抗原滴定曲线。通过用每个血清稀释度下无抗原结合时所获得的值减去背景水平(1/10，000的血清并且没有抗原)来计算对应于每个血清稀释度下非特异性结合水平的值。然后将其用于在每组重复实验中校正非特异性结合。实施例2-在原发性乳腺癌中检测自身抗体从初步研究中获得以下数据，以评估一个交叉滴定自身抗体测定组合(OSAAC)在原发性乳腺癌(PBC)中的灵敏度及再现性。研究包括来自无癌症迹象的14名妇女的血清及来自患有原发性乳腺癌的14名妇女的手术前血清样品。正常样品与癌样品是年龄匹配的。使用抗原p53和c-myc，根据实施例1中给出的方案进行测定。两个正常样品(一个用于p53)必须从研究中去除，因为它们在一系列血清和抗原浓度内显示出持久且极高水平的自身抗体结合。图l给出了当交叉滴定测定用于测定血清中p53及c-myc自身抗体时获得的曲线实例。可以看出，对于一些样品(例如样品17179和18781)，获得了与预计一致的最浓血清给出最强信号的一系列滴定。然而在其它样品(例如样品19150和18057)中，曲线基本上是平的，但随血清浓度升高，信号也增强。这被认为是由于血清免疫球蛋白的非特异性结合，并由上文描述的非特异性结合校正来补偿。将自身抗体水平表述为由结合测试抗原所致的光密度(650nm)减去由非特异性结合所致的光密度(650nm)。正常的截取值计算为正常组的95%(均值+2倍标准差)。如果样品在1/30至1/1000之间的至少2个血清稀释度和10ng/ml至1jig/ml之间的2个抗原浓度下显示高于判断值的水平，则认为它们是阳性的。在表2中指出了阳性样品。抗原阳性血清样口口口正常PBCp53J001总计1/14(7%)171791878118237195021892719622p53阳性库7/14(50%)c-mycJ0011717918781J0411823718964p53阳'性库总计2/14(14%)5/14(36%)表2:正常及乳腺癌血清中自身抗体测定的阳性率。如果非特异性结合校正值高于在至少两种抗原浓度和两个血清稀释液下检测的正常样品的均值+2倍SD，则将样品判定为阳性的。实施例3-与仅抗原滴定相比分析交叉滴定测定的灵敏度和特异性使用交叉滴定测定(OSAAC)和仅抗原滴定方法(其中仅在1/100的血清稀释液下进行自身抗体测定)对患有原发性乳腺癌(PBC)的14名妇女进行自身抗体(AAb)测定。如果样品在抗原滴定曲线上10和3网/ml处都高于截取值水平，则认为它们是阳性的。下面表2显示了两种方法的直接比较抗原抗原滴定方法OSAAC测定p53灵敏度5/14(36%)7/14(50%)特异性13/14(93%)13/14(93%)c-myc灵敏度3/14(21%)5/14(36%)特异性12/14(86%)12/14(86%)表3:仅在一个血清稀释度下计算AAb灵敏度的抗原滴定方法与OSAAC测定的比较。40可以看出，通过使用一系列抗原滴定曲线(其中抗原浓度和血清浓度都是变化的)，与其中仅抗原浓度是变化的滴定曲线相比，可获得更高的灵敏度和至少同样好的特异性。用于自身抗体测定的交叉滴定测定(OSAAC)已经显示在检测原发性乳腺癌的灵敏度方面优于基于针对单个血清稀释度滴定抗原的测定。p53和c-myc自身抗体都是这种情况，并且没有理由推测这将不适用于一系列的抗原。不希望受理论的限制，本申请人认为，在基于抗原与测试样品交叉滴定的测定中观察到的更高灵敏度有许多原因。(i)该测定形式具有宽得多的动态范围。这提供了可以同时在高抗原浓度下检测低亲和力抗体以及在高抗原浓度下检测在其他情况下将失真(hook)的高丰度抗体的范围。(ii)可在低血清浓度下检测可能被高水平非特异性结合掩盖的低丰度抗体。(iii)此处应用的用于定义样品为阳性的严格标准(对于至少2个抗原浓度和2个血清稀释度，高于正常群体的均值+2倍SD)意味着技术人员对阳性测定是真阳性可以肯定得多。实施例4-通过抗原交叉滴定检测原发性乳腺癌血清本研究中使用来自患有原发性乳腺癌(PBC，n=8(6个PBC血清在所有抗原之间均相同，2个PBC血清对p53或ECD6蛋白具有特异性))妇女及没有恶性疾病迹象妇女的血清(n=10)。使用实施例1中所述一般性方案的修改形式一式两份地进行测定。简言之，用抗原蛋白包被一组微量滴定板重组p53、ECD6(也已知为HER2胞外结构域)，或ECD63，片段。所述ECD6抗原包含登录号NM—004439所示全长HER2(erbB-2)氨基酸序列的1到647位氨基酸，其;N端生物素化序列和C端His标签融合。所述ECD63'片段抗原包含登录号NMJJ04439所示全长HER2(erbB-2)氨基酸序列的361到647位氨基酸，其与N端生物素化序列和C端His标签融合。以160nM、50nM、16nM、5nM、1.6nM、0.5nM、0.16nM的浓度将抗原连续滴定(由上至下)到每一平板上。在每一平板的最下一行中包括仅为緩冲液的"无抗原"对照。使所述抗原吸附48小时，之后洗涤平板并用含酪蛋白(0.1%w/v)和NaCl(0.5M)的PBS封闭90分钟。在封闭孵育过程中，在试管中以1:1600、1:800、1:400、1:200、1:100和1:50的稀释度制备一组连续血清滴定。去除封闭緩冲液后，将这些稀释液加入到抗原包被的平板中(从平板由左到右加入稀释度1:1600、1:800、1:400、1:200、1:100和1:50)并孵育卯分钟。如实施例1中描述进行测定的其余部分。(平板布局概述于图2)使用重复实验的平均值对血清稀释度范围内的每一样品构建抗原滴定曲线。通过减去非特异性背景(针对0.16nM抗原的血清反应)来获得对应于自身抗体应答水平的值。结果代表性的滴定曲线示于图3至图7中。可以看出，对于一些样品(例如用于ECD6的样品20642和20620)，获得了与预计一致的最浓血清给出最强信号的一系列滴定。然而在其它样品(例如用于ECD63'片段的样品MVV272和EA0220)中，曲线基本上是平的，但随血清浓度升高信号也增强。认为这是由于血清免疫球蛋白的非特异性结合。将阳性截取值计算为正常群体的均值+2倍SD。如果样品在两次运行中及在160nM或50nM抗原浓度下都显示高于截取值的水平，则认为样品是阳性的。表4证明，目前用于自身抗体检测的1:100的血清稀释度不总是最佳的。此外，该表显示，最佳血清稀释度在抗原之间是变化的。当1:50稀释血清时，对ECD6灵敏度的最高水平是75。/。。这与对ECD63，片段相反，后者在1:50下具有0%的灵敏度。其部分原因是由于所分析的正常样品(例如样品MMV272和EAO220)中针对ECD63，片段的信号增强。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表4:对每个抗原针对8个所分析PBC样品的自身抗体测定灵敏度。如果非特异性结合校正值高于在两个抗原浓度中任一浓度下检测的正常样品的均值+2倍SD，则判断样品为阳性的。表5概述了其中将血清稀释到不同浓度的测定的特异性。使用该测定中所分析的样品没有观察到测定特异性的差异。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表5:具有IO个PBC样品的自身抗体测定的特异性。如果非特异性结合校正值高于在两个抗原浓度任一浓度下检测的正常样品的均值+2倍SD，则判断样品为阳性的。在表6中，比较针对所有抗原分析的6个PBC血清的最佳血清稀释度。所述最佳血清稀释度是其中可检测到自身抗体应答的最高稀释度。例如，可将血清20628稀释到1:800,并可检测到针对p53的应答(即自身抗体)，但是同一血清需要稀释到1:50以用于检测ECD6的自身抗体。因此，该抗原的最佳稀释度应该是1:50，使得可鉴定所有阳性的自身抗体应答。每个抗原的最佳稀释度血清P53ECD6ECD63'最佳稀释度20593----20641-1:50-1:5020620-1:16001:16001:160020639--—一206281:8001:50-1:50206421:4001:400_1:400表6:针对所有抗原所分析的6个PBC血清样品的最佳个体间稀释度。其中显示了检测针对P53、ECD6或ECD63，片段的自身抗体应答所需的最低稀释度。表7概括了当使用交叉滴定方法检测针对每一测试抗原的自身抗体时，用于检测原发性乳腺癌的整体测定灵敏度升高。_交叉滴定1:100的血清灵^L66.7%33.3%特异性100%100%表7:使用ECD6和ECD63，片段的整体测定灵敏度和特异性，如果使用交叉滴定测定，来代替针对所有抗原用于6个所分析PBC血清样品的1:100稀释的血清。结论用于自身抗体测定的OSAAC测定已经显示在检测原发性乳腺癌的灵敏度方面优于仅滴定抗原。p53、ECD6和ECD63'自身抗体是这样的情况，并且没有理由推测这会不适用于所有的肿瘤标志物自身抗体。看起来这是由于该测定形式具有宽得多的动态范围这一事实。这提供了同时以高抗原浓度检测低亲和力自身抗体以及以高抗原浓度检测在其他情况下将失真的高丰度抗体的范围。此外，可在低血清浓度下检测可能被高水平非特异性结合掩盖的低丰度自身抗体看起来也是可能的。本文引用的所有专利、专利申请书;5Ul表的参考文献均通过参考整体并入本文。尽管已经参考优选实施方案显示并描述了本发明，但本领域技术人员会理解，在不背离权利要求包括的本发明范围的情况下可对形式和细节进行多种改变。权利要求1.在哺乳动物受试者中检测疾病状态或疾病易感性的方法，所述方法包括检测测试样品中的抗体，其中所述测试样品包含来自所述哺乳动物受试者的体液，并且其中所述抗体是疾病状态或疾病易感性的生物标志物，所述方法包括(a)制备所述测试样品的两种或更多种不同稀释液，并对每个测试样品稀释液进行以下步骤(i)和(ii)(i)使所述测试样品稀释液接触多种不同量的对所述抗体具有特异性的抗原，(ii)对步骤(i)中所用的每个抗原量，检测抗体与抗原之间特异性结合的量，(b)对步骤(a)中所用的每个测试样品稀释液，绘制或计算出特异性结合量相对于抗原量的各个曲线，和(c)对所测试的每个测试样品稀释液和抗原量，基于所述抗体与所述抗原之间特异性结合的量来确定所述疾病状态或疾病易感性的存在与否。2.权利要求l的方法，其中针对所有的测试样品稀释度及所测试抗原量基于特异性结合量的集合值来确定所述疾病状态或疾病易感性的存在与否。3.权利要求1或2的方法，其中通过评估在步骤(c)中获得的曲线中一条或更多条总体为S形的曲线的存在来确定所述疾病状态或疾病易感性的存在与否。4.权利要求3的方法，其中通过在所述测试样品的至少两个不同稀释度下存在总体为S形的曲线来指示所述测试样品中存在所述抗体。5.检测测试样品中抗体的方法，所述测试样品包含来自哺乳动物受试者的体液，其中所述抗体是疾病状态或疾病易感性的生物标志物，所述方法包括(a)制备所述测试样品的两种或更多种不同稀释液，并就每个测试样品稀释液进行以下步骤(i)和(ii):(i)使所述测试样品稀释液接触多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原，(ii)对步骤(i)中所用的每个抗原量，检测抗体与抗原之间特异性结合的量，(b)对步骤(a)中所用的每个测试样品稀释度，绘制或计算出特异性结合量相对于抗原量的各个曲线，其中通过对所述测试样品的至少两种不同稀释度呈现总体为S形的曲线来指示测试样品中存在与测定中所用抗原具有反应性的抗体。6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述抗体是自身抗体。7.权利要求6的方法，其中所述自身抗体对肿瘤标志物蛋白是特异性的。8.权利要求7的方法，其中所述抗原包括肿瘤标志物蛋白或者其抗原性片段或表位。9.权利要求8的方法，其中所述肿瘤标志物蛋白选自MUC1、MUC16、c-myc、EGFR、p53、ras、BRCA1、BRCA2、APC、HER2-neu、PSA、CEA、CA19.9、NY國ESO國l、4-5、CAGE、PSMA、PSCA、EpCam、细胞角蛋白、恢复蛋白、激肽释放酶、膜联蛋白、AFP、b-HCG、GRP78、CA125、乳腺珠蛋白、raf、NY-BR-1、livin、存活素、MUC2、内皮抑制素、Bcl-2、BIRC7、HSP70、No55、uPA、四连蛋白、催乳素、骨桥蛋白、HE4、TATI、抑制素、波形蛋白、cox-l和cox-2。10.权利要求7至9任何一项的方法在癌症诊断、预后或监测中的用途。11.权利要求7至9任何一项的方法在筛选无症状人类受试者群体以鉴定发生癌症风险提高之受试者中的用途，其中待使用所述方法检测的所述样品是从所述受试者中取得的体液样品，并且其中将与正常对照个体相比具有升高的自身抗体水平的受试者鉴定为具有发生癌症的风险。12.权利要求7至9任何一项的方法在检测无症状人类受试者中早期赘生性变化或早期致癌变化中的用途，其中待使用所述方法检测的所述样品是从所述受试者中取得的体液样品，并且其中将与正常对照个体相比存在升高的自身抗体水平作为所述受试者中早期赘生性变化或早期致癌变化的指示。13.权利要求7至9任何一项的方法在筛选无症状人类受试者群体以鉴定已发生癌症之受试者中的用途，其中待使用所述方法检测的所述样品是从所述受试者中取得的体液样品，并且其中与正常对照个体相比具有升高的自身抗体水平的受试者被诊断为患有癌症。14.权利要求7至9任何一项的方法在测试有症状人类受试者群体以鉴定已经发生癌症之受试者中的用途，其中待使用所述方法检测的所述样品是从所述受试者中取得的体液样品，并且其中与正常对照个体相比具有升高的自身抗体水平的受试者被诊断为患有癌症。15.权利要求7至9任何一项的方法在监测患者中癌症或其它赘生性疾病的进程中的用途，其中待使用所述方法检测的所述样品是从人类患者中取得的体液样品，并且其中将与正常对照相比存在升高的自身抗体水平作为所述患者中癌症存在的指示。16.权利要求7至9任何一项的方法在检测先前诊断为患有癌症的人类患者中复发性疾病中的用途，所述患者已进行过抗癌治疗以减少所存在的癌量，其中待使用所述方法检测的所述样品是从所述患者中取得的体液样品，并且其中将与正常对照相比该患者中存在自身抗体水平升高作为所述疾病已经复发的指示。17.权利要求7至9任何一项的方法在评估癌症预后中的用途，其中待使用所述方法检测的所述样品是从人类患者中取得的体液样品，并且其中将与正常对照相比存在升高的自身抗体水平作为该患者具有癌症预后的指示。18.权利要求7至9任何一项的方法在预测对抗癌治疗的应答中的用途，其中待使用所述方法检测的所述样品是从人类患者中取得的体液样品，并且其中将所述患者中的自身抗体水平与先前已经确定的自身抗体水平与治疗的可能结果之间的关系进行比较，用于提供所述患者是否将对该抗癌治疗产生应答的指示。19.权利要求18的用途，其中所述抗癌治疗是疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗或化学疗法。20.权利要求7至9任何一项的方法在监测人类癌症患者对抗癌治疗的应答中的用途，其中待使用所述方法检测的所述样品是从所述患者中取得的体液样品，并且其中将治疗后自身抗体水平的变化作为所述患者是否已经应答于所述治疗的指示。21.根据权利要求20的用途，其中所述治疗是疫苗接种、抗生长因子或信号转导治疗、放射治疗、内分泌治疗、人抗体治疗或化学疗法，并且将治疗后自身抗体水平的变化作为所述患者已经对所述治疗作出积极应答的指示。22.根据权利要求6的方法，其中所述抗体是作为自身免疫病之特征或者与自身免疫病相关的自身抗体。23.根据权利要求22的方法，其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、自身免疫性胃炎、恶性贫血、自身免疫性肾上腺炎、阿狄森氏病、自身免疫性甲状旁腺功能减退症、自身免疫性糖尿病或重症肌无力。24.根据权利要求6的方法，其中所述抗体是作为导致器官机能不全或衰竭之肾病或肝病的特征性的或者与其相关的自身抗体。25.根据权利要求l的方法，其中所述抗体针对移植到所述哺乳动物受试者中的组织上所存在的表位。26.在包含来自哺乳动物受试者的体液的测试样品中检测抗体的方法，其中所述抗体针对引入到所述哺乳动物受试者中的外源物质，所述方法包括(a)制备所述测试样品的两种或更多种不同稀释液，并就每个测试样品稀释液进行以下步骤(i)和(ii):(i)使所述测试样品稀释液接触多个不同量的对所述抗体具有特异性的抗原，(ii)对步骤(i)中所用的每个抗原量，检测抗体与抗原之间特异性结合的量，(b)对步骤(a)中所用的每个测试样品稀释液，绘制或计算出特异性结合量相对于抗原量的各个曲线，其中通过对所述测试样品的至少两个不同稀释液呈现总体为s形的曲线来指示测试样品中存在与测定中所用抗原具有反应性的抗体。27.根据权利要求26的方法，其中所述哺乳动物受试者是人类。28.根据权利要求26或权利要求27的方法，其中所述外源物质是治疗剂。29.根据权利28的方法，其中所述治疗剂是药物、前药或抗体治疗剂。30.根据权利要求26或权利要求27的方法，其中所述外源物质是疫苗。31.根据权利要求28或权利要求29的方法，其中所述外源物质是治疗剂或疫苗的非靶部分。32.根据权利要求31的方法，其中所述非靶部分是生物素。33.根据权利要求26或权利要求27的方法，其中所述外源物质是感染因子，如真菌、细菌、病毒或寄生虫。34.在包含来自哺乳动物受试者的体液的测试样品中检测两种或更多种抗体的方法，其中至少一种所述抗体是疾病状态或疾病易感性的生物标志物，所述方法包括(a)制备所述测试样品的两种或更多种不同稀释液，并就每个测试样品稀释液进行以下步骤(i)和(ii):(i)使所述测试样品稀释液与两组或更多组抗原接触，其中所述抗原组中的每一种对测试样品中待检测抗体之一具有特异性，并且其中每一抗原组包含同一抗原的多种不同量，(ii)对步骤(i)中所用每一抗原组中的每种抗原量，检测抗体与抗原之间特异性结合的量，(b)对步骤(a)中所用的每一抗原组和每种测试样品稀释度，绘制或计算出特异性结合量相对于抗原量的各个曲线，其中测试样品中与任何一组抗原具有反应性之抗体的存在是通过对与该抗原组一起的所述测试样品的至少两种不同稀释度呈现总体为S形的曲线来指示。35.根据权利要求34的方法，其中所述两种或更多种抗体中的至少一种是自身抗体。36.根据权利要求35的方法，其中所述两种或更多种抗体中的至少一种是对肿瘤标志物蛋白具有特异性的自身抗体。全文摘要本发明一般地涉及诊断或预后测定的领域，并特别涉及用于在包含患者体液的样品中检测抗体的测定，其中该抗体用作疾病状态或疾病易感性的生物标志物。所述测定基于待检测抗体的患者体液以及通过特异性结合用于检测所述抗体的抗原之间的交叉滴定。文档编号G01N33/557GK101632020SQ200780039186公开日2010年1月20日申请日期2007年9月12日优先权日2006年9月13日发明者卡罗琳·查普曼,安德烈亚·默里,托尼·巴尔内斯,约翰·福赛思·鲁塞尔·罗伯特森申请人:昂西免疫有限公司