具有可变流速的hplc系统的制作方法

专利名称：具有可变流速的hplc系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及高效液相色谱技术。
背景技术：
在高效液相色谱(HPLC)技术中，通常必须以完全控制的流速(例如，在每分种数 微升到数毫升的范围内)和高压强(一般200-1000bar，目前甚至高到2000bar，在这样的 压强下，液体的压缩性变得显而易见)来提供液体。柱塞泵或活塞泵通常包括一个或多个 被设置用来在相应的泵工作腔(一个或多个)中执行往复运动的柱塞，从而压缩泵工作腔 (一个或多个)内的液体。在流体动力学和流量测定法中，体积流速(在本文称为流速)是 通常在检测点测得的每单位时间穿过给定表面的流体的体积。在同一申请人(AgilentTechnologies)的 EP 0309596 B1 中描述了一种液相色 谱泵送系统，其描述了一种包括用于以高压强来递送液体的双柱塞泵系统的用于液相色谱 技术中的溶剂递送的泵送设备。现代LC-系统面临不断变化的要求。为了增大峰容量(即，每单位时间间隔的峰 的总数)，若干参数被优化，诸如更小尺寸的填充材料、更小内径的柱，溶质分离过程中更快 的线速度、更快的成分组成的梯度、更长的分离床，等等。这些发展中的大多数发展的共同 之处在于它们增大了需要用来驱动液体通过系统的压强降。HPLC系统通常在所谓的梯度模式中操作，在梯度模式中，例如，对于反相色谱技 术，有机物含量随时间斜坡变化(ramp)，对于离子交换色谱技术，盐含量随时间斜坡变化。 尤其在蛋白质组学中，大多数应用基于水/乙腈的梯度。用于运行规定的分析处理的分析方案称为“方法”。在用于梯度分离的分析方案 或方法中，梯度被具体定义为组成变化(例如，随时间％ B)，而对于这样的方法的大多数部 分，流速保持恒定。增大跨越柱的压强降可能导致方法执行接近硬件的技术极限。现代LC系统已经 被设计用于平衡所有给定机构的压强能力。为了防止某些部件压力过大，系统通常被配备 有具有中断特征的压强感应能力，该能力被设计用于在硬件被损坏之前终止操作。通过降低粘度，可以升高柱温度以便获得更多的压强预留空间，从而减少给定柱 的名义压强降。用较小微粒填充的色谱柱容易堵塞，这归因于注射的脏试样的固体材料或者可能 源自封条或阀的微粒和颗粒(abbreviate)。对于色谱技术人员，不从开始就使用保留可用的所有压强是良好的实验室做法。 柱的小堵塞将会使压强升高到中断限以上。当优化方法时，通常约10-20%的可用最大压强 范围不被使用，特别为了避免因暂时超过中断限而引起的测量故障。

发明内容
本发明的目的是提供一种改进的高效液相色谱。该目的由独立权利要求的技术方案来实现。其它实施例由从属权利要求的技术方案阐述。下面具体阐述本发明的实施例。各个小标题仅为了方便理解，而不是用于限制。高效液相色谱系统通常包括分离装置，具有固定相，用于分离流动相中包含的试 样液体的化合物；以及流动相驱动器，用于驱动流动相通过分离装置。根据本发明的实施例，流动相的流速根据控制值的变化而被控制，控制值可以与 流动相的特性或者其中的特性(诸如压强)有关。虽然传统HPLC系统通常遵循以恒定流 速操作的“范例”，但是本发明脱离了这样的范例并且可以响应于例如流动相压强的变化来 改变流速。脱离恒定流速的观念，现在可以能够更好地利用HPLC系统的资源。作为示例， 现在能够例如通过操作流动相驱动器以提供基本恒定的输出压强来(几乎)覆盖流动相驱 动器的所有可用压强范围，所述恒定的输出压强可以被选为最大可用压强或者接近最大可 用压强(例如以便保留一些储备)。HPLC系统可被设计为基本上是自主控制的或者不受外界控制的(freewheeling)， 以使得控制值(例如压强)的变化“自动”引起流速的变化。这例如可以通过(被动地)操 作流动相驱动器使其不受外界控制来实现，从而使得流动相驱动器以给定功率(例如最大 功率)运行。在这样的情况中，流动相压强的变化进而将引起流速的变化。例如，当压强减 小时，不受外界控制的流动相驱动器将留出一些功率来增大流速，结果其然后可以以相同 的功耗更快地运行。应当理解，在如传统HPLC系统中的恒定流速操作模式中，为了确保恒 定的流速，这样的自控能力或不受外界控制的能力通常是被禁用的。替代地，也可以主动地操作流动相驱动器以根据控制值变化的流速来驱动流动 相。在这样的情况中，例如，控制器或控制单元主动控制流动相驱动器以改变流速，进而返 过来以改变流动相压强。在任一种情况中，操作流动相驱动器可以包括以下至少一者响应于控制值的增 大来减小流速；以及响应于控制值的减小来增大流速。在优选实施例中，流速减小和增大 中的至少一者与流速的给定(或设定)值有关。这样的值可以是定义的流速值，例如推荐 的、标定的或者以其它方式定义的用于操作特定类型的固定相的值，例如，针对特定类型的 色谱柱推荐的或最佳的(例如根据Van-Deemter曲线)流速。通常，此定义的流速被设定 以使得最大期望压强降仍在系统能够实现的限度内。在一个实施例中，流速的减小和增大 中的至少一者遵循连续函数、阶梯函数或者这二者的组合。在阶梯函数的情况中，并不是每 次流动相压强的变化都将引起流速的不同值，而是只有当达到另一范围(各个范围被分派 给一定值的流速)时才引起流速的变化。组合的情况可以是当达到一定的最大流速时变平 的连续函数。在某些实施例中，流动相驱动器在递送流动相时以周期性方式工作并且具有周 期。这例如可引起流动相驱动器的组件的往复运动，诸如柱塞在泵工作腔中的往复运动，从 而使得流动相驱动器的周期由往复运动来确定。在这样的实施例中的流动相驱动器然后被 操作以仅对具有比周期大的时间常数的这样的控制值的变化进行响应。因此，可以确保流 速不追随因流动相驱动器本身引起的压强变化。所述时间常数优选地被选为大于流动相驱 动器的周期性操作而产生的波动(ripple)或脉动(pulsation)。在流动相驱动器包括致动器的情况中，流动相的流速可以通过监控流动相驱动器 的致动器的驱动速度来确定。在流动相驱动器包括柱塞泵的情况中，流速可以通过监控柱
7塞泵的位移速率来确定(例如在前述EP0309596 B1中所公开的)。在流动相驱动器包括前 馈泵的情况中，流速可以通过读取命令的值来确定。在流动相驱动器包括流量传感器的情 况中，流速可以通过由流量传感器测量实际流速来确定。在系统包括质量流量传感器的情 况中，流速可以通过由质量流量传感器测量质量流量来确定。流动相的流速可以在流动相驱动器的出口处、在穿过分离装置之前、在穿过分离 装置之后、在检测点处、在高效液相色谱系统的出口处被确定(例如作为质量流量)，或者 以它们的任意组合来确定。在一个实施例中，例如在分析运行的时间期间，流动相驱动器被操作以将控制值 维持为基本恒定或者至少在给定范围内。如上所指出的，这可以允许操作流动相驱动器以 使其以一定压强(例如最大压强，最大压强可以是具有或不具有一定安全限的流动相驱动 器的最大可实现压强)递送流动相(以确保小压强增大-例如以比控制系统的响应时间更 短的时间常数_将不会引起不规律，例如测量故障、中断等)。这样的在恒定/最大压强的操 作进而引起用于分离试样液体的某些化合物所需的分析时间减少。此外，这可以确保流动 相压强将不会超过其设定的控制值(在设置期间或短期的压强波动产生的一定界限内)， 从而使得需要较少的安全限并且因此可以以更高的控制值来操作流动相驱动器。某些柱可 以具有比来自驱动器的可实现压强更低的压强限。在这样的情况中，压强可以被控制到针 对柱所最初指定的水平。在一个实施例中，可以在如下压强下操作流动相驱动器，该压强被 调节以使得跨越柱留出特定压强降，其可以是系统压强的子部分。在某些实施例中，控制值是如下内容或与如下内容有关流动相中的压强(诸如 (通过压强传感器)实际测量的或者以其它方式确定的压强)、压强差(诸如沿着固定相或 分离装置的压强差)、流动相驱动器的控制参数(诸如用于驱动泵的电流、电压和功率)、与 流动相的粘度有关的值，或者它们的任意组合。在流动相驱动器的控制参数的情况中，驱动 泵的电流、电压或功率的变化通常指示泵的负荷，或者换句话，指示驱动流动相通过固定相 所需的压强降。在优选实施例中，控制值与如下处的流动相的(实际)压强有关流动相驱动器的 出口处、试样液体被引入流动相的注射点处、固定相或分离装置的入口区域处(这里流动 相首先进入固定相，在固定相包括色谱柱的情况中，优选为柱的头部)、固定相或分离装置 的出口区域处(这里流动相离开固定相，在固定相包括色谱柱的情况中，优选为柱出口)、 以及它们的组合。梯度操作操作流动相驱动器以将控制值维持为基本恒定或者在给定范围内还被证明当在 梯度模式下运行HPLC系统时(即，当流动相的组成随时间变化时)特别有用。在梯度模 式中，通常流动相包括不同的溶剂组分，不同溶剂组分的比率随时间变化。作为在反相 HPLC中的一个示例，流动相可以是水和乙腈的混合物，在给定时间段中，水对乙腈的比率从 100%改变到0%，这可以是按照不断改变陡峭程度的一系列连续斜率而连续改变的，或者 有时是以比率阶梯的方式改变的。在这样的梯度模式中，流动相的粘度还可以根据流动相 的组成而改变。在水和乙腈的示例中，水的粘度几乎为乙腈的粘度的两倍。然而，粘度的改 变通常也会引起驱动流动相通过固定相所需的压强的改变。当操作流动相驱动器以维持压 强时，粘度的减小允许流速增大，从而导致更短的分离时间。
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基于时间的控制在一个实施例中，HPLC系统基于具有时钟周期的时钟循环而被控制。HPLC系统 可以具有一个中央时钟或者若干时钟，时钟循环从中央时钟或者若干时钟中的一个时钟导 出。在当今的大多数应用中，用于运行一定分离的方法是基于恒定流速建立的。此方法然 后被以针对每个方法步骤定义的时间标记而被编程。在本发明的这样的实施例中，时钟周期根据系统的控制值的变化而改变。这样的 控制值可以与如下内容有关流动相的特性、流动相的压强、压强差(优选为沿着固定相或 分离装置的压强差)、流动相驱动器的控制参数(诸如用于驱动泵的电流、电压和/或功 率)和/或与在给定的实际组成下流动相的粘度有关的值。在一个实施例中，流动相的流速通过根据控制值的变化改变时钟周期而被控制。 这允许通过改变时钟周期来将例如被设计用于恒定流速的方法改造为适用于本发明的实 施例。内部温度升高本发明的实施例可以被控制以实现恒定的内部温度和/或恒定的内部温度升高。 对于约束较大的柱(例如，以较小的dp (参见http://hole, chem. shu. edu/HPLC/glossary/ g or. html)、微粒填充的)，流速和压强降的乘积形成足以充分地升高柱的内部温度的高的 水能。依赖于柱的几何形状以及材料(热导率)，其将会在横跨柱(径向)以及沿着柱(轴 向)产生充分的温度梯度。在本优选实施例中，流动相的流速被控制以使得或者柱中转换 得到的水能被保持恒定(例如参见相同申请人的W02006032304)，或者测得的温度相关信 号保持恒定。设备本发明的实施例可以基于最常规的HPLC系统来实现，此HPLC系统诸如是Agilent 1200系列Rapid Resolution LC系统或者Agilent 1100 HPLC系列(二者都由申请人 Agilent Technologies提供-参见www. aRilent. com-其通过引用被结合于此)。一个实施例包括泵送设备，泵送设备包括用于在泵工作腔中往复以将泵工作腔中 的液体压缩到液体的压缩性变得显而易见的高压强的柱塞。一个实施例包括两个泵送设备，这两个泵送设备或者以串联方式耦合或者以并联 方式耦合。在串联方式中，如在前述EP 309596 A1中所公开的，第一泵送设备的出口耦合 到第二泵送设备的入口，并且第二泵送设备的出口提供泵的出口。EP 309596 A1的教导中 有关这样的串联式双泵的操作和实施例通过引用被结合于此。在并联方式中，第一泵送设 备的入口耦合到第二泵送设备的入口，并且第一泵送设备的出口耦合到第二泵送设备的出 口，从而提供泵的出口。在任一种情况中，第一泵送设备的液体出口相对于第二泵送设备的 液体出口都被相偏移，优选地基本上为180度，以使得仅有一个泵送设备正在向设备供给， 而另一个正在引入液体(例如从供给装置)，从而使得能够在出口处提供连续的流量。然 而，很清楚，至少在某些过渡阶段期间，这两个泵送设备也都可以并行地(即，同时)操作例 如以提供泵设备之间(更)平滑的泵周期过渡。相偏移可以被改变，以便补偿因液体的压 缩性而产生的液体流量中的脉动。还已知，也可以利用具有约120度的相偏移的三个柱塞 泵。分离装置优选地包括提供固定相的色谱柱。
流动相可以包括类似甲醇或乙腈的有机溶剂，通常用水稀释。对于梯度操作，水和 有机物在单独的瓶中被递送，梯度泵从这些瓶向系统提供编程的混合物。其它通常使用的 溶剂可以是异丙醇、THF、己烷、乙醇和/或它们的任意组合或者这些与前述溶剂的任意组
1=1 o试样液体可以包括任何类型处理液、例如果汁的天然试样、例如血浆的体液，或者 其可以是例如发酵反应的结果。流动相中的压强的范围可以从200bar到2000bar，并且特别是500bar到 1500bar。HPLC系统还可以包括采样单元，用于将试样液体引入移动相流中；检测器，用于 检测试样液体的经分离的化合物；分级单元(fractionatingimit)，用于输出经分离的试 样液体的化合物，或者它们的任意组合。HPLC系统的进一步的细节将针对Agilent 1200系 列Rapid Resolution LC系统或者Agilent 1100 HPLC系列来公开，上述二个系列由申请 人AgilentTechnologies在www. aRilent. com下提供，其通过引用被结合于此。RS-泵送，梯度转变在一个实施例中，HPLC系统可以包括等梯度(isocratic)系统。由于其内部体积， 当压强改变时流出物可能被打断。例如，如果在试样注射中下游系统至少暂时改变限制，则 恒定流量操作将导致相应的压强改变。这样的压强改变，尤其当是急剧的和/或动态的时， 对内部体积中的可压缩液体发生作用。结果，体积流出物至少暂时不同于柱塞的位移体积。 此差异可以称为虚拟流量，其受制于使用的溶剂、泵周期阶段、环境温度和使用的泵硬件的 技术灵活性。这与在“压强模式”中操作泵时不同，在压强模式中，压强的改变将由相应的 流量改变(即，临时流速的改变)抵消。在最佳模式中，没有或者基本没有虚拟流量引入， 而是只有活动位移被控制，活动位移在大小上可以例如通过记录马达的运动来确切得知。在一个实施例中，HPLC系统是梯度系统，能够混合溶剂，通常用在时间编程的模式 中。通常，术语“梯度”定义斜坡改变的溶剂组成，这由所谓的时间表(TTBL)中的条目来定 义。准备可变流量的泵送系统需要将此TTBL从基于时间的机制转变成体积机制，尤其是为 了允许比较诸如保留时间之类的分离的结果。可以计算体积表，体积表是将流量设置作为 已知的转换因子从时间表生成。按照这种方式，体积表可被计算，就好像流量被恒定保持在 方法中所给定的值。在执行期间，时间表将不再起作用。在最小时段中，流量被转换(积分) 以形成“总的泵送的体积”，然后“总的泵送的体积”可以作为例如体积梯度程序的x轴。对 于常规时间表的条目间的任何时间点，可以计算出针对经过转换的条目间的任何体积点的 实际组成。原理上，当随时间测量时，利用恒定流量操作，这样的程序可以形成相同的梯度。 然而，此概念的优点在于其可以不再需要用来保持流量恒定。在层级方法中，二级时间表可 以被编程来定义流量随时间的改变。体积组成仍然将遵循原先编程在具有恒定流量的时间 表中的梯度。如果现在能够在不影响根据总体积的梯度洗脱的情况下定义流量改变，则当通过 保留体积而非保留时间进行识别时，仍然可以再现峰。二者的关联可以是针对恒定流量模 式的原始设置。如果梯度模式的执行独立于实际流速，则允许通过例如调节流速以利用特定压强 来优化该系统的分析速度。所述压强可以是系统能够采用或者生成的最大压强。例如，这CN 101855548 A
说明书
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可以通过当跨越柱的压强降随时间增大时减小流速来实现，这使得能够以压强的能力的极 限或者接近极限来运行。例如，在过度增大压强降的情况中，需要终止测量序列，但是系统 可以以降低的流速设置来工作。优选地，HPLC系统可以调节流速以(例如，准确地)在固定压强下进行操作，而独 立于实际粘度。所以，有机物(例如，乙腈)越高，体积流量以及因此的线速度可以增大。对 于给定的压强限，按照此种方式，可以实现最佳的速度，这又可以在给定运行时间约束下提
高/最大化吞吐量。在方法发展期间，色谱法可以保持“历史状态”，利用恒定流量来优化梯度形状。可 以利用此容易地进行预测和工作，因为分离的预测仍然是容易的。但是在重负荷时间，设备 可以执行优化操作，以例如利用最大可能的分离速度(所谓“快速分离”-RS-或者RSLC)进 行操作。为了在优选实施例中启动速度增强，操作员例如可以通过指定所允许的系统压强 来切换到“RS模式”。即使在等梯度模式中，也可以获得速度，因为流量可以按照压强限所 允许的而尽可能高。有时，柱是在没有安装炉子的环境条件下在空气中被操作的(目的是为了在10°C 到高达100°c的温度下提供针对柱的定义的温度环境)。环境温度可影响粘度，例如，对 于含水的液体为 2% /°C。所以，例如，在过夜的操作中估计5°C的温度降可将压强提高 10%。在恒定流速maxim下操作的传统HPLC系统中，操作员将通常保持远离压强限，至 少在开始起动测量序列时是这样。在连续运行的过程期间，压强降可能改变。此外，污物和 微粒随时间的的聚集可能部分地阻碍柱筛板(column frit)，这简单地意味着压强随着多 次运行的过程而升高。为了保持安全并且不因压强误差而中断序列，传统HPLC系统的用户 通常将会留出10-20%的预留空间。在本发明的实施例中不需要这样的预留空间。这进而 可以使得(例如，已经在稳定的条件下并且等梯度操作)通过此预留空间来增大分析速度， 例如本实施例约10-20%，即使没有发生粘度改变也能如此。另一优点可以是与安全结果有 关的风险降低。例如，替代例如在柱被慢慢堵塞时因压强原因中断序列，本发明的实施例使 得能够正好以较低的速度继续操作。现代二微米以下填充材料的发展趋势已经使得能够在选择流速方面具有更大的 灵活性。Flat Van Deemter曲线指示较高线速度时的分离度仍然是可接受的，并且当流速 增大或者甚至被调制时，分离度可随着体积再现。在具有层级方法的一个实施例中，流量时间表作为实时程序被执行，而组成时间 表作为基于体积的表被执行。按照此种方式，系统中的控制值的变化一次被确定，并且相应 的流量改变被馈送到该方法。保留体积本发明的一个实施例包括确定(例如通过适当分析单元，该适当分析单元考虑预 测的、测量的或者以其它方式得到的流量信息)保留体积的值，所述保留体积表示洗脱至 少通过分离装置的试样液体的各种化合物所需的流动相的体积。然后流动相驱动器基于所 确定的保留体积的值被操作(例如，通过适当控制单元)。这利用了保留体积的概念，而不 是保留时间，如在本文将更详细说明的。
在传统液相色谱技术(LC或HPLC)中，数据评价通常基于时间轴。这可以从名称、 表达以及单位清楚可见，例如，保留时间(Rt)、在检测器中出现峰的运行时间，或者峰面积 (通常以mAU*sec为单位确定)、从开始到结束的峰积分得到的吸光率信号。在大多数HPLC 分离中，在分数(sub-digit)百分比范围内实现再现性是一个质量方面。这导致需要所有 影响因素被控制到更好的精确性。虽然基于时间的HPLC测量看起来容易，仅仅是因为其是众所周知的并且是可精 确测量的因素，但是当用于数据评估时可以发现其局限性。只有流动相驱动器的体积流速 是已知的、恒定的并且精确的，才存在固定时间，在此固定时间，例如在检测器位置处出现 特定的峰(与试样液体的一特定化合物相关)。这对于定量结果也是成立的，所述定量结果 是从峰面积计算出的浓度。在过去，HPLC检测器的信号是模拟输出信号。此信号将被路由到一种带状图表记 录仪，带状图表记录仪开始对来自注射阀的触发脉冲进行记录。为了获得图表中峰出现的 精确时间(Rt)，必须精确知道流速，尤其是当比较来自不同系统的结果时更是如此。保留时间不仅依赖于流速，而且依赖于例如固定相(例如柱)的类型和几何形状， 其温度和流动相组成。虽然固定相类型和几何形状是很稳定的参数，但是温度、溶剂组成和 流速可能发生变化。使用精确的硬件和反馈控制来在分析运行中精确地定义这些参数以前 是必须的。通过操作资格测试或者甚至系统适合性测试来确保适当性能是良好的实验室做 法。但是通常，个别的参数是不能直接控制的，因为没有用适当的传感器，或者有时反馈控 制不稳定或者太慢和/或太贵。根据本发明的实施例，针对保留体积的概念，某些(优选地为全部)仪器部件将它 们的内部数据分发给分析单元。此数据然后被用于提取分析结果。尤其是，流动相驱动器 (例如泵系统)可以不仅仅生成用于监控的压强迹线，而是也可以具有用于流速的数据信 道以及其它相关信息，例如溶剂组成、总体积。来自分析装置(例如柱)的分析数据可以被 添加，诸如保留因子以及随溶剂组成的洗脱强度。数据评估现在可以考虑附加的迹线以适 应运行时间条件以及关联结果以便校正某些改变。考虑压强波动，例如，如果溶剂组成仍然准确，这样的波动在5-10%的水平是可接 受的。但是对于传统的基于时间的峰面积计算，如果峰洗脱在波动的高部分，与在低部分相 比，通常的峰积分现在计算出不同的浓度。第一近似中的流速是所施加的压强的直接结果，这意味着，在压强波动的情况中， 流速也具有波动。例如，流速高2%，则峰面积(通常以mAU*sec为单位定义)被计算为小 2%。考虑到作为依赖于浓度的信号的吸光率，强度(例如峰高度)不改变，但是峰在时间 上的分布依赖于物质的速度。越高的流速使得物质以越高的线速度通过检测器，使其看起 来较窄，从而读出较低的峰面积。优选实施例可以包括允许进行精确测量和/或确定流速的精确流量测量操作(通 常在流动相的流路内的某点内确定)。完全将这些数据分发给分析单元可以支持监控、诊断 和/或错误处理以外的功能。如果这些流量数据合并在一起，则可以计算出基于实际体积 的保留。然后可以通过特征性保留体积识别出峰(结合或者替代相应的保留时间)。这样 的流量测量装置可以如EP 1777515或US 11/880193 (2007年7月20日提交)所公开的那样来实现，这些文档中有关流量测量装置的教导通过引用被结合于此。为了结合类似LC-积分器的现有数据分析工具，实施例可以将例如吸光率和流量 的单个数据结合成一维结构。作为一个简单示例，吸光率vs.时间可以与流量vs.时间结 合形成用于吸光率vs.体积的迹线。假定一虚构的但是恒定的流量值，此吸光率vs.体积 可以容易地被转换回吸光率vs.时间，以使得能够通过传统系统(例如积分器)来处理数 据。这样的处理可以是例如吸光率检测器的积分功能，吸光率检测器然后接收从泵系统或 单独的流量传感器读取的流量，以在生成原始数据文件之前执行转换。在一个实施例中，将保留体积与例如从之前的校准、之前的基准分析得出的或者 通过参考来自之前的分析实验的结果得到的各种条件关联起来。在一个实施例中，保留体积与系统的洗脱强度有关。洗脱强度可以通过温度、流动 相组成中的至少一个以及固定相、分离装置中的至少一个的特征，以及随溶剂组成的洗脱 强度(称为所感兴趣的试样组分的“吸收等温线”)来确定。这些运行时间参数可以直接测 量或者可以从模型或测量预测得到。按照此种方式，数据评价纠正了轻微的相关操作参数 的偏离，例如，在较高温度和/或有机物试样组分可以在较小的体积被洗脱。在一个实施例中，保留体积与流动相的溶剂组分有关。特别地，在溶剂组分随时间 改变的情况中此体积可以是随时间的体积。这涉及包括两个或更多个分离的流动相驱动器 (例如用于水和有机溶剂)的系统。替代通过通过特定有机组分的洗脱体积来识别峰，将各 个单独的流动相的流相结合可能是有益的。在一个实施例中，保留体积与包括一种或多种不同溶剂组分的流动相的总体积有 关。特别地，在流速随时间改变的情况中此总体积可以是随时间积分的流速。保留体积的值可以基于流速随时间积分的值(优选地在与试样液体引入流动相 以及从固定相洗脱出试样液体的至少一种化合物有关的时间段中积分的流速)来确定，因 为这代表了将试样化合物运送通过分离装置所需的液体量。替代地或者相结合，保留体积的值可以基于由多种溶剂组分构成的流动相的组成 或者组成随时间的变化(优选地多种溶剂组分的比率随时间的变化)来确定。替代地或者相结合，保留体积的值可以基于分离装置中的流动相的温度(优选地 温度随时间的变化)来确定。尤其当常规大小的分离装置(4. 6mm的柱)被以小微粒填充 时，在较高压强下运行的填料由于摩擦生热而可能增大内部温度(内部温度升高)。—般而言，应当理解，术语是“保留时间”是由结合定义分离模式的方法测得的实 际时间(例如当某个峰出现时)定义的。这意味着不同方法对于相同组分可能产生不同的 保留时间。因此，术语“保留体积”是由结合定义分离模式的方法计算和/或测得的流动相 的实际体积(例如，当某个峰出现时)定义的，所以不同的方法对于相同的组分可能产生不 同的保留体积。在梯度模式中尤其如此，其中，保留强烈地依赖于形成流动相的溶剂的实际 比率。本发明可以部分或者全部由一个或多个适当的软件程序来实现或支持，这些程序 可以存储在任何种类的数据载体上或者以其他方式由任何种类的数据载体提供，这些程序 可以在任何适当的数据处理单元中被执行或者被任何适当的数据处理单元执行。


通过参考下面结合附图的更详细的实施例的描述，本发明的其它目的和许多附带 的优点将会被容易地认识到并且被更好地理解。实质上或者功能上等同或类似的特征将以 相同的标号(一个或多个)来指代。图1示出根据本发明的实施例的例如用在高效液相色谱技术(HPLC)中的液体分 离系统10。图2-3示出泵20的基本实施例。图4A示出对于主动操作的实施例，并且图4B指示响应于压强改变的流速的变化。图5示出组成梯度的示例。图6A-6F图示出时间域和体积域分析。图7示出一个实施例，其中，HPLC系统10基于具有可变时钟周期的时钟循环而被控制。
具体实施例方式在图1中，泵20 (作为流动相驱动器，可以被实现为如在图2-3中所图示那样)驱 动流动相通过包括固定相的分离装置30 (诸如色谱柱)。可以在泵20和分离装置30之间 设置采样单元40，以便将试样液体引入流动相。分离装置30的固定相适用于分离试样液体 中的化合物。检测器50被设置用于检测分离出的试样液体的化合物。分级单元60可以被 设置用于输出分离出的试样液体的化合物。在图2的串联双柱塞泵中，第一泵送设备200A在其输入端被耦合到液体供给装置 205(其可以是一个或多个贮液器，例如，以便允许包括多个不同溶剂的流动相，其组成可以 被控制为随时间变化(如在梯度模式中))，并且其输出端耦合到第二泵送设备200B的输入 端。为了提供连续流动的液体，第一泵送设备200A的泵容量可以大于第二泵送设备200B的 泵容量，以使得第一泵送设备200A将其一部分转移的体积直接供给到系统210 (其可以是 图1的系统10，当然，没有泵20)，并且余下的部分在其向后冲击中被供给到第二泵送设备 200B，第二泵送设备200B然后在第一泵送设备200A的引入阶段在向前冲击中供应给系统 210。第一泵设备200A与第二泵送设备200B的泵容量的比率优选为2 1，但是也可以相 应地应用任何其它有意义的比率。有关泵的配置和构造的进一步的细节以及这样的双串联 泵的操作模式在前面提到的EP 309596 A1中被公开，并且该申请将通过引用被结合于此。在图3的并联双泵中，第一泵送设备300和第二泵送设备310的输入端并联耦合 到液体供给装置205，并且这两个泵送设备300和310的输出端并联耦合到以高压强接收 液体的系统210。这两个泵送设备300和310通常以基本180度的相位偏移来操作，从而 使得任何时间只有一个泵送设备在向系统进行供给，而另外一个正在从供给装置205引入 液体。然而，很清楚，这两个泵送设备300和310至少在某过渡阶段还可以并列地(即同时 地)在向前冲击中进行操作，例如以便提供泵设备之间的(更)平滑的泵周期过渡。如在图2和图3中的原理图所示，泵设备200A、200B、300和310中的每个优选地 被配置为往复泵。如图2中示例性图示，对于泵送设备200B，泵送设备200B包括柱塞或活 塞220 (通常被可以通过柱塞杆225耦合到柱塞220的驱动器(未示出)来驱动)，柱塞或 活塞220被布置用于在相应的泵工作腔230中执行往复运动，从而在其向前冲击期间压缩 泵工作腔230中的液体。一个或多个封条可以被用于密封特别是诸如柱塞220相对泵工作腔230的运动部分。此外，一个或多个阀250可被用于控制液体流动的方向。由泵20施加 的压强通常范围在200-1000bar，并且当前甚至大到2500bar。此压强下的液体的压缩性变 得显而易见，并且可引起脉动效果，这是必然要遇到的。通常的流速在每分钟数微升到数毫 升的范围内。再转到图1，根据本发明的实施例，流动相的流速可以根据例如与流动相中的压强 有关的控制值的变化来控制，这使得能够响应于流动相(即压强)来改变流速。为此目的， 系统10可被设计为基本上是自主控制的或者不受外界控制的，从而使得压强的变化“自动 地”引起流速的变化。这例如可以通过(被动地)把泵20操作为不受外界控制来实现，以 使得泵20以给定功率(例如最大功率)运行。在这样的情况中，流动相压强的变化进而引 起流速的变化。例如，当压强减小时，不受外界控制的泵20然后将增大速度并且从而增大 流速，这样其然后可以相同的功耗更快运行。图4A示出一个替代实施例，其中泵20被主动操作来以根据控制值变化的流速来 驱动流动相。例如，在流动相压强变化时，控制单元400主动控制泵20以改变流速。在图4 中，控制单元400耦合到液体分离系统10以接收(标号410)来自系统10的数据以及进而 控制(标号420)系统10。系统10或控制单元400，或者二者，可包括数据输出，在图4中 用标号430表示控制单元400的数据输出，用标号440表示系统10的数据输出。在图4A的实施例以及在不受外界控制的情况中，流动泵20被操作以响应于控制 值的增大来减小流速，以及响应于控制值的减小来增大流速。这样的流速减小和增大可与 流速的给定值有关，所述给定值诸如是规定的用于特定类型的色谱柱30的流速值。在泵20以周期性方式工作的情况中(如在图2和3的实施例中)，周期(当递送 流动相时)从柱塞220的往复运动得出。在优选实施例中，泵20被操作以仅对具有比周期 大的时间常数的控制值的变化进行响应。因此，可以确保流速不会追随因泵20本身而引起 的压强变化。所述时间常数优选地被选为大于从泵20的周期性操作中得出的波动和脉动。图4B示出一个示例，其中，压强470随着时间减小，并且流速480进而随着时间增 大。在本示例中，用于改变流速480的时间常数(如由阶梯增大所指示)被选为大于从泵 20的周期性操作得出的波动和脉动(标号490指示这样的波动)流动相的流速可以在穿过柱30之前(图1中标号72)、在穿过柱30之后(图1中 标号74)、在泵20的出口 70处、在高效液相色谱系统的出口(诸如分级器60)处或者其任 意组合处确定(参见图1-3)。控制单元400 (图4A)从HPLC系统10接收控制值，其例如是流动相中的压强或者 与其有关。虽然控制值优选地是诸如流动相中的压强的实际测量值(例如，通过本领域的 已知的任何种类的压强传感器(在图中未示出)测量)，但是应当理解，显示出对流动相特 性的依赖性的任何其它参数可在用于控制流速时用作控制值。示例可以是沿着柱30的压 强差(例如在72和74之间测量的)，或者与流动相的粘度有关的值。替代地，控制值可以从泵20的控制参数导出，诸如用于驱动泵20的电流、电压和 功率。用于驱动泵20的电流、电压或功率的变化通常指示泵20的负荷，或者换句话，指示 用于驱动流动相通过分离装置30中的固定相所需的压强降。因为流动相是“分布式的”并且还沿着HPLC系统10改变(例如，点72处的压强 是由泵20提供的“系统压强”，例如600bar，而在柱30后点74处的压强实际上是常压)，对于与控制值相关的位置，可以有多种选择。这样的位置可以是泵20的出口 70、采样单元40 的注射点、柱20的入口区域72 (优选地为柱的头部)、柱20的出口区域，或者它们的组合。在优选实施例中，控制单元400操作泵20以维持控制值基本恒定，或者至少在给 定范围内，以使得泵20将在某压强(例如，具有或者不具有一定安全限的泵20的最大可实 现压强)下递送流动相(例如在输出70处)。这样在恒定/最大压强下的操作进而可使得 分析时间减少，正如稍后示出的，尤其是当在梯度模式中运行HPLC系统时，即当流动相的 组成随时间变化时。在梯度模式中，流动相包括不同溶剂组分，不同溶剂组分的比率随时间 变化。图5示出水和乙腈的组成梯度的示例，水相对乙腈的比率在给定的一段时间中从 100%阶梯式地变化为0%。X轴示出以分钟为单位的时间，并且y轴表示(在泵20的输出 70处)驱动流动相通过系统210所需的压强。每个梯度级下面的数字指示水中的乙腈的百 分比，在本示例中，使得在时间0处流动相为100%的水，在6分钟之后，比率为50%的水和 50%的乙腈，并且在11分钟处，流动相为100%的乙腈。在此梯度示例中，流动相的粘度也 在改变。粘度依赖于流动相的组成。这可以从图5中用于以恒定流速驱动流动相所需的压 强的改变看出。如从图5中很明显，用于驱动纯水的压强是用于驱动纯乙腈的压强的两倍； 因此，水的粘度是乙腈的粘度的两倍。当操作泵20以提供基本恒定的输出压强时，粘度的减小进而引起流速的增大，从 而导致更短的分离时间，如下面针对图6A-6F所图示的。图6A描述示出溶剂B随时间t的 百分比变化的示例性组成梯度的过程。图6B示出与图6A中相同的组成梯度，然而被描述 为溶剂B随流过例如柱30后点74处的流动相的体积V的百分比变化。换句话说，假定给 定流量值则允许将6A转换成6B，图6A示出“时间域”中的梯度，而图6B示出“体积域”中 的梯度。图6C示出针对图6A的梯度的粘度n的变化过程，其还对应于驱动流动相所需的 压强P。虽然实线描绘流速被保持恒定的情况中的压强P的变化过程(因为这将是遵循恒 定流速范例的大多数现有系统中的优选操作方式)，但是虚线和实线之间的区域指示“潜在 的”或“未使用的”压强资源。为了便于引用，时间tf将表示根据图6A编程的并且以恒定流速操作的HPLC系统 方法应当完结的时间点。在时间tf处，V0体积的流动相已经穿过柱30并且应当表示用于 洗脱来自柱30的试样液体的流动相的体积(由具体HPLC方法定义)。根据本发明的实施例，泵20被操作以在最大压强下进行提供，因此遵循图6C中的 虚线。因此，用于图6C的示例中的虚线过程的流速不保持恒定，而是基本上沿着图6F的虚 线过程所示。图6F原则性描绘流速Q随时间t变化的过程。图6F中的直线示出遵循恒定 流速范例的流速，这对应于图6C中压强的实线过程。图6F中虚线和直线之间的区域也可 以被解释为恒定流速范例中对于HPLC分析的“加速空间”。在体积域表示中，图6E描绘对于体积V的所执行的流量或者可能的流量Q，其中 V0表示在图6C中的直线过程下的区域。图6G最后示出与图6C和6F中的虚线对应的组成梯度的(溶剂B的百分比)随 时间t的变化过程。时间tv指示已经有V0体积的流动相穿过柱的时间点，所述体积V0与 根据图6F的过程在时间点tf.之前穿过柱30的体积相同。对于图6F中的直线过程，因为流速增大，所以tv出现在tf之前，以使得时间差tf-tv表示由箭头600指示的速度提高。体积V0在图6F中被指示为tf之前的曲线下的阴影区域。RS-泵送在一个实施例中，控制单元400计算体积表，体积表是以流量设定点作为已知的 转换因子而从时间表生成的。在执行期间，时间表不再起作用。在最小时间段中，流量被转 换(积分)以形成“总的泵送的体积”，然后“总的泵送的体积”可以作为例如正在体积域中 活动的梯度程序的x轴。对于时间表的条目间的任何时间点(即，支持点)，可以计算出针 对经过转换的条目间的任何体积点的实际组成。原理上，利用恒定流量操作，这样的程序可 形成相同的梯度。然而，此概念的优点在于其可以不再需要用来保持流量恒定。在层级方 法中，二级时间表可以被编程来定义流量随时间的改变。体积组成仍然将遵循原先编程在 具有恒定流量的时间表中的梯度。在此体积域中，现在能够在不影响根据总体积的梯度洗 脱的情况下定义流量改变，当通过保留体积而非保留时间识别时，峰仍然可以再现。二者的 关联可以是针对恒定流量模式的最初流量设置。保留体积在一个实施例中，控制单元400确定保留体积的值，保留体积表示这样的体积，即 洗脱至少通过分离装置的试样液体的各个化合物所需的流动相的体积。对于图6中的示 例，体积V0表示这样的(全部)保留体积。泵20然后基于所确定的保留体积的值而被操 作(例如，通过控制单元400操作或者不受外界控制地被操作)，这意味着当V0穿过时，分 析运行停止。替代通过设定“停止时间”来终止，实际运行在达到“停止体积”时终止。为了确定保留体积的当前值，控制单元400从系统10的组件接收一定的内部数据 (诸如当前流速、控制值、温度、溶剂组成以及积分体积)。很清楚，在许多情况中，控制单元 400接收的数据愈多，可以确定的保留体积愈准确。泵20可以生成用于监控的压强迹线和 流速值以及其他相关信息，例如溶剂组成、积分体积。可以添加来自柱30的分析数据，诸如 保留因子以及溶剂组成的洗脱强度。控制单元400然后可以考虑这样的附加迹线来适应运 行时间条件以及对改变进行校正。控制单元400可以将用于吸光率(如从检测器50接收的)和流量(如从泵20接 收的)的单个数据组合成一维结构。吸光率VS.时间可以与流量VS.时间相组合以形成针 对吸光率VS.体积的迹线。假定一虚构的但是恒定的流量值，控制单元400可以将此吸光 率vs.体积“转换回”吸光率vs.时间。基于时间的控制图7示出一个实施例，其中，HPLC系统10基于具有可变时钟周期的时钟信号被控 制。在本示例中，HPLC系统10具有用于将时钟信号馈送给泵控制单元710(用于控制泵20) 以及检测器50的中央时钟700。很清楚，时钟700还可以馈送其它单元，然而它们在这里并 未示出。在操作中，HPLC系统10运行分析方法，如在本领域中已知的，泵20的操作以及检 测器50的操作被时钟700控制。检测器50可以将输出数据提供给数据分析单元720，诸 如PC、工作台或者任何其它种类的数据处理单元，以进一步处理此输出数据。到此为止，图 7的实施例充分地表示了 HPLC系统，例如，前述Agilent 1200系列Rapid Resolution LC 系统。
图7的实施例还包括从泵20和/或泵控制单元710接收与由泵20提供的流动相 的压强有关的控制值的时钟控制单元730。此控制值可以是例如在泵70的出口 70 (参考图 1)测得的实际压强，或者如泵控制单元710控制泵70的压强输出的设定压强。基于接收到的控制值，时钟控制单元730改变时钟700的时钟周期。在优选实施 例中，当控制值指示流动相的压强(例如在出口 70处)与设定的压强值(例如，泵20的最 大压强)不同时，时钟控制单元730改变时钟周期，直到达到设定的压强值(至少在一定范 围内)。例如，在控制值指示流动相的压强低于设定的压强值时，时钟控制单元730减小时 钟周期(即，增大时钟循环频率)，直到达到设定的值为止(至少在一定范围内)。因此，当 控制值指示流动相的压强大于设定的压强值时，时钟控制单元730增大时钟周期(S卩，减小 时钟循环频率)，直到达到设定的压强值为止(至少在一定范围内)。替代地中央时钟700的概念，HPLC系统系统10可以具有若干时钟，时钟循环从中 央时钟700或者这些若干时钟中的一个时钟得出。图7的实施例的一个优点在于其允许在同一系统10上运行传统的基于恒定流速 的方法以及可变流速的方法(根据本发明)。甚至，其允许在恒定流速模式或可变流速模式 (根据本发明)中利用相同的方法。因此，在恒定流速范例下已经设计的方法可以在可变流 速模式中按照与恒定流速模式中非常相同的方式来运行，唯一的不同在于在可变流速模式 中，时钟周期是变化的。因为在可变流速模式中，时钟频率通常被增大，至少暂时增大，所以 这可以意味着测量结果将比在恒定流速模式中更快地被提供。两种结果(即，在恒定流速 或可变流速模式中运行的一种方法的测量结果)是可直接相比的，并且在最佳情况中甚至 应当相同。来自任一种模式的结果之间的不同例如可能来源于温度影响，当压强条件导致 溶剂行为大大修改或者洗脱强度重大改变时，或者当运行太慢的线速度时，使得仪器在van Deemter曲线的斜坡部分操作。在可变流速模式中流速至少暂时增大的情况中，测量结果将更快产生。在运行被 设计用于恒定流速模式的方法的情况中，这将导致测量结果的出现比分配给这样的测量结 果的时间戳更快。在一个示例中，可变流速中的峰在3min后出现，但是如在恒定流速中设 计的方法，峰具有时间戳4min。这意味着如果该方法运行在恒定流速模式中，峰将在4min 后出现。因此，可变流速模式中的峰实际上可以比其时间戳更快得被分析，或者换句话说， 相同的测量结果(理想情况中)发生地更快或者该方法可以运行更快。在现代的大多数应用中，用于运行一定分离的方法是基于恒定流速设置的。此方 法然后以针对每个方法步骤定义的时间标记被编程。在没有对编程的时间表做任何进一步 的处理或修改的情况下，例如能够允许调整对于流速变化的梯度时程。在图7的实施例中， 中央时钟700被定义作为泵系统20的时钟。例如，如果对于lml/min的流速，时钟周期为 lmsec (1kHz)，则简单的线性关系(对于2ml/min为2kHz)将对此时钟进行改变以校正时间 表的执行。随着流速愈大，时钟运行愈快。按照这种方式，时钟以流量*时间(其实际上是 体积指示器)运行。如果流速以每指示器许多(X)步的形式执行，则当时钟速率根据压强 被调整时，这将自动地调整流速。在这样的实施例中，可以通过根据控制值的变化改变时钟周期来控制流动相的流 速。这使得能够通过改变时钟周期来将例如设定用于恒定流速的方法用于本发明的实施 例。
这样的实施例的另一优点在于导致数据分析的自动校正，这仅需要将泵指示器作 为主时钟也分发给检测装置50。通常，这样的检测装置50以固定的数据速率来递送原始数 据。根据本发明，此数据速率现在优选地从分布式泵指示器(这又表示按照每体积浓度的 每个数据点)得出。可以使用简单的“概测法”标定的流速为两倍，则标定的数据点速度为两倍。如果 以常规的方式(固定时间段的数据点)解释，计算的保留时间将是实际时间的两倍。按照 这种方式，任何常规的数据评价工具都可以用于根据本发明的可变流量控制。对于正确的 峰辨别，仅仅需要检测装置对泵模块的流量指示器产生作用。作为辅助效果，通常用于终止分析实验的任何“停止时间”设置可以基于此流量指 示器，从而导致在特定体积终止运行，而不是在固定时间终止运行。现在应当理解，如果可 实现的流速是标定值的两倍，则在lmin内例如可以执行2min的运行时间。如果使用常规 数据评价工具，结果将也被显示为2min的数据迹线。
权利要求
高效液相色谱系统(10)中的一种方法，其中流动相被驱动通过固定相以分离所述流动相中包含的试样液体的化合物，该方法包括根据所述系统(10)中的控制值的变化来控制(420)所述流动相的流速。
2.根据前述权利要求所述的方法，包括如下至少一个所述控制值与所述流动相的特性或者所述流动相中的特性有关； 所述控制值与所述流动相中的压强有关。
3.根据权利要求1或者上述权利要求中任一项所述的方法，包括操作所述流动相驱动 器(20)以根据所述控制值的变化的流速来驱动所述流动相。
4.根据前述权利要求所述的方法，包括操作所述流动相驱动器(20)以将所述控制值 维持在基本恒定或者至少在给定范围内。
5.根据权利要求3或者上述权利要求中任一项所述的方法，其中，操作所述流动相驱 动器(20)包括如下至少一个响应于所述控制值的增大来减小所述流速； 响应于所述控制值的减小来增大所述流速。
6.根据前述权利要求所述的方法，包括如下至少一个所述流速的减小和增大中的至少一个与所述流速的给定值有关； 所述流速的减小和增大中的至少一个遵循连续函数或阶梯函数。
7.根据权利要求1或者上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述流动相驱动器 (20)在递送所述流动相时以具有周期的周期性方式进行工作，所述流动相驱动器(20)被 操作以使所述控制值的变化具有的时间常数大于所述周期。
8.根据前述权利要求所述的方法，包括如下至少一个所述流动相驱动器(20)的周期通过所述流动相驱动器(20)的部件的往复运动来确 定，其中，优选地，所述部件是在泵工作腔(230)中往复的柱塞(220)；所述时间常数大于所 述流动相驱动器(20)周期性操作引起的波动或脉动的周期。
9.根据权利要求1或者上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述流动相的流速 通过如下至少一个来确定在所述流动相驱动器(20)包括致动器的情况中，监控所述流动相驱动器的所述致动 器的速度；在所述流动相驱动器(20)包括柱塞泵的情况中，监控所述柱塞泵的位移速度； 在所述流动相驱动器(20)包括前馈泵的情况中，读取命令的值； 在系统(10)包括流量传感器的情况中，通过所述流量传感器来测量实际流速； 在系统(10)包括质量流量传感器的情况中，通过所述质量流量传感器来测量质量流量。
10.根据权利要求1或者上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述流动相的流速 在如下至少一处确定所述流动相驱动器(20)的出口(70)； 在穿过所述分离装置(30)之前(72)； 在穿过所述分离装置(30)之后(74)； 所述高效液相色谱系统(10)的出口(60)。
11.根据权利要求1或者上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述控制值是如下 至少一个或者与如下至少一个有关-压强，-压强差，优选地为沿着固定相或者所述分离装置(30)的压强差， -流动相驱动器(20)的控制参数，诸如用于驱动所述流动相驱动器(20)的泵的电流、 电压和功率中的至少一个，-在给定的实际组成下与所述流动相的粘度有关的值。
12.根据权利要求1或者上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述控制值在如下 至少一处与所述流动相中的压强有关-流动相驱动器(20)的出口 (70)； -将所述试样液体引入所述流动相的注射点(40)；-所述固定相或分离装置(30)的入口区域，这里，所述流动相首先进入所述固定相，在 所述固定相包括色谱柱的情况下，优选地为柱的头部；-所述固定相(30)的出口区域，这里，所述流动相离开所述固定相，在所述固定相包括 色谱柱的情况下，优选地为柱的出口 ；
13.根据权利要求1或者上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述系统(10)是基 于时钟循环控制的，所述时钟循环具有可调的时钟周期，并且控制所述流动相的流速包括 根据所述控制值的变化来改变所述时钟周期。
14.根据前述权利要求所述的方法，所述控制值与如下至少一个有关 -所述流动相的特性；-所述流动相中的压强；-压强差，优选地为沿着所述固定相或分离装置(30)的压强差； -流动相驱动器(20)的控制参数，诸如用于驱动泵的电流、电压和功率中的至少一个， -在给定的实际组成下与所述流动相的粘度有关的值。
15.根据权利要求1或者上述权利要求中任一项所述的方法，还包括确定保留体积的值，所述保留体积的值表示洗脱至少通过所述固定相(30)的试样液 体的各个化合物所需的流动相的体积；以及基于所确定的保留体积的值来操作流动相驱动器(20)。
16.在高效液相色谱系统(10)中的一种方法，其中，流动相被驱动通过固定相以分离 在所述流动相中包括的试样液体的化合物，并且所述系统(10)基于具有可调时钟周期的 时钟循环而被控制，所述方法包括根据所述系统(10)的控制值的变化来改变所述时钟周期。
17.根据前述权利要求所述的方法，其中，所述控制值与如下至少一个有关 -所述流动相的特性；-所述流动相中的压强；_压强差，优选地为沿着所述固定相(30)的压强差；-流动相驱动器(20)的控制参数，诸如用于驱动泵的电流、电压和功率中的至少一个， -在给定的实际组成下与所述流动相的粘度有关的值。
18.在高效液相色谱系统(10)中的一种方法，其中，流动相被驱动通过固定相(30)以分离在所述流动相中包括的试样液体的化合物，所述方法包括确定保留体积的值，所述保留体积的值表示洗脱至少通过所述固定相(30)的试样液 体的各个化合物所需的所述流动相的体积；以及基于所确定的保留体积的值来操作所述高效液相色谱系统(10)。
19.根据前述权利要求所述的方法，其中，所述保留体积与如下至少一个有关所述系统(10)的洗脱强度，所述洗脱强度由所述固定相的温度、组成、特征以及流动 相的特征中的至少一个来确定； 所述流动相的溶剂组分的体积； 包括一种或多种不同溶剂组分的所述流动相的总体积； 所述流动相的溶剂组分随时间的体积； 包括一种或多种不同溶剂组分的所述流动相随时间的总体积； 从之前的校准或之前的基准分析或者通过参考来自之前的分析实验的结果得出的各 个条件。
20.根据权利要求18或者上述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述保留体积的 各个值被指派给从分离得出的并且与各种化合物有关的色谱的各个峰，其中，所述保留体 积的值是基于如下至少一个确定的随时间积分的流速的值，优选地，在与所述试样液体被引入所述流动相以及从所述固 定相洗脱所述试样液体的至少一种化合物有关的时间段中积分的流速的值； 包括多种溶剂组分的流动相的组成；包括多种溶剂组分的流动相的组成随时间的变化，优选地，所述多种溶剂组分的比率 随时间的变化；所述流动相的温度，优选地，所述温度随时间的变化；从之前的校准或之前的基准分析或者通过参考来自之前的分析实验的结果得出的所 述系统(10)的各个条件。
21.—种高效液相色谱系统(10)，包括分离装置(30)，其具有固定相，用于分离移动相中包括的试样液体的化合物，以及 流动相驱动器(20)，用于驱动所述流动相通过所述分离装置(30)， 其中，所述流动相驱动器(20)被操作以使得所述流动相的流速依赖于所述系统(10) 中的控制值的变化。
22.根据前述权利要求所述的系统(10)，包括控制单元(400)，用于通过响应于所述控制值的变化控制(420)所述流动相的流速来 控制所述流动相驱动器(20)的操作(420)。
23.根据权利要求21或者上述权利要求中的任一项所述的系统(10)，还包括 分析单元，用于确定保留体积的值，所述保留体积表示洗脱至少通过所述分离装置(30)的试样液体的各种化合物所需的流动相的体积。
24.根据权利要求21或者上述权利要求中的任一项所述的系统(10)，其中，所述流动 相驱动器(20)包括如下至少一个泵送设备(200A、200B ;300、310)，包括柱塞(220)，柱塞(220)用于在泵工作腔(230) 中往复运动以将泵工作腔(230)中的液体压缩到液体的可压缩性变得显而易见的高压强；两个泵送设备(200A、200B ； ；300,310)以如下任一方式耦合 -以串联方式(图2)耦合，第一泵送设备(200A)的出口耦合到第二泵送设备(200B) 的入口，并且所述第二泵送设备(200B)的出口提供泵的出口(70)，或者-以串联方式(图2)耦合，第一泵送设备(200A)的入口耦合到入口装置，所述入口装 置能够生成由一个或多个溶剂贮存库构成的被选择的组合物，或者-以并联方式(图3)耦合，第一泵送设备(300)的入口耦合到第二泵送设备(310)的 入口，第一泵送设备(300)的出口耦合到第二泵送设备(310)的出口，从而提供泵的出口 (70)，或者-以两个或者更多个串联方式耦合，以使得每个泵从其各自的贮存库递送总流量的一 定比例，以在提供给下游系统之前在出口端被组合，其中，所述第一泵送设备和所述第二泵 送设备二者的组合的液体出口提供基本上连续的流动相流量。
25.根据权利要求21或者上述权利要求中的任一项所述的系统(10)，包括如下至少一个分离装置(30)，包括色谱柱，提供固定相；流动相，包括溶剂混合物，其在混合物组成范围内表现出粘度的变化； 试样液体，包括基质，基质表现出实质上比流动相更高的粘度，从而导致跨下游系统的 压强降的初始增大；所述控制值的变化是由如下至少一个因素引起的流动相的粘度的变化，过滤器、筛板 或管道的限制的变化，因切换例如类似注射阀的流路而引起的限制的变化；所述流动相的压强在200到2000bar的范围内，特别是500到1500bar范围内。
26.根据权利要求21或者上述权利要求中的任一项所述的系统(10)，包括如下至少一个采样单元(40)，用于向所述流动相引入试样液体， 自动调温装置，用于将所述分离装置(30)保持在预定的温度， 检测器(50)，用于检测经分离的所述试样液体的化合物， 分级单元(60)，适用于输出经分离的所述试样液体的化合物。
27.—种高效液相色谱系统(10)，包括分离装置(30)，具有固定相，用于分离在流动相中包括的试样液体的化合物， 流动相驱动器(20)，用于驱动所述流动相通过所述分离装置(30)， 分析单元(720)，用于确定保留体积的值，所述保留体积表示洗脱至少通过所述分离装 置(30)的试样液体的各种化合物所需的流动相的体积，以及控制单元(400)，用于基于所确定的所述保留体积的值来操作所述高效液相色谱系统 (10)。
28.一种软件程序或产品，优选地被存储在数据载体上，当在诸如计算机之类的数据处 理系统上运行时，用于控制或执行权利要求1或者上述权利要求中任一项所述的方法。
全文摘要
在高效液相色谱系统(10)中，流动相被驱动通过固定相以分离在流动相中包含的试样液体的化合物，流动相的流速根据系统(10)中的控制值的变化而被控制(420)。
文档编号G01N30/24GK101855548SQ200780101526
公开日2010年10月6日 申请日期2007年11月12日 优先权日2007年11月12日
发明者克劳斯·威特 申请人:安捷伦科技有限公司