专利名称：冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，具体涉及中药冬虫夏草有效成分含量的测
定方法，特别涉及一种利用固相萃取结合HPLC测定冬虫夏草中多球壳菌
素含量的方法。
背景技术：
冬虫夏草(Cor办ce戸w'朋w^)是一种名贵中药，在真菌分类学中， 冬虫夏草隶属于子囊菌纲(Ascomycetes)，肉座菌目(Hypocreales),麦角 菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps sp.)。虫草的种类在世界范围 内数以百计，我国作为药用的虫草主要有冬虫夏草、蛹虫草(Cb^vc印s m///to^)和蝉花(Cora^ce戸等，尤以冬虫夏草最为著名。冬虫 夏草具有益精髓、补虚损、保肺、益肾等功效，主要用于虚劳咳嗽、咯血 盗汗、阳痿遗精、腰膝酸软等症。现代药理研究表明冬虫夏草具有治疗慢 性支气管炎、治疗慢性肾炎、镇静催眠、雄激素样等作用，还具有抗癌活 性以及免疫调节等作用。
,多球壳菌素是存在于冬虫夏草中的一种有效成分。药理研究表明，多 球壳菌素具备多种药理作用，如多球壳菌素具有显著的双向免疫调节作用，特别是具有独特的免疫抑制作用，能阻断白介素-2受体以下的信号传
导途径，抑制丝氨酸棕榈酰转移酶活性，从而特异性抑制T细胞的增殖；
多球壳菌素对同种细胞障碍性T细胞的诱导均有很强的抑制活性，在这些 方面比环孢菌素A强10 100倍；在同种混合淋巴球混合反应方面，多 球壳菌素也比临床广泛应用的环孢菌素A显示更强的活性。
除了从蝉花发酵滤液及菌丝体中分离得到多球壳菌素外，Fujita等从 无孢菌(^Mece//a他n'〃z'a)、多球菌(AfyWococcw附a/6o附yces)及木霉多孢 菌(7Wc^(iermapo/;^on^)等微生物中分离得到多球壳菌素。我们在冬 虫夏草及其无性型中国被毛孢(s/wera/s)菌丝体中发现含有多球 壳菌素。基于多球壳菌素的药理价值及冬虫夏草广泛的临床应用，建立简 便易行的冬虫夏草中多球壳菌素的HPLC测定方法对于合理评价冬虫夏 草的价值，有效利用冬虫夏草资源，控制人工冬虫夏草药材质量，以及开 发多球壳菌素均具有重要意义。
目前国内外尚未见定量分析多球壳菌素方法的文献报道，也未见分析 冬虫夏草或中国被毛孢菌丝体中多球壳菌素含量的报道。多球壳菌素经紫 外吸收光谱测定，为末端吸收，随着波长变长噪音变小，但灵敏度下降， 响应值变低，因而检测波长需选择在紫外末端；冬虫夏草中多球壳菌素含 量较低，化学成分复杂，含有大量糖、肽、氨基酸等物质，杂质干扰严重； 冬虫夏草的溶剂提取物色泽深、粘度大。这些因素均显著影响冬虫夏草中 多球壳菌素含量的测定，冬虫夏草溶剂提取物需经分离纯化方可用于 HPLC分析。
发明内容
本发明提供了一种简便、灵敏、重现性好的固相萃取结合高效液相色 谱定量测定冬虫夏草中多球壳菌素的方法。采用的技术方案如下 一种冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法，包括以下步骤
(1) 对照品溶液的制备
精密称取多球壳菌素对照品，加甲醇制成0.001 1.0 mg/mL的多球 壳菌素对照品溶液备用；
(2) 标准曲线的制作
取多球壳菌素对照品溶液适量，分别精密吸取1、 10、 20、 40、 50|iiL 注入高效液相色谱仪；采用色谱柱C18色谱柱，流动相乙腈与水体积 比20 80: 80 20，流速0.6 1.2 mL/min，柱温20 65 。C，检测波长 190 215nm;测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标
(3) 供试品溶液的制备
提取取冬虫夏草样品，经粉碎，通过20 200目的分样筛，然后精 密称取0.1 5g置入容器中，加10 250mL溶剂提取，随后移出上清液， 同法提取1 3次，得总提取液；其中所述冬虫夏草样品的提取溶剂为甲 醇、乙醇、水的一种或它们的混合溶剂；所述提取方法采用超声提取法、 加热回流提取法、浸泡提取法的一种；
过固相萃取柱定量移取总提取液在常压或减压下挥干后用浓度小于50%的甲醇溶液或水1 10 mL溶解，离心，取上清液作上样液；将上样 液加到十八垸基固相萃取柱上，待上样液通过十八烷基固相萃取柱后，第 一次用浓度小于50%的甲醇溶液或水冲洗，冲洗液弃之；随后第二次用 60% 100%的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；其中所述十八烷基固相萃取柱 上样前先用甲醇活化和蒸馏水平衡；
供试品定容收集含有多球壳菌素的洗脱液在常压或减压下挥干，向
挥干后的残留物加入甲醇溶解，甲醇溶解液离心，取上清液即得供试品溶
液；或甲醇溶解液用微孔滤膜过滤，取续滤液得供试品溶液； (4)采用高效液相色谱仪进行测定
取供试品溶液，进样量为1 60pL，在步骤(2)的条件下进行HPLC 测定，根据标准曲线，采用外标法确定多球壳菌素的含量。
本发明所述冬虫夏草是指野生冬虫夏草、人工培育冬虫夏草及冬虫夏 草无性型中国被毛孢发酵菌丝体。
其中步骤(2)所述各种条件的优化参数是乙腈与水体积比是65: 35，流速是1.0mL/min，柱温是30°C，检测波长是203 nm。
其中步骤(3)所述冬虫夏草样品的提取溶剂最好是甲醇。
其中步骤(3)移出上清液可采用过滤法、离心法。
步骤(3)所述冬虫夏草样品的提取方法最好采用超声提取法，超声提 取时间每次为20 120min，每个样品提取1 3次。
其中步骤(3)中上柱处理后第二次洗脱按每1 g药材取4 mL 80%甲醇进行洗脱。
在进行固相萃取时，对流出曲线进行了考察。对上样液，每0.5mL流 出液收集一份，将每份溶液各进样10 piL，记录高效液相色谱图，结果显 示流出液中不含多球壳菌素，而流出液中含大量其它物质；对于一支含500 mg树脂的常规反向固相萃取柱，取3 g冬虫夏草或其无性型中国被毛孢 菌丝体样品的上样液，通过高效液相色谱跟踪，直至上样结束流出液中也 不含多球壳菌素。上样后，用浓度小于50%的甲醇溶液或水冲洗固相萃取 柱，每0.5mL冲洗液收集一份，将每份溶液各进样10pL，记录色谱图， 结果显示多球壳菌素不被洗脱下来，而大量的其他极性杂质被洗脱下来； 随后用60% 100%的甲醇溶液洗脱，每0.5 mL收集一份，将每份溶液各 进样10 uL，记录高效液相色谱图，结果显示多球壳菌素可被洗脱下来； 对于1 g药材的上样液，80%甲醇溶液3 mL可基本洗脱完固相萃取柱吸 附的多球壳菌素，3.5ml流出液中多球壳菌素的浓度趋零，为了确保含量 测定的准确性，对于1 g药材，故取4 mL 80%甲醇溶液作为洗脱液。对 于冬虫夏草或中国被毛孢菌丝体的不同药材量、药材中多球壳菌素含量差 异较大者及不同甲醇浓度洗脱，通过上述方法可优化流出操作过程。
采用质谱法进行定性分析
选用质谱仪美国应用生物系统公司ABIQ-TRAP，质谱条件电喷 雾离子源，负离子扫描，去簇电压9V,碰撞能量35eV，离子源温度350 °C，离子源电压5kV。收集冬虫夏草供试品溶液与多球壳菌素对照品溶液在高效液相色谱图中出
峰时间一致的馏分约200 nL，取2 pL注入质谱仪进行扫描，扫描范围 m/z : 100 800，获得样品的总离子流图(见图3);从图3可见，在ESI 负离子全扫描方式下，主要生成[M-H]_的准分子离子峰，得其m/z (M-H〉为400.3，与多球壳菌素的理论值及Sasaki等报道的多球壳菌素质谱 结果一致，因而可确定冬虫夏草供试品溶液(图2)与多球壳菌素对照品 (图l)在高效液相色谱图出峰时间一致的色谱峰化学成分是多球壳菌素。 采用质谱仪软件系统提供的萃取离子功能，选择m/z 400，得其二级 质谱图(见图4)，从图4可观察到m/z400.3准分子离子峰，及m/z 86.2、 104.1、 294.8和333.9等碎片峰。根据碎片峰m/z推测了准分子离子m/z 400.3的合理裂解方式(见图4)。因而可进一步确定冬虫夏草供试品与 多球壳菌素对照品在高效液相色谱图中出峰时间一致的色谱峰的化学成分 是多球壳菌素。
本发明液相色谱仪进样分析前对提取的样品进行处理，通过反相固相 萃取柱除去强极性的糖、肽、氨基酸等杂质，从而减少对测定结果的干扰。 该法的有益效果是测定效果稳定，重现性、精密度良好，测量结果准确。
图1多球壳菌素对照品的HPLC色谱图 图2供试品的HPLC色谱图 图3供试品馏分的总离子流图 图4多球壳菌素的二级质谱图具体实施例
下面将通过具体实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对 本发明作限定，本领域的技术人员对本发明的技术特征所作的等同替换， 或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
(1) 实验仪器
色谱仪:Agilent 1100型高效液相色谱仪(G1379A脱气机、G1311A四 元泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B DAD检测器， Chemstations工作站)；AE240电子分析天平(瑞士梅特勒一托利多集团)； 超声仪器KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
(2) 试药
多球壳菌素对照品纯度大于98.0%，购于Sigma公司；甲醇和乙腈色 谱纯，购于Dikma公司；水为重蒸馏水，其他试剂为分析纯。
中国被毛孢菌丝体的预处理通过液体发酵法制备冬虫夏草菌发酵液， 过滤，并用水淋洗2 3次获得湿菌丝体，置于50 °C烘箱烘干至恒重， 置干燥器备用。
(3) 色谱条件 色谱柱C18色谱柱；
流动相乙腈-水(20 80: 80 20)，优选乙腈-水(65: 35); 、流速0.6 1.2 mL/min，优选1.0mL/min; 柱温20 65°C，优选30 °C;检测器选用普通紫外检测器或二级管阵列检测器； 检测波长190 215nm，优选203 205 nm，进一步优选203 nm; 进样体积1 50mL，实验室常规进样量10pL。 (4)系统适用性
多球壳菌素色谱峰的理论塔板数应不低于2000，多球壳菌素色谱峰与 其他化学成分色谱峰的分离度应大于1.5。 实施例1 野生冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法
(1) 对照品溶液的制备
精密称取多球壳菌素对照品，加甲醇制成0.15 mg/mL的多球壳菌素 对照品溶液；
(2) 标准曲线的制作 取多球壳菌素对照品溶液适量，分别精密吸取1、 10、 20、 40、 50
注入高效液相色谱仪，采用色谱柱Inertsil ODS-3色谱柱(GL Sciences Inc., 4.6mmx250mm， 5 pm);流动相乙腈与水体积比为65: 35;流 速1.0mL/min;柱温30°C，检测波长203證；测定峰面积，以进样量为 横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，计算回归方程为 Y = 74.47X.4.38, r = 0.9992，线性范围为0.15 7.54
(3) 供试品溶液的制备
精密称定过60目筛的野生冬虫夏草粉末lg，置50mL具塞锥形瓶 中，加入甲醇10mL，超声提取40min，过滤，同法提取3次，合并滤液；滤液在60 °C真空下挥干，残渣用40%甲醇溶液3 mL溶解，离心10 min (4,000 r/min);将上清液加到经过10 mL甲醇活化、5 mL蒸馏水平 衡处理好的Bondelut固相萃取柱(C18， 500 mg， 3 mL，美国瓦里安公司) 上，待其通过后，第一次用40%的甲醇溶液3 mL冲洗，冲洗液弃之， 随后第二次用80%的甲醇溶液4 mL洗脱，收集洗脱液；在常压下水浴 加热至80 °C挥干洗脱液，残渣精密加入甲醇lmL，溶解，离心10min (4,000 r/min)，取上清液即得供试品溶液； (4)采用高效液相色谱仪进行测定 取供试品溶液进样量10 pL在步骤(2)的条件下进行HPLC测定， 根据标准曲线，采用外标法确定多球壳菌素的含量，测得野生冬虫夏草多 球壳菌素含量为0.065 mg/g。
实施例2 中国被毛孢菌丝体中多球壳菌素含量的测定方法
供试品溶液制备时各种技术参数做了以下调整，其余步骤与实施例l 相同。供试品溶液的制备如下
中国被毛孢菌丝体粉末(过60目筛)约lg，精密称定，置100mL 具塞锥形瓶中，加入乙醇25mL，超声提取60min，过滤，提取2次， 合并滤液；滤液在60 °C真空下挥干，残渣用30%甲醇溶液4mL溶解， 离心10 min (4,000 r/min);将上清液加到经过10 mL甲醇活化、5mL蒸 馏水平衡处理好的Bond elut固相萃取柱(C18， 500 mg， 3 mL，美国瓦里 安公司)上，待其通过后，第一次用30%的甲醇溶液4mL冲洗，冲洗液弃之，随后第二次用90%的甲醇溶液4mL洗脱，收集洗脱液；在70 °C水浴挥干洗脱液，残渣精密加入甲醇lmL，溶解，离心10min (4,000 r/min)，取上清液即得供试品溶液；
分别精确量取对照品和供试品10 nL进行HPLC测定，测得中国被 毛孢菌丝体中多球壳菌素含量为0.586 mg/g。
实施例3为了进一步证实该测定方法的可靠性，做以下试验进行考察
(1) 精密度试验
精密吸取实施例2制备的同一份供试品溶液10^L，连续进样5次， 测得峰面积积分值的RSD值为1.38% (n = 5)，结果表明精密度良好。
(2) 重现性试验
取中国被毛孢菌丝体粉末5份，每份lg，精密称定，按实施例2供 试品溶液的制备方法处理后，分别进样10 pL,用外标法计算多球壳菌素 的含量，RSD为1.12%,结果表明该法重现性良好。
(3) 稳定性试验
精密吸取按实施例2制备的同一份供试品溶液10^L，分别于0、 2、 4、 8、 12、 24 h进样，测得峰面积积分值的RSD为0.86%，结果表明供 试品溶液在24 h内稳定。
(4) 回收率试验
精密称取己知含量中国被毛孢菌丝体粉末6份，每份0.5g，分别精 密加入适量多球壳菌素对照品，按实施例2方法制备供试品溶液，测定并 计算多球壳菌素的平均回收率为98.95%, RSD为1.92%。(5)系统适用性
多球壳菌素色谱峰的理论塔板数为5500，多球壳菌素色谱峰与其他化 学成分色谱峰的分离度为3.5。用Agilent高效液相色谱仪的 Chemstations工作站光谱软件对供试品的多球壳菌素色谱峰进行光谱图分 析和纯度检査，表明该峰是单一峰。
通过以上五个方面对冬虫夏草中多球壳菌素含量测定方法学进行考 察，包括考察精密度、重现性、稳定性、回收率实验、系统适用性，表明 本方法测定效果稳定，重现性、精密度良好，测量结果准确可靠。 实施例4人工培育冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法
供试品溶液制备时各种技术参数做了以下调整，其余步骤与实施例l 相司。特别值得提到的是本实施例中供试品溶液的制备采用加热回流提取， 洗脱液用甲醇溶解后所得的液体用微孔滤膜过滤，取续滤液得供试品溶液; 供试品溶液制备的具体各种技术参数如下 (1)供试品溶液的制备
取人工培育冬虫夏草粉末(过100目筛)约lg，精密称定，置50mL 圆底烧瓶中，加入甲醇20mL，加热60 70 °C回流提取2 h，过滤，同 法提取2次，合并滤液；滤液在60 °C减压下挥干，残渣用25%甲醇溶 液4mL溶解，离心15min (4,000 r/min);将上清液加到已处理好(上 样前固相萃取柱用10 mL甲醇活化，5mL蒸馏水平衡)的Cleanert固相 萃取柱(C18， 500mg， 3mL，艾杰尔科技有限公司)上，待其通过后，先用25%的甲醇溶液4 mL冲洗，冲洗液弃之，最后用80%甲醇溶液4 mL洗脱，收集洗脱液；在60 °C减压下挥干洗脱液，残渣精密加入甲醇2 mL，溶解，用微孔滤膜过滤，取续滤液得供试品溶液。
色谱分析条件同实施例l,分别精确量取对照品和供试品10 pL进行 HPLC测定，测得人工培育冬虫夏草中多球壳菌素含量为0.105 mg/g。
权利要求
1、一种冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法，包括以下步骤(1)对照品溶液的制备精密称取多球壳菌素对照品，加甲醇制成0.001～1.0mg/mL的多球壳菌素对照品溶液备用；(2)标准曲线的制作取多球壳菌素对照品溶液适量，分别精密吸取1、10、20、40、50μL注入高效液相色谱仪；采用色谱柱C18色谱柱，流动相∶乙腈与水体积比20～80∶80～20，流速0.6～1.2mL/min，柱温20～65℃，检测波长190～215nm；测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；(3)供试品溶液的制备提取取冬虫夏草样品，经粉碎，通过20～200目的分样筛，然后精密称取0.1～5g置入容器中，加10～250mL溶剂提取，随后移出上清液，同法提取1～3次，得总提取液；其中所述冬虫夏草样品的提取溶剂为甲醇、乙醇、水的一种或它们的混合溶剂；所述提取方法采用超声提取法、加热回流提取法、浸泡提取法的一种；过固相萃取柱定量移取总提取液在常压或减压下挥干后用浓度小于50％的甲醇溶液或水1～10mL溶解，离心，取上清液作上样液；将上样液加到十八烷基固相萃取柱上，待上样液通过十八烷基固相萃取柱后，第一次用浓度小于50％的甲醇溶液或水冲洗，冲洗液弃之；随后第二次用60％～100％的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；其中所述十八烷基固相萃取柱上样前先用甲醇活化和蒸馏水平衡；供试品定容收集含有多球壳菌素的洗脱液在常压或减压下挥干，向挥干后的残留物加入甲醇溶解，甲醇溶解液离心，取上清液即得供试品溶液；或甲醇溶解液用微孔滤膜过滤，取续滤液得供试品溶液；(4)采用高效液相色谱仪进行测定取供试品溶液，进样量为1～60μL，在步骤(2)的条件下进行HPLC测定，根据标准曲线，采用外标法确定多球壳菌素的含量。
2、 根据权利要求1所述的冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法， 其特征在于冬虫夏草是指野生冬虫夏草、人工培育冬虫夏草及冬虫夏草无 性型发酵菌丝体。
3、 根据权利要求2所述的冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法， 其特征在于冬虫夏草无性型指的是中国被毛孢。
4、 根据权利要求1所述的冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法， 其中步骤(2)所述乙腈与水体积比是65: 35,流速是1.0mL/min，柱温 是30°C，检测波长是203 nm。
5、 根据权利要求1所述的冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法， 其中步骤(3)所述冬虫夏草样品的提取溶剂为甲醇。
6、 根据权利要求1所述的冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法， 其中步骤(3)所述冬虫夏草样品的提取方法是采用超声提取法。
7、 根据权利要求6所述的冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法， 其中所述超声提取法，超声提取时间每次为20 120 min，每个样品提取 1 3次。
8、 根据权利要求1所述的冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法， 其中步骤(3)提取后移出上清液采用过滤法或离心法。
9、 根据权利要求1所述的冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法， 其中步骤(3)上柱处理后第二次洗脱按每1 g药材取4 mL 80%甲醇进 行洗脱。
全文摘要
本发明公开了一种冬虫夏草中多球壳菌素含量的测定方法，包括以下步骤(1)对照品溶液的制备精密称取多球壳菌素对照品，加甲醇制成0.001～1.0mg/ml的多球壳菌素对照品溶液备用；(2)标准曲线的制作；(3)供试品溶液的制备经过提取、过固相萃取柱及供试品定容；(4)采用高效液相色谱仪进行测定。该方法的有益效果是测定效果稳定，重现性、精密度良好，测量结果准确。对有效利用冬虫夏草资源，控制人工冬虫夏草药材质量，以及开发多球壳菌素均具有重要意义。
文档编号G01N30/00GK101315352SQ20081006989
公开日2008年12月3日 申请日期2008年6月27日 优先权日2008年6月27日
发明者余佳文, 刘洪波, 徐红娟, 朱华李, 毛先兵, 陈仕江 申请人:重庆市中药研究院