专利名称：一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法
技术领域：
本发明是梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法，包括蔷薇科木本果树花粉及 花粉管微丝骨架的荧光标记方法以及用该方法对花粉及花粉管微丝骨架进行显微镜 观察等内容，属于生物技术领域。二、 背景技术微丝骨架是细胞骨架的一种，它主要由肌动蛋白组装的螺旋状多聚体和肌动蛋白 结合蛋白组成。微丝的组装和解聚与细胞的许多功能活动相关，如参与细胞形态建成、 细胞器的运动定位、胞质流动以及顶端生长等。花粉管作为有花植物受精过程中雄性 单位的载体，具有典型的顶端生长特性，因而成为生物技术领域中研究细胞极性生长 的理想模式系统，此外，花粉管对细胞间的相互作用以及信号传导研究也具有重要意 义。微丝骨架是花粉管的基本结构之一，在花粉管的顶端生长中起着重要作用，包括 花粉管生长过程中极性位点的建立、分泌小泡的运输、胞质流动以及顶端细胞壁的构 建，并且与<^2+等信号分子密切相关，因而，花粉管是研究植物细胞微丝骨架的模式 材料。对于花粉管中微丝骨架的分布至今仍然存在争议。目前，己有很多研究花粉管中 微丝骨架的方法，但这些方法大多需要去壁，且主要用于草本植物花粉管微丝骨架分 布的研究，而几乎没有对木本植物花粉及花粉管内微丝骨架开展过研究，尤其是对梨 等蔷薇科木本果树花粉和花粉管中微丝骨架进行标记的有效方法和技术还未见报道， 从而导致与梨等蔷薇科果树花粉管生长过程中相关的生物学研究相对滞后。三、 发明内容技术问题本发明的目的是提供一种较快速、有效的梨花粉及花粉管微丝骨架的 荧光标记方法，有效地对微丝骨架在花粉(管)内的结构与分布进行观察。该方法可 用于标记其他蔷薇科木本果树(苹果、桃、杏、李等)花粉(管)内微丝骨架，也为其他组织器官内微丝骨架的荧光标记与观察提供方法。技术方案本发明所提供的对梨花粉及花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法，包 括下列步骤1)花粉的采集采集梨树开花当天的花粉，自然干燥后密封，-201低温保存；
蔗糖，10%; PEG4000 (聚乙二醇4000)， 15%; H3B03， 0.01%; Ca(N03) 2 4H20， 0.03%; MgS04*7H20， 0.02%;跳，0.01%;溶剂，水；用30 mraol/L的MES缓冲液 (2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液)调pH值至6.5;3) 花粉的培养取步骤l)干燥后的花粉，放入花粉培养基中，在恒温25i:黑暗条件下分别培养 0.5h或2h，培养0.5h的花粉，用于花粉粒内微丝骨架的荧光标记；培养2h得到花 粉管，用于花粉管内微丝骨架的荧光标记与观察；4) 预固定培养后的花粉或花粉管，用新鲜的花粉培养基配制的200 Mmol/LMBS (顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)预固定5-10 miri;5) 固定然后用含有质量比2%多聚甲醛和质量比4%多聚甲醛、pH为6.8的0. 1 mol/L PBS缓冲液(磷酸缓冲液)室温条件下固定花粉或花粉管0. 5 h; 0. 1 mol/L PBS 缓冲液(磷酸缓冲液)的配制NaH2P04 2H20 2. 964 g和Na2HP04 12H20 28. 998 g加 蒸馏水定容至1000 ml， pH 6.8;6) 洗涤用O. 1 mol/LPBS缓冲液(磷酸缓冲液)清洗2-3次，去除清洗液；7) 染色液的配制染色液用pH 6. 8的0. 1 mol/L PBS缓冲液(磷酸缓冲液)配制，其中加入终浓度 质量比5呢DMS0 (二甲基亚砜)，终浓度5 mmol/L EGTA (乙二醇二乙醚二胺四乙酸)， 终浓度质量体积比10%蔗糖，再加入终浓度5 Pg/ml FITC-ph (异硫氰酸荧光素标记 的鬼笔环肽)；8) 染色加入染色液，在室温黑暗条件下孵育0.5-1 h;9) 洗涤用O. 1 mol/LPBS缓冲液(磷酸缓冲液)清洗2-3次，获得标记好的样口叫510) 封片标记好的样品滴加在载玻片上，并用体积比50%甘油封片，待观察。上述步骤4)用MBS (顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)预固定的时间最好为7 min，步骤8)孵育时间最好为lh。 有益效果1) 首次对蔷薇科木本果树梨花粉及花粉管微丝骨架进行荧光标记，本发明将在 蔷薇科木本果树花粉研究开发利用过程中发挥重要作用，实际应用价值高。2) 本发明操作简单、快速，省略了迄今在其他标记方法中对细胞壁进行酶解的 步骤；3) 用MBS (顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)预固定后再用多聚甲醛固定能够
较好地保存花粉和花粉管内的微丝骨架结构；4) 用DMSO (二甲基亚砜)作为渗透剂，增加了细胞膜的通透性，减少了对细 胞的损伤，较好地保存花粉和花粉管内微丝骨架结构。5) 本发明选用FITC-ph (异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)作为荧光标记染料， 克服了梨花粉外壁自发荧光的干扰，标记效果好，可在激光共聚焦显微镜下清晰地观 测到微丝骨架呈束状沿花粉管长轴分布。6) 该方法可用于标记其他蔷薇科木本果树(苹果、桃、杏、李等)花粉(管) 内微丝骨架，也为其他组织器官内微丝骨架的荧光标记与观察提供方法。四
图1梨花粉(管)微丝骨架荧光标记的流程图。图2用含有FITC-ph (异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)的染色液按照图1流程图标记后在激光 共聚焦显微镜(激发光波长为488 nm)下观测到的花粉和花粉管微丝骨架的结构与分布情况。花 粉粒内微丝呈丝状，在花粉萌发孔处聚集(图2a)，在花粉管内，微丝呈现束状沿花粉管长轴分 布，花粉管顶端区域(离尖端大约10 ym)没有发现有微丝存在(图2 b)。 图3对照。图3-a为先用鬼笔环肽(phalloidin)处理，然后用FITC-ph染色液(异硫氰酸荧光 素标记的鬼笔环肽染色液)标记后在激光共聚焦显微镜(激发光波长为488 nm)下所观测的图像， 结果没有观察到花粉和花粉管内微丝骨架；图3-b为用FITC (异硫氰酸荧光素)代替FITC-ph (异 硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)标记后在激光共聚焦显微镜(激发光波长为488nm)下所观测的 图像，花粉和花粉管内均有强荧光，但未观察到微丝骨架结构。说明FITC-ph (异硫氰酸荧光素 标记的鬼笔环肽)能特异性地标记花粉或花粉管内微丝骨架。图4用TRITC-ph (四甲基罗丹明B异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)替代FITC-ph (异硫氰酸荧 光素标记的鬼笔环肽)的染色液按照图1流程图标记后在激光共聚焦显微镜(激发光波长为568 nm)下观测到的花粉和花粉管微丝骨架的结构与分布情况，花粉粒中由于外壁的自发荧光(三角 形所示)，无法确定亮区内部微丝骨架的结构形态与分布，但在未萌发的花粉萌发孔处看见点状结 构(图4-b，箭头所示)，在花粉管内可以看见微丝成束状沿花粉管长轴分布，在花粉萌发孔处也 能看到微丝的分布(图4-c，箭头所示)。图4-a为不含TRITC-ph染色液(四甲基罗丹明B异硫 氰酸荧光素标记的鬼笔环肽染色液)按照图1流程图标记后在激光共聚焦显微镜(激发光波长为 568 nin)下所观测到的花粉外壁的自发荧光。 注图2， 3， 4中的靶标均表示10 Mm五、 具体实施实例1) 植物样品的釆集釆集梨树开花当天的花粉，自然干燥后密封，-2(TC低温保存。2) 花粉培养基的制备蔗糖，10%; PEG 4000 (聚乙二醇4000)， 15%; H3B03， 0.01%; Ca(N03)2 4H20， 0.03%; MgS04 7H20， 0.02%;跳，0.01%;溶剂，水； 用30誦ol/L的MES缓冲液(2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液)调pH值至6. 5;3) 花粉的培养取步骤l)干燥后保存的花粉，先在常温下解冻2h，在上述花 粉培养基上培养花粉，温度为25。C，黑暗条件，分别培养0.5h和2h。培养0.5h的 花粉，用于花粉粒内微丝骨架的荧光标记；培养2h得到花粉管，用于花粉管内微丝 骨架的荧光标记与观察；4) 预固定培养后的花粉或花粉管，用新鲜的花粉培养基配制的200 Mmol/LMBS (顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)预固定7 min;5) 固定然后用含有质量比2°/。多聚甲醛和质量比4%多聚甲醛、pH为6. 8的0. 1 mol/L PBS缓冲液(磷酸缓冲液)室温条件下固定花粉或花粉管0. 5 h; 0. 1 mol/L PBS 缓冲液(磷酸缓冲液)的配制Na跳 2H20 2 . 964 g和Na2HP04 12H20 28. 998 g加 蒸馏水定容至1000 ml， pH 6.8;6) 洗涤用O. 1 mol/L PBS缓冲液(磷酸缓冲液)清洗3次，去除清洗液；7) 染色液的配制染色液用pH 6. 8的0. 1 mol/L PBS缓冲液(磷酸缓冲液)配 制，其中加入终浓度质量比5% DMSO (二甲基亚砜)，终浓度5隱ol/LEGTA (乙二醇 二乙醚二胺四乙酸)，终浓度质量体积比10%蔗糖，再加入终浓度5 Pg/ml FITC-ph (异 硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)；8) 染色去除清洗液后加入染色液，在黑暗条件下25'C孵育1 h;9) 洗涤标记后的样品用0. 1 mol/L PBS缓冲液(磷酸缓冲液)清洗3次，获 得标记好的样品；10) 封片及观察标记好的样品滴加在载玻片上，并用体积比50%甘油封片，最 后在激光共聚焦显微镜(Bio-Rad MRC 1024 ES， Ar/Kr激光，激光波长为488 nm) 下进行观测，沿Z轴进行连续光学切片，并将所有光学切片进行三维重构,结果如图2， 能清晰地观测到微丝骨架在花粉和花粉管中的分布状况。图2a花粉粒内微丝呈丝状， 在花粉萌发孔处聚集。图2b在花粉管内，微丝呈现束状沿花粉管长轴分布，花粉管 顶端区域(离尖端大约IO urn)没有发现有微丝存在。图3对照。图3-a为先用鬼笔环肽(phalloidin)处理，然后用FITC-ph (异硫 氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)染色液标记后在激光共聚焦显微镜(激发光波长为488
nm)下所观测的图像，结果没有观察到花粉和花粉管内微丝骨架；图3-b为用FITC (异硫氰酸荧光素)代替FITC-ph (异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)标记后在激光 共聚焦显微镜(激发光波长为488 nm)下所观测的图像，花粉和花粉管内均有强荧 光，但未观察到微丝骨架结构。说明FITC-ph (异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)能 特异性地标记花粉或花粉管内微丝骨架。图4用TRITC-ph (四甲基罗丹明B异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)替代 FITC-ph (异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽)的染色液按照图1流程图标记后在激光 共聚焦显微镜(激发光波长为568 nm)下观测到的花粉和花粉管微丝骨架的结构与分 布情况，花粉粒中由于外壁的自发荧光(三角形所示)，无法确定亮区内部微丝骨架 的结构形态与分布，但在未萌发的花粉萌发孔处看见点状结构(图4-b，箭头所示)， 在花粉管内可以看见微丝成束状沿花粉管长轴分布，在花粉萌发孔处也能看到微丝的 分布(图4-c，箭头所示)。图4-a为不含TRITC-ph染色液按照图l流程图标记后在 激光共聚焦显微镜(激发光波长为568 nm)下所观测到的花粉外壁的自发荧光。
权利要求
1、一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法，包括1)花粉的采集采集开花当天的花粉，采集梨树开花当天的花粉，自然干燥后密封，-20℃低温保存；2)花粉培养基按照质量比制备蔗糖，10％；聚乙二醇PEG4000，15％；H3BO3，0.01％；Ca(NO3)2·4H2O，0.03％；MgSO4·7H2O，0.02％；KNO3，0.01％；溶剂，水；用30mmol/L的2-(N-吗啉基)乙磺酸MES缓冲液调pH值至6.5；3)花粉的培养取步骤1)干燥后的花粉，放入花粉培养基中，在恒温25℃黑暗条件下分别培养0.5h或2h，培养0.5h的花粉，用于花粉粒内微丝骨架的荧光标记；培养2h得到花粉管，用于花粉管内微丝骨架的荧光标记与观察；4)预固定培养后的花粉或花粉管，用新鲜的花粉培养基配制的200μmol/L顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯MBS预固定5-10min；5)固定然后用含有质量比2％多聚甲醛和质量比4％多聚甲醛、pH为6.8的0.1mol/L磷酸缓冲液PBS室温条件下固定花粉或花粉管0.5h；0.1mol/L PBS缓冲液的配制NaH2PO4·2H2O2.964g和Na2HPO4·12H2O28.998g加蒸馏水定容至1000ml，pH6.8；6)洗涤用0. 1mol/L PBS缓冲液清洗2-3次，去除清洗液；7)染色液的配制染色液用pH6. 8的0.1mol/L PBS缓冲液配制，其中加入终浓度质量比5％的二甲基亚砜DMSO，终浓度5mmol/L的乙二醇二乙醚二胺四乙酸EGTA，终浓度质量体积比10％的蔗糖，再加入终浓度5μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽FITC-ph；8)染色加入染色液，在室温黑暗条件下孵育0.5-1h；9)洗涤用0. 1mol/L PBS缓冲液清洗2-3次，获得标记好的样品；10)封片标记好的样品滴加在载玻片上，并用体积比50％甘油封片观察。
2、 根据权利要求1所述的一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法，其特征在 于步骤4)用顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯MBS预固定的时间为7min。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤8)孵育时间为lh。
全文摘要
本发明提供了一种梨花粉和花粉管微丝骨架的荧光标记方法，属于生物技术领域。包括采集成熟花粉，在培养基中分别培养花粉0.5h和2h，用新鲜的花粉培养基配制的200μmol/L MBS(顺丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯)预固定5-10min后分别用2％多聚甲醛和4％多聚甲醛各固定0.5h，洗涤花粉(管)，用终浓度为5μg/ml[含5％DMSO(二甲基亚砜)]的FITC-ph染色液(异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽染色液)，在25℃避光下染色0.5-1h，微丝骨架被荧光标记。本发明具有操作简单、快速、标记效果好、对微丝骨架结构破坏小等特点，可用于蔷薇科植物花粉(管)的开发利用，实际应用价值高。
文档编号G01N21/64GK101398381SQ20081023498
公开日2009年4月1日 申请日期2008年11月12日 优先权日2008年11月12日
发明者刘珠琴, 俊 吴, 吴华清, 张绍铃, 肖家欣 申请人:南京农业大学