专利名称：检测莱克多巴胺药物残留的胶体金试纸卡的制作方法
技术领域：
本实用新型属于兽药残留的免疫化学速测技术领域，具体涉及一 种检测试纸卡。
背景技术：
莱克多巴胺(Ract叩amine )属于(3-兴奋剂。|3-兴奋剂是营养重 分配剂一种，是一类结构和功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙 醇胺类衍生物，它可以加快畜禽生长速度，降低酮体脂肪含量，提高 痩肉率。在欧盟P-兴奋剂已被禁止用于家禽的生长促进剂，我国在《禁 止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中也有明文规定。但 由于莱克多巴胺属于非处方药，且价格远低于克仑特罗，因此其非法 应用者不断增多。本方法为莱克多巴胺单克隆抗体酶联免疫快速检测 试剂盒，可用于尿样、动物组织(肌肉、肝脏等)中的残留检测。
目前莱克多巴胺残留常用的检测方法有两种。 一种是色谱分析， 如气相色谱法(GC),由于复杂的仪器设备和繁瑣的过程，不适合现 场监控和大量样本筛查。另一种为免疫学方法，如酶联免疫吸附法 (ELISA)。它的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基层单位 推广使用。而且，这两种方法都需要专业技术人员进行操作。
实用新型内容
本实用新型的目的在于针对上述不足提供一种敏感度高、成本 低、操作简单、检测时间短的试纸卡。
本实用新型的试纸卡包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样 品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，与常规试纸卡不同的是， 其中的结合物释放垫不是完全覆盖在样品吸收垫之下，而是部分区域 覆盖于样品吸收垫之下，优选结合物释放垫的二分之一区域覆盖于样
品吸收垫之下。
这样做的好处是可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以 将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜 上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰 成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。
所述反应膜上分别包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物构成的检 测线印迹"I "和包被羊抗鼠IgG构成的质控线印迹"I "。从而可 以用于莱克多巴胺残留的检测。
本实用新型试纸卡的底板为可PVC板或者是其它硬质而不吸水 的材料；反应膜可为硝酸纤维素膜或者醋酸纤维素膜；样品吸收垫可 由玻璃棉或聚酯材料制成；结合物释放垫可由纤维制成，结合物释放 垫层包被有抗体-胶体金结合物。在样品吸收垫与结合物释放垫及吸 水层上覆盖有保护膜，在玻璃棉和纤维层一侧约0.4cm处喷制样品标 记线。
偶联莱克多巴胺金标载体蛋白可用卵血清蛋白、或人血清白蛋 白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白等，在反应膜上的检测线印迹和质控线 的对照印迹组合排列可为"II "。
本实用新型具有有益的积极效果，莱克多巴胺快速检测试纸卡具 备下列各项有点
l.特异性强，敏感度高。莱克多巴胺快速检测试纸卡以胶体金标 记高亲和力的单克隆为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子 之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对 单克隆特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速 检测试纸卡具有较高的特异性和敏感性。可检测5ng/ml。
2.搡作简便快速。使用快速检测试纸卡时无需任何其它试剂，只 要将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴加3滴(约100微升)，加后计时, 5~8min内观察结果。
3.显示检测结果形象、直观准确。快速检测试纸卡以显示红线色
"I "及"II "印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显 示一条红线"I "印迹表示在被检测样品液中含有莱克多巴胺，两条红 线"ll"印迹表示在被检测样品中不含莱克多巴胺，结果判定形象、直 观、准确、简单明了，不容易出现阴性和假阳性误判。
4. 成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及 其他试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
5. 易于大范围推广应用。快速检测试纸卡操作简单，人人都可操 作，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生 防疫、质量监测、动物产品加工、集化养殖到个体养殖等，具有广阔 的巿场前景和较大的经济、社会效益。
图l为莱克多巴胺快速检测试纸卡结构示意图，其中，1、样品吸 收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、 质控线；7、底板；
图2为莱克多巴胺快速检测试纸卡俯视结构示意图，其中8-l和8-2 是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线；
图3为莱克多巴胺快速检测试纸卡阴性(图3."、阳性(图3.b)、 无效(图3.c)显色示意图，其中T质控区，C为检测区。
具体实施方式
实施例l试纸条的组装
参见图l、图2:样品吸收垫l用玻璃棉制成，结合物释放垫层2 为吸附有莱克多巴胺的金标载体蛋白标记物的纤维层，根据可按下面 制备方法，制备包被有莱克多巴胺金标抗体纤维层，简称莱克多巴胺 胶体金标记物，3为反应膜层，本实施例采用硝酸纤维素膜，4吸水 垫为吸水材料层制成，5为检测区包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联 物，6为质控区包被有羊抗鼠IgG构成指质控线，7为PVC背衬为支持 层，用塑料薄片条制成，在PVC背衬上按顺序粘附硝酸纤维素膜、吸水垫、结合物释放垫和样本垫，将样本垫覆盖在结合物释放垫二分之
一处，8-l为白色保护膜，覆盖在样品吸收垫和结合物释放垫上，在 样品吸收垫和结合物释放垫交界处对应保护膜8-l位置偏向于样品吸 收垫一方0.5cm处印有标记线9， 9的右端印有箭头及max字样，滤纸 层4即为吸水层(手柄端)上覆盖有浅蓝色保护膜8-2。
要制成莱克多巴胺快速检测试纸卡首先需制备偶联莱克多巴胺 载体蛋白，制备检测线，制备胶体金，用于制备金标抗体纤维，其次 须制备羊抗鼠IgG抗体，用于制作质控线。以下是相关材料的制备方 法
1.莱克多巴胺载体蛋白的偶联
l.l制备莱克多巴胺半抗原
莱克多巴胺半抗原6g莱克多巴胺，12g琥珀酸酐和8.7ml三乙 基氨用100ml吡啶溶解。回流一小时。减压蒸馏去溶剂，残余物用5 %NaHC03水溶液溶解，用乙醚洗涤两次，然后用H2S04进行酸化(pH 到2.0)，用水洗涤固形物(为三氯乙基半琥珀酸酯)两次，用氯仿-乙烷使其结晶(产量约75%,熔点(88℃~89℃)。取2.5g半琥珀酸 酯溶于6.5ml亚硫酰氯中，65℃加热30分钟。减压蒸发，干燥l小时 (高度真空条件下)。将上述产物溶于15mlN，N-二甲基-乙酸乙酰胺 中，室温搅拌2小时。65匸真空蒸发后，用异丙醇使结晶析出来，用 溶于二甲基甲酰胺中的锌和醋酸解离三氯乙酯，得到莱克多巴胺-半琥动酸酯。
1.2莱克多巴胺半抗原与载体蛋白的偶联
取EDC100mg，用pH8.0的10mmol/LPBS液1.5mL使之充分溶 解(I液)。取莱克多巴胺半琥珀酸酯25mg，用0.5mlDMF溶解(II 液)。取HSA80mg，溶于2ml 10mmol/L PBS ( PH8.0 )液中(III液)。 将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)。室温 下避光搅拌l小时，逐滴加入余下的I液。4度搅拌12小时。静置
10小时(4度)。用蒸馏水使之充分透析(约48小时)。 1.3莱克多巴胺-载体偶联物的鉴定
将载体蛋白、莱克多巴胺半抗原、莱克多巴胺-载体蛋白偶联物 用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4 PBS调零，用 紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描，得到载体蛋白、莱克 多巴胺半抗原、莱克多巴胺-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现 不同的吸收曲线，表明莱克多巴胺与载体蛋白偶联成功。
2. 抗莱克多巴胺克隆抗体的制备
2.1动物免疫
将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为80pg/只，使其产 生多克隆抗体。细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5:1 比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，釆用间接竟争ELISA法测定细胞上 清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直接到得 到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2.2细胞冻存和复苏
将莱克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成lxl()S个/ml 的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37'C 水洛中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
2.3单克隆抗体的制备与纯化
将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4ml/只，7天后腹腔注射莱 克多巴胺的单克隆杂交瘤细胞株c-l-l 5"05个/只，7天后釆集腹水。 用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-2(TC环境保存。
3. 莱克多巴胺金标抗体和金标标记物的制备
3.1胶体金的制备
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%，置磁力加热棒搅拌 器上搅拌煮沸，每100ml 0.01。/Q氯金酸加入2ml 1。/。柠檬酸三钠，继续 煮沸，至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期为一个月。 莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按 l-2吗/ml抗体胶体金加入抗体莱克多巴胺抗体，继续搅拌混匀30min， 加入10% BSA至终浓度为1°/。，静置30min。 12000rpm、4。C离心30min， 弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用初始胶体金体积1/20的 复溶缓冲液将沉淀重悬，置fC备用，保存60天。
复溶缓冲液用含牛血清白蛋白(BSA) 0.02 0.1%，吐温-20 0.05~0.2%,维生素C(Vit-C)0.r/。， 0.02MpH9.0的硼酸复溶缓冲液。
4. 羊抗鼠IgG抗体的制备
羊抗鼠抗抗体的制备以山羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫 原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
5. 莱克多巴胺快速检测试纸卡实施检测原理
当莱克多巴胺检测试纸卡的样品吸收垫端滴加待测样品溶液后， 待检溶液通过金标抗体棉中的金标抗体一起向反应膜扩散，并最终渗 入滤纸中，扩散过程中检测莱克多巴胺可与金标抗体相结合，进而封 闭金抗体上莱克多巴胺的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上偶联 莱克多巴胺色载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊抗 鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，质控区显色，形成一条红色对照印 迹"1"，呈一条印迹为阳性，相反样本溶液中无莱克多巴胺则不能 阻止金标抗体与纤维素膜上偶联莱克多巴胺的载体蛋白检测印迹结 合，检测区显示红色印迹"I "，同样羊抗鼠IgG抗体也与金标抗体结 合，质控区也显示红色对照印迹"I "，形成两条红线"II "阴性标 记，如果纤维素膜上没有红色标记显示，则试纸卡无效。 5.莱克多巴胺快速检测试纸卡检测实施列操作方法 5.1样本前处理
动物组织(鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝)样本称取1.0士0.05g匀质过的组织样本于离心管中，加入lmlPB缓冲液，盖紧瓶盖在微沸的水 洛锅中水洛10min,取出后静置回至室温后，取100微升进行点样检 测。检测限为5ng/g。
尿液样本处理
尿样本 一般可以直接检测，当尿液呈浑浊状态则釆用滤纸过滤 处理后，取100微升进行点样检测。
5.2用试纸卡检测
将样品用滴管滴入试剂卡孔内，滴力口3滴，加后计时，5 8min内 观察结果。超过10min样品检测判读无效。
5.3检测结果分析
莱克多巴胺在样品中浓度高于5ng/ml时，胶体金标记的莱克多 巴胺抗体与莱克多巴胺全部结合，从而在检测区内因为竟争反应不会 与莱克多巴胺偶联物结合而不出现红色条带。阴性样品在检测过程中 由于缺少抗体抗原竟争反应，将会在检测区与质控区内出现红色条 带。
阳性；当质控区显示一条红色条带，而检测区不显色，快速检测 试纸卡以显示红线色"1"，判为阳性，如图3中间图所示。
阴性当质控区显示一条红色条带，检测区同时也显示出一条红 色条带，且检测区颜色接近或浅于质控区时，快速检测试纸卡以显示 红线色为"11"，判为阴性。如图3左图所示。
无效当质控区不显示出红色条带，则无论检测区显示出红色条 带与否，该试纸卡判为无效。如图3右图所示。
权利要求1.一种检测莱克多巴胺药物残留的胶体金试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其特征在于，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。
2、 如权利要求1所述的试纸卡，其特征在于，结合物释放垫的 二分之一区域覆盖于样品吸收垫之下。
3、 如权利要求l或2所述的试纸卡，其特征在于，所述反应膜 上具有包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹"I " 和包被羊抗鼠IgG构成的质控线印迹"I "。
4、 如权利要求3所述的试纸卡，其特征在于，所述的检测线与 质控线平行。
5、 如权利要求3所述的试纸卡，其特征在于，检测线位于距离 结合物释放垫一侧0.4cm处。
6、 如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，在试纸卡的 两端分别覆盖有保护膜。
7、 如权利要求l或2所述的试纸卡，其特征在于，所述底板为PVC板，所述反应膜为硝酸纤维素膜。
8、 如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的样品 吸收垫由玻璃棉或聚酯材料制成。
9、 如权利要求l或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的结合 物释垫层由纤维制成。
10、 如权利要求1或2所述的试纸卡，其特征在于，所述的结合 物释放垫层包被有抗体-胶体金结合物。
专利摘要本实用新型提供了一种检测试纸卡，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜层上具备包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成指质控线；结合物释放垫包被有莱克多巴胺的胶体金标记物。采用本实用新型试纸卡是可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液体充分吸收与金标抗体完全接触充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。
文档编号G01N33/558GK201181297SQ200820078839
公开日2009年1月14日 申请日期2008年1月30日 优先权日2008年1月30日
发明者万宇平, 何方洋, 冯才伟, 冯才茂, 吴小平, 亮 朱, 汪善良, 沈建忠, 赵正苗 申请人:北京望尔生物技术有限公司;北京望尔康泰生物技术有限公司