专利名称：：圆窗膜离体通透性试验装置的制作方法
技术领域：
：本实用新型涉及一种圆窗膜的试验装置，利用该装置能在离体状态下检测圆窗膜对药物的通透性，从而为研究内耳药物新剂型提供实验基础。
背景技术：
：内耳包括耳蜗与前庭，结构精细，含有听觉与平衡觉的感觉神经末梢。内耳系统疾病的临床发病率约占耳科疾病的1/3，药物治疗为首要的治疗方法，例如使用激素(甲基强的松龙、地塞米松)或神经营养剂治疗突发性感音神经性耳聋，用氨基糖甙类抗生素进行化学性迷路切除治疗顽固性外周性眩晕，用激素、神经营养剂等治疗耳鸣。在某些内耳手术过程中或术后也需要使用激素或神经营养剂保护内耳功能，例如镫骨切除术、电子耳蜗植入术。由于血-迷路屏障的存在，通过口服或静脉(全身给药)给入体内的药物到达内耳组织会受到障碍。为了在内耳达到有效的治疗浓度而提高全身给药剂量将会增加肝肾的代谢负担以及加大对其他器官产生毒副作用的可能性。近年来，经圆窗膜局部给药治疗内耳疾病的方法以其直接性及对身体低毒性的优点而成为耳科学研究的热点[1-5]。圆窗膜具有生物半透膜性质，被引入中耳鼓室的药物可以经圆窗膜直接渗透到内耳。这种给药方法跨越了血-迷路屏障，药物的使用剂量小，而到达内耳的浓度较高，从而在全身血药浓度几乎为零的情况下实现内耳有效的药物浓度，对身体其他器官不会产生毒副作用[6]。目前共有四种方法将药物引入圆窗附近，以维持药物在内耳的稳定作用浓度与作用时间半植入式微管(MircoCath)、微型虹吸管(MicroWick)、固态载药材料(如明胶)以及经鼓膜注射缓释制剂[7-9]。其中经鼓膜注射缓释剂最具微创性，该技术以现代药剂学的发展为基础，研制用以治疗内耳疾病的缓释制剂，如脂质体、微囊等，具有良好的应用前景。在内耳给药的临床前期研究中，圆窗膜对药物的通透性为首要的观察指标。由于圆窗膜结构精细，取材困难，因此绝大多数圆窗膜通透试验为在体的动物试验[10-12]。该方法的缺点是代价较高并且干扰因素较多在体动物实验需要通过外科手术将药物给入中耳腔，动物的个体差异以及给药的操作方式是造成结果变异性的较大原因；约有半数的动物有假性圆窗膜，直接阻碍药物与圆窗膜的接触;另外，为了检测外淋巴内的药物浓度，抽取外淋巴液的方法也需要通过外科手术，如耳蜗底回外淋巴抽取术，约有一半的外淋巴在取材过程中被脑脊液稀释；尽管目前Dr.Salt和Dr.Plontke提出从蜗尖所取得的外淋巴液中脑脊液的含量大大减少，然而该方法的手术路径相对复杂；此外，在体动物的外淋巴含量极少(豚鼠鼓阶外淋巴约为4微升)，对检测技术也有相当高的要求[13,14]。因此，为了降低圆窗膜通透性试验的成本以及减小复杂的在体实验操作所带来的结果变异性，离体圆窗膜药物通透性试验是值得探讨与摸索的方法。目前，常规应用于透膜药学试验的装置有Franz扩散池，该装置由供给室与接受室两部分组成(图1)，取自活体动物的生物膜组织(如皮肤或角膜)可直接夹于Franz扩散池的两室之间。实验时接受室注满相应的体液成份(如生理盐水或房水)，受试药物给入供给室；透过生物膜的药物进入接受室后，可以抽取液体检测药物浓度，得到透膜的时-药曲线。由于动物的圆窗膜面积极小(豚鼠圆窗膜平均l-2mm2)且菲薄，离体试验装置的设计难度大于透皮或透角膜试验的Franz扩散池。搜索近15年的文献中，仅有Witte和Kasperbauer(2000)设计了离体圆窗试验装置以研究圆窗膜对转化生长因子Alpha的通透性(图2)[15]。该装置用环氧树脂连接两侧塑料试管(分别用作中耳腔与鼓阶外淋巴腔)与中间带孔的塑料板，完整的圆窗膜连同圆窗龛取材于豚鼠，并被粘于培养皿的中心孔处，构成药物通透两室的膜性屏障；实验时两室分别给予4ml液体。该装置的不足之处在于塑料试管与培养皿壁存在吸附药物分子的可能性；连接材料环氧树脂对生物活性组织如圆窗膜可能有毒性作用；接受室与供给室给予同体积的液体，不符合生理情况下圆窗膜给药的体积与内耳容积的比例。参考文献1.KanzakiJ,OuchiT，TsuchihashiN.Steroid-responsivesensorineuralhearingloss:combinationtherapywithprednisoloneand《airei-to.ORLJOtorhinolaryngolRelatSpec1993;55:24-29.PMID:84415202.SheaJr，GeX.DexamethasoneperfusionofthelabyrinthplusintravenousdexamethasoneforMeniere'sdisease.OtolaryngolClinNorthAm1996;29:353-358.PMID:88609333.LammK,ArnoldW.Theeffectofprednisoloneandnon-steroidalanti-inflammatoryagentsonthenormalandnoise-damagedguineapiginnerear.HearRes1998;115:149-161.PMID:94727444.NiedermeyerHP，ZahneisenQLuppaP，BuschR,ArnoldW.Cortisollevelsinthehumanperilymphafterintravenousadministrationofprednisolone.AudiolNe画tol2003;8:316-321.PMID:145661025.YeQ,TilleinJ，HartmannR,GstoettnerW，KieferJ.Applicationofacorticosteroid(Triamcinolon)protectsinnerearfunctionaftersurgicalintervention.EarHear2007;28:361-369.PMID:174859856.GoycooleaMV,L皿dmanL.Roundwindowmembrane.Structureflinctionandpermeability:areview.MicroscResTech1997;36:201-211.PMID:9080410JacksonLE,SilversteinH.Chemicalperfusionoftheinnerear.Otolary，lClinNorthAm2002;35:639-653.PMID:124868457.Jackson￡E，SilversteinH.Chemicalperfusionoftheinnerear.OtolaryngolClinNorthAm2002;35:639-653.PMID:124868458.BaloughBJ,HofferME,WesterD,O'LearyMJ,BrookerCR,GotoM.KineticsofgentamicinuptakeintheinnerearofChinchillalangieraftermiddle-earadministrationinasustained-releasevehicle.OtolaryngolHeadNeckSurg1998;119:427-431.PMID:98070649.SheppardWM,WanamakerHH,PackA,YamamotoS,SlepeckyN.Directroundwindowapplicationofgentamicinwithvaryingdeliveryvehicles:acomparisonofototoxicity.OtolaryngolHeadNeckSurg2004;131:890-896.PMID:1557778610.ChandrasekharSS.Intratympanicdexametkasoneforsuddensensorineuralhearingloss:clinicalandlaboratoryevaluation.OtolNeurotol2001;22:18-23.PMID:1131471011.WeeS,GombotzWR.Proteinreleasefromalginatematrices.AdvancedDrugDeliveryReviews1998;31:267-285.PMID:1083762912.KatoY，OnishiH,MadiidaY.Applicationofchitinandchitosanderivativesinthepharmaceuticalfield.CurrPharmBiotechnol2003;4:303-309.PMID:1452942013.SaltAN,HaleSA，PlonkteSK.Perilymphsamplingfromthecochlearapex:areliablemethodtoobtainhigherpurityperilymphsamplesfromscalatympani.JNeurosciMethods2006;153:121-129.PMID:1631085614.SaltAN，MaY.Quantificationofsoluteentryintocochlearperilymphthroughtheroundwindowmembrane.HearRes2001;154:88-97.PMID:1142321915.WitteMC，KasperbauerJL.Roundwindowmembranepermeabilitytotransforminggrowthfactor-a:Aninvitrostudy.OtolaryngolHeadNeckSurgery2000;123(1Pt1):91-96.PMID:10889488
发明内容为了在体外模拟动物实验中透圆窗膜给药的生理环境，本实用新型提供一种圆窗膜通透试验装置(图3)，该装置不仅能够提供仿生状态下的圆窗膜通透试验环境，而且还能够重复使用，节约实验成本。本实用新型要解决的技术问题是模拟生理状态下圆窗膜两侧的中耳腔及内耳的立体环境关系；保持新鲜离体圆窗膜的生理活性；确保各实验组件之间的可靠连接；为药学检测提供采样通道。本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种圆窗膜的离体通透试验装置，该圆窗膜的离体通透试验装由圆窗膜、供给室、接受室及中间带孔的圆片组成，供给室代表中耳腔，接受室代表鼓阶外淋巴腔，圆片位于两室之间，圆窗膜位于圆片中央孔，各组件顺序封接,模拟生理环境下的鼓室与内耳的关系。按照本实用新型，供给室和接受室的内径都为lcm，接口处为磨砂玻璃；供给室高lcm，接受室高1.5cm;接受室与取样管形成连通器，取样管内径2mrn，高度略高于接受室，接受室的容积为1.2ml。按照本实用新型，圆片中央的孔为漏斗形，大口朝向接受室，即内耳侧，小口朝向供给室，即鼓室侧；圆窗膜位于中央孔的鼓室侧。该漏斗形的小孔能够避免气泡存留o按照本实用新型，每个组件的连接使用无毒且防水的牙科水泥。组件的连接过程分步进行,并在每一步骤完成后进行质量控制，以确保组件间连接的可靠性。本实用新型的有益效果是使用对药物影响低的玻璃组件及无毒性的连接材料构建适合圆窗膜的离体试验装置，可模拟生理状态下的透圆窗膜给药的环境，能节约实验成本并提高结果的可靠性，为内耳局部靶向给药研究提供方便可靠的基础实验条件。图1Franz扩散池，该Franz扩散池用于体外透皮试验和离体角膜通透试验，由供给室与接受室组成，取自活体动物的生物膜组织可直接夹于两室之间；图2Witte和Kasperbauer所设计的离体圆窗膜试验装置，该离体圆窗膜试验装置所用的材料主要为聚乙烯培养皿和试管；图3圆窗膜离体实验装置示意图4;图4亚甲基蓝累积释放曲线；图5地塞米松试剂的累积释放曲线。具体实施方式设计由玻璃材料构成的供给室1、接受室4及中间带孔的聚苯乙烯圆片2。供给室1代表中耳腔，接受室4代表鼓阶外淋巴腔，这两个组件由手工定制而成，其大小根据Franz扩散池的比例縮小而来，并根据玻璃工的手艺进行适当调整。两室的内径都为lcm，接口处为磨砂玻璃。供给室1高lcm，接受室4高1.5cm;接受室4与取样管3形成连通器，取样管3内径2mm，高度略高于接受室4，取样管3为药学检测提供采样通道。接受室4的容积为1.2ml。聚苯乙烯圆片2附有圆窗膜，聚苯乙烯圆片2取材于培养皿，中央的孔为漏斗形，由金刚砂钻头磨成，大口朝向接受室4，即内耳侧，小口朝向供给室l，即鼓室侧；漏斗形的小孔能够避免气泡存留。圆窗膜取材于新鲜处死的豚鼠听泡，该过程用手术钻在显微镜下小心操作完成，并检査分离假性圆窗膜，然后短期保存于4'C林格氏液中，整个实验时间不超过24小时，确保圆窗膜的生理活性。装置的连接使用无毒且防水的牙科水泥，连接过程分步进行，并在每一步骤完成后进行质量控制，排除有渗漏的装置。其具体操作如下显微镜下用小棉球将圆窗龛表面拭干，用牙科水泥将圆窗龛(内耳侧)的骨壁封接于聚乙烯片小圆孔(中耳侧)周围，即圆窗膜位于中央孔的鼓室侧。约三分钟后水泥干固。滴林格氏液于圆窗膜及水泥周围，若数十秒内有液体渗透到圆孔的另一侧，使干燥的小棉球变湿，证明水泥有渗漏，这样的标本多被淘汰，少数标本用牙科水泥修补后经检査没有渗漏。然后用牙科水泥将聚乙烯圆片的中耳侧周围与供给室磨口封接。待干后向供给室注满林格氏液，观察一分钟内液面有无下降，用干燥棉球擦拭封接处是否变湿(同样包括小圆孔的内耳侧)，如果液面稍有下降或棉球变湿，则证明封接处水泥有渗漏，这样的标本被淘汰。用同样的方法封接接受室与圆片的内耳一侧，待水泥干固后向取样管注满林格氏液，观察一分钟内取样管的液面有无下降，用干燥棉球擦拭封接处是否变湿,如果液面稍有下降或棉球变湿，证明封接处有渗漏，经修补后仍有渗漏的标本则被淘汰。初步检漏的步骤穿插于装置构建的全过程之中。实验结束后除圆窗膜外，各组件可回收消毒，重复利用。试验一体外圆窗膜试验装置的建立与质量控制1材料与方法1.1试剂及仪器戊巴比妥钠(分析纯)；林格氏液(北京双鹤药业)；亚甲基蓝(化学纯)；牙科水泥(A粉及B液)；解剖剪；游丝镊；聚乙烯培养皿；解剖显微镜(OlympuS)，手钻及钻头；电子天平；分光光度仪(UV-120-2,Shimadzu，Japan)。1.2装置的设计与渗漏检测(如前所述)1.3亚甲基蓝通透试验观察亚甲基蓝标准曲线的制备用电子天平称量亚甲基蓝，分别配成O.l、0.2、0.5、1.0、1.5、7.0、8.0pg/ml标准液，用分光光度仪在665nm波长下检测吸光度[6]。以亚甲基蓝浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归得到标准曲线。选择3个构建好的圆窗膜体外通透装置，使接受室充满林格氏液。配制IOmg/ml亚甲基蓝溶液，分别向供给室滴加0.21111，用胶膜覆盖供给室上口。分别于20、40、60、120、180min从取样管抽取接受室内的液体0.2ml，同时补充相等体积林格氏液。将收集的样品用分光光度仪在665nm下检测吸光度。观察整个实验过程中取样管液面有无上升或下降、牙科水泥封接处有无蓝色液体渗出；若出现上述情况中之一，则提示圆窗膜破损或封接处存在渗漏，该装置将被放弃。2结果将亚甲基蓝的标准曲线进行线性回归，得到方程y=0.1252Z+0.0099，i2=0.9991，证明其线性相关性良好。将测得的样品吸光度，带入标准曲线求得各个时间点的浓度(C")，用公式a=CK^C—t算得各个采样点的累积释放量(a)，并绘制累积释放量-时间曲线(图3)。其中C"为实时浓度；F'为介质体积，本实验为接受室的体积l，2ml;K为取样体积，本实验为0.21111。将Qn分别代入零级、Higuchi释放方程m进行拟合，得到每种方程的回归系数i^2-0.0934f-1.2156(零级释放方程)，i2=0.9084;g=0.6833—/2-3.771(Higuchi释放方程)，f=0.825。表明3h内亚甲基蓝对圆窗膜的通透更符合零级释放。3讨论3.1扩散池设计合理性的讨论自从1956年Schuknecht首次报告经鼓膜向中耳腔注射硫酸链霉素治疗梅尼埃病(menieredisease,MD)以来，经鼓室给药治疗内耳疾病的研究已有近半个世纪的历史。然而，迄今为止多数研究工作仍然采用体内动物实验和较为简单的临床观察。由于药物进入内耳后的吸收、分布、清除等影响因素甚多，因此体内实验的过程难以控制，实验结果的重复性和可信性较差。尤其在开发内耳给药的新剂型方面，严密而可靠的体外试验非常重要。近年来，关于缓释剂型内耳局部给药的研究已有若干报道。Balough等向栗鼠中耳注射纤维蛋白凝胶(fibringlue)与庆大霉素(GM)的混合物；以此凝胶态纤维蛋白为GM的缓释载体。殷团芳等将透明质酸和链霉素的混合物灌注圆窗，但只观察了形态学和电生理指标。由于没有用体外试验说明他们所用的制剂的释药性能，他们的实验结果均缺乏说服力。只有Witte等在研究转化生长因子-a对圆窗膜的通透特性的实验中，模拟了中耳腔与内耳环境，用聚乙烯材料、试管及豚鼠圆窗膜构建成双室模型。该装置由左室和右室构成，分别代表中耳腔和外淋巴腔；处于两室之间中心处的培养皿钻有一直径约1.5mm的？L，圆窗膜(连有圆窗龛)即被牙科水泥封接于此孔(与图2类似)。实验时左室给予4ml含有转化生长因子-a的溶液，右室给予等体积的培养液。其观测时间共4天。本实验所设计的圆窗膜体外试验装置对其进行了改进，不同之处①Witte的装置中培养皿与试管之间用环氧树脂粘连；本实验所有封接处均使用牙科水泥，对体外圆窗膜的刺激性更小。②Witte设计的装置为左右两室，分别代表中耳腔与外淋巴腔，实验时两室各给予4ml的液体；本实验装置由上下两室构成，分别代表中耳腔与外淋巴腔，实验时上室(供给室)给予药液0,2ml、没过圆窗膜约2mm，下室(接受室)充满林格氏液，体积为l,2ml，此比例更接近生理条件下的给药情况，因为生理条件下给予较少的药液浸没圆窗，而外淋巴腔的容积则相对较大。③Witte的实验中，从开始观测到实验结束所用的时间共4天；本实验从取圆窗膜到实验结束均在两天内完成。由于圆窗膜体外后脱离了生理存活环境，实验时间越短、圆窗膜将越接近生理状态，因此本实验设计在两天内完成。如果实验条件能够进一步改善，本实验可以在24小时内完成。体外透皮试验/透角膜试验装置-Franz扩散池为药剂学已经广泛成熟应用的体外试验装置，本实验设计的圆窗膜体外试验装置与其相比则较显粗糙，但我们在实验过程中采取了相应的补偿方法①Franz扩散池由于尺寸较大(通常高5cm)，因此实验时下室(接受室)可放入星形搅拌子、置于磁力搅拌器上，其中的液体可被混合均匀。而本实验由于圆窗膜极小，因此接受室的高度仅1.5cm、外径lcm，没有合适的搅拌子；为了使接受室内的液体混合均匀，每次取样前及取样过程中都需摇晃装置数次。②大多数Franz扩散池的接受室设计有恒温水夹层，可以通过恒温水来维持实验过程中接受室的温度。而本实验装置体积太小，因此未设计恒温水夹层；本实验观测过程中保持室温为25'C。③用Franz扩散池进行实验时，体外的皮肤或角膜被夹于供应室与接受室之间，无需使用粘连材料。而本实验由于圆窗膜极小，必需粘于带孔的聚乙烯薄片方能使之固定，因此供给室、薄片、接受室之间也需要粘连材料。本实验使用的粘连材料全为无刺激且防水的牙科水泥，并在整个实验过程中密切注意粘连处的渗漏情况，一但发现即淘汰该标本。总结Witte和Kasperburer的经验及Franz扩散池的结构，本实验吸取其优点并根据情况进行了若干改进，较好解决了体外圆窗膜通透试验中可能出现的各种问题。3.2亚甲基蓝透膜释放曲线亚甲基蓝属于小分子染料，价格便宜且用普通分光光度仪即可进行检测，因此本实验选择亚甲基蓝作为模型药，对设计实验装置进行检测。根据罗宗铭等[6]的经验，亚甲基蓝在665nm的检测波长下其吸光度最强，因此，本实验以665nm波长为检测波。所测得的标准液回归系数为0.9991(>0.999)。据此可以认为，其浓度在0.1-8.(Vg/ml时对吸光度具有良好的线性相关性。本实验以10mg/ml亚甲基蓝溶液作为释放液注入供给室，三小时内亚甲基蓝逐渐经圆窗膜渗透到接受室，可观察到接受室内液体的颜色逐渐变蓝并加深。药物在3h内的吸光度由0.035到0.65，处于标准曲线的范围内。比较其累积通透量的模拟方程(零级和Higuchi方程)，相关系数W进行t检验证明两种方程的有统计学差异(t=6.137,P=0.026<0.05)，三小时内亚甲基蓝对圆窗膜的通透更符合零级释放，即符合表面扩散机制[1()]。并且可以证明该体外通透装置的可靠性。试验二离体圆窗膜对地塞米松不同制剂的通透性材料和方法一、主要设备、材料高效液相色谱仪(AgilentllOO，美国);双室扩散池(自制)；色谱柱(Nova-Pak8C183.9*150mm);电子天平(BP3100Psartorius);解剖显微镜(Olympus);手钻及钻头；甲醇(色谱纯，天津四友)；地塞米松磷酸钠(天津天药)；林格氏液(北京天鹤)；海藻酸钠(分析纯)；羧甲基甲壳胺(青岛海汇)；牙科水泥(A粉及B液)。二、高效!相色谱(HPLC)分析方法的建立1.色谱行为考查根据文献[7]配制0.025mol/l磷酸二氢钾缓冲盐，以甲醇、缓冲盐溶液(体积比从40:60到60:40)作为流动相，分别进样空白淋格氏液和地塞米松磷酸钠标准液(以林格氏液代替人工外淋巴作溶剂)，在柱温25'C、240nm检测波长下考察保留时间和峰形。发现流动相甲醇:缓冲盐为46:54(V:V)保留时间约8.5min，空白林格氏液对药物没有干扰，地塞米松磷酸钠溶液峰形尖锐。2.建立标准曲线、回收率及精密度试验用lmg/ml的lt备液配制1、5、10、25、50、100、250、500和1000pg/ml的标准液。HPLC检测，每次进样10nl，每个浓度重复两针。以峰面积(A)对药物浓度(C)进行线性回归得标准曲线方程。另配地塞米松磷酸钠10、25、100pg/ml三种浓度的样品，于日内、日间分别进行HPLC检领!l,得到回收率及精密度。三、构建离体圆窗膜通透试验模型(如前所述)四、不同制剂的离体通透试验1.实验分组及配液以林格氏液为溶剂，20mg/ml地塞米松磷酸钠(DXM)为基础溶液(A组)，添加海藻酸钠(ALG)、羧甲基甲壳胺(CHI)辅料后配成四种组份(B-E):B:ALG(25g/l)+CHI(4g/l)+DXM(20mg/ml);C:ALG(25g/l)+CHI(6g/l)+DXM(20mg/ml);D:ALG(25g/l)+DXM(20mg/ml);E:CHI(4g/l)+DXM(20mg/ml)。各组溶液配制好后在超声清洗器内超声助溶混匀。2.分时段采样与检测每组制剂平行构建三个扩散池，接受室内灌满林格氏液，供给室用注射器加入药液0,2ml，用胶膜覆盖。室温下分别于20、40、60、120、180、300、420、540min从接受室取0.2ml液体注入lml离心管内，同时向接受池补入同样体积林格氏液。将所采集的样品用HPLC法在前述条件下进行检测。结果1.HPLC标准曲线、回收率及精密度试验1、5、10、25、50、100、250、500和1000吗/ml的标准液用前术方法及条件检测到的峰面积(A)对药物浓度(C)进行线性回归，得标准曲线方程y=14.72x-26.345，R2=0.99992。回收率及精密度检测相对标准偏差均小于10%(表1)，表明该检测方法具有可靠性。2.五组地塞米松制剂对圆窗膜通透量的检测目测所配制的五组制剂，不含辅料的地塞米松对照组(A组)与单独4g/l羧甲基甲壳素(E组)的流动性接近，几无黏性；其余三组的黏度相近且较大。从接受池釆集的样品用HPLC检测，将检测到的峰面积(Au)代入标准曲线，求得各个时间点的浓度(oo，用公式a=cFf算得各个采样点的累积释放量(a，表3)，其中"时测浓度；F(:介质体积，本实验为接受室的体积1.21111;F"取样体积，本实验为0.21111。将Qn分别代入零级、一级、Higushi释放方程^进行拟合(A组以3小时为界分两段拟合)，得到每种方程的回归系数R2(表3)。以时间为横坐标，累积释放量为纵坐标作图，得到五组制剂的累积通透释放曲线(图5)。从图l的实验结果可见，不含辅料的地塞米松对照组(A组)在给药3小时内释放曲线较陡，证明药物迅速透过圆窗膜释放到接受池，表3示给药后3小时释放符合零级方程，其速释放速率为0.2407pg/min。3小时后释放曲线变为平缓上升，推测药物经过前3小时的快速释放后达到相对平衡。25g/l海藻酸钠与6g/l或4g/l羧甲基甲壳胺(B组与C组)在9小时内的释放曲线最为平缓(图l);按零级方程计算(表3)，B和C两组的释放速率分别为0.0407pg/min和0.0366^g/min。此两组辅料对地塞米松的缓释作用最强(pO.Ol)，但两者之间没有显著差异(pX).05)。单独25g/l海藻酸钠(D组)的释放曲线为缓慢上升型(图l)，其斜率介于A组与B组(或C组)之间，证明有缓释性，但其缓释作用较B、C两组弱。由零级方程得到其释放速率为O.1051pg/ml(表3)。从图l可见单独4g/傲甲基甲壳胺(E组)的释放曲线在3小时前与A组伴行，3小时后略高于A组，证明羧甲基甲壳胺能使药物的释放量大于对照组，提示E组配方有微小促渗作用。讨论海藻酸钠与壳聚糖是药剂学中常用的缓释辅料，它们均为无毒、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料，具较好的可塑性，广泛应用于药物载体领域。其中海藻酸钠荷负电，壳聚糖荷正电，两者可通过静电相互作用约束药物释放，因此构成多种药物、生物制品、疫苗及细胞的缓释载体。本实验所用的羧甲基甲壳胺即壳聚糖的衍生物。地塞米松属于类固醇激素，能与细胞内受体结合，抑制一氧化氮合成酶和细胞因子、粘附分子、血小板因子转录，从而抑制炎症过程。动物实验和临床实验已证实地塞米松能够通透圆窗膜，可以用来治疗多种内耳疾病，如自身免疫性聋、突发性感音神经性聋、噪声性聋、梅尼埃病、急性脑膜炎后迷路炎。参考赵武奇等(2004)的实验结果，本实验将上述两种辅料与地塞米松配伍，分为五组进行试验(A-E组)。考察9小时内地塞米松对离体圆窗膜通透的情况，不含辅料的对照组(A组)在给药后3小时迅速通透圆窗膜，3小时后释放接近平衡；而含有海藻酸钠(25g/1)与羧甲基甲壳胺(4g/1、6g/1，B组与C组)的制剂释药速率最慢，缓释作用最强(p<0.01);单独25g/l海藻酸钠的缓释作用次之。然而比较B、C两组之间的缓释性没有显著差异(pX).05)，证明6g/l或4g/l的羧甲基甲壳胺与25g/l海藻酸钠联用时其缓释作用相近。根据辅料少副作用小的原则，推荐在后续的研究中将羧甲基甲壳胺的浓度定为4g/1。E组(仅含4g/1羧甲基甲壳胺辅料)地塞米松的通透量稍大于对照组，证明羧甲基甲壳胺有微小促渗作用。此结果与Goycoolea(2001)—致，后者认为圆窗膜对通透的物质有电荷选择性，如阳离子铁蛋白的通透性大大超过阴离子铁蛋白；本实验中羧甲基甲壳胺带正电荷，因此有可能而促进地塞米松通过圆窗膜。Chandrasekhar等(2000)曾比较三种辅料(透明质酸、DMSO、组胺)对地塞米松圆窗膜给药的促渗作用；结合本实验的这一结果，将对激素冲击治疗突发性耳聋有研究意义。表1.HPLC法测定地塞米松磷酸钠林格氏液的精密度及回收率(±s)浓度(pg/ml)测得量^g/ml)回收率(％)《赵紫曰内1010.12±0.64101.24±6.39%7.20%n=52524.16±1.0296.02±4.07%4.80o/010098.22±0.8198.22±0.81%0.94%曰间109.44±0.9294.36±9.23%8.64%n=32524.04±1.1696.16±4.65%4.28%10096.44±2.4396.44±2.43%2.23%表2.不同时间点所求得的累积释放量(3f±s,.w=3)time\QnA(Hg)B(吗)c(吗)D(Hg)E(吗)20min12.5.2±2.595.61±0.385.49±3.174.23±0.8310.42±0.9440min21.32±3.608.66±1.057.54±2.427.42±0.9215.56±2.6060min22.12±4.8211.17±1.759.07±2.9611.00±1.3424.21±3.01120min37.88±2.4710.85±3.8011.95±3.4521.33±1.9141.49±3.28180min50.88±15.6013.58±3.5814.19±3.0129.48±2.1947.96±4.52300min51.47±16.5117.62±4,9917.33±2.2139.59±7.6960.70±3.84420min56.76±15.8422.03±8.4220.67±1.2046.69±11.8165.36±5.73540min57.58±8.8826.46±10.0423.00±2.8861.25±9.5270.15±7.12表3.零级、一级、Higuehi释放方程的拟合<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1.一种圆窗膜的离体通透试验装置，由圆窗膜、供给室、接受室及中间带孔的圆片组成，其特征是供给室代表中耳腔，接受室代表鼓阶外淋巴腔，圆片位于两室之间，圆窗膜位于圆片中央孔，各组件顺序封接，模拟生理环境下的鼓室与内耳的关系。2.根据权利要求1所述的圆窗膜的离体通透试验装置，其特征在于供给室和接受室的内径都为lcm，接口处为磨砂玻璃；供给室高lcm，接受室高1.5cm;接受室与取样管形成连通器，取样管内径2mra，高度略高于接受室，接受室的容积为1.2ml。3.根据权利要求l所述的圆窗膜的离体通透试验装置，其特征在于圆片中央的孔为漏斗形，大口朝向接受室，即内耳侧，小口朝向供给室，即鼓室侧；圆窗膜位于中央孔的鼓室侧。4.根据权利要求l所述的圆窗膜的离体通透试验装置，其特征在于每个组件的连接使用无毒且防水的牙科水泥。专利摘要一种圆窗膜的离体通透试验装置，由圆窗膜、供给室、接受室及中间带孔的圆片组成。供给室代表中耳腔，接受室代表鼓阶外淋巴腔，圆片位于两室之间，圆窗膜位于圆片中央孔，各组件顺序封接。该离体试验装置使用了对药物影响低的玻璃组件及对圆窗膜无毒的连接材料，可模拟鼓室与内耳的关系和经圆窗膜给药的生理环境，能节约实验成本并提高结果的可靠性。文档编号G01N33/48GK201373874SQ200820119940公开日2009年12月30日申请日期2008年6月6日优先权日2008年6月6日发明者娅刘,孙建军申请人:孙建军;刘娅