专利名称：利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物化工技术，特别涉及一种利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺。
背景技术：
目前透明质酸的生产常用的生产制备技术有两种一是从动物组织中提取，该法提取率极低，仅为1％左右。由于原料资源有限，制备成本较高，无法形成产业化。二是生物发酵法。原料资源不受限制，可规模化等特点，但发酵水平有待于提高。。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种利用微生物代谢调控规律，在发酵过程加入磷脂化合物来改变细胞膜的通透性促进透明质酸的生成的利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺。
其技术方案是该工艺包括以下步骤使Lancefraeld法C族K56菌组的兽疫链条菌在培养基中发酵，在发酵过程中PH值在6.5--7.5之间，并且在发酵后期的6～8小时，加入磷脂化合物溶液，同时把发酵温度控制在33--35℃，当发酵液的PH值基本不再降低，取菌样进行镜检，则可以观察到链球菌的菌体特别长，有些菌体开始自溶，即表明已至发酵终点，可以收集透明质酸。
所述的磷脂化合物溶液是磷脂化合物加水配制成一定浓度50％的稀释液。
所述的磷脂化合物溶液也可以是磷脂化合物与20--25％的烧碱溶液混溶。
较详细的工艺步骤包括以下(1)将配制好的培养基加入发酵罐内，进行蒸汽加热，然后通入活蒸汽灭菌，灭菌后通入无菌空气，同时进行夹层冷却循环水降温，降温至35--37℃，将种子罐中的种子液通过移种管道移种至发酵罐中，37℃发酵；在发酵过程中调整溶液PH值在6.5--7.5之间；(2)将磷脂化合物加水配制成一定浓度的稀释液，灭菌冷却后备用(也可以与20--25％的烧碱溶液混溶)；(3)在发酵后期12--16小时，将添加剂含量在0.03～0.10％的磷脂化合物溶液，分次流加到发酵罐中，当发酵液的PH值基本不再降低，测量发酵液中的糖含量，并取发酵罐无菌样进行镜检，观察到链球菌的菌体特别长，有些菌体开始自溶，表明已至发酵终点。
所述的培养基配方为蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、牛肉浸膏0.5％、葡萄糖0.5％、水合硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.2％。。
本发明的有益效果是利用微生物代谢调控规律，在发酵过程加入磷脂活性物质，来增强细胞夹膜活性，促进透明质酸的生物合成，同时改善细胞膜的通透性，使菌体内代谢产物透明质酸的尽快释放、分泌，使胞内微环境次级代谢物量下降，刺激菌体不断再合成、再释放，达到提高细胞外透明质酸浓度和分子量的目的。
另外，该工艺发酵水平和产率高，生产成本低、分子量高、糖醛酸含量高、质量好，与国内外工艺相比具有竞争力。
四
附图1是本发明的工艺流程图第一部分。
图中种子罐A，发酵罐B，磷脂化合物灭菌罐C，液碱贮罐D。
五具体实施例方式结合工艺流程图，对本发明作进一步的描述实施例11.摇瓶种子的培养取斜面菌种(Lancefraeld法C族K56菌组的兽疫链条菌)，种子装入有灭菌培养基液的锥形瓶中，37℃培养12--14小时。镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，可接入种子罐A中，种子罐A培养基严格按物料配比。
2.种子罐菌种的培养按物料配比配制培养基(培养基配方(％)蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、牛肉浸膏0.5％、葡萄糖0.5％、水合硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.2％、PH值6.5～7.0)，加入种子罐内，先打开夹层蒸汽进行加热，温度达到80℃以上的，打开罐内各蒸汽通入口进行活蒸汽灭菌，121℃灭菌25min，灭菌完毕后通入压缩空气，夹层打开冷却循环水进行降温，冷却至37℃，用火焰保护法，将摇瓶种子接入种子罐，37℃培养12--16小时，镜检观察菌体生长良好，无污染，即可移种于发酵罐中。
3.发酵将配好的培养基加入发酵罐B内，打开夹层蒸汽进行加热，温度达到80℃以上的，打开罐内各蒸汽通入活蒸汽灭菌，121℃灭菌25min.灭菌完毕后通入压缩空气，夹层打开冷却循环水进行降温，降温至37℃后，将种子罐A中的种子液通过移种管道移种至发酵罐B中，37℃发酵在发酵过程中，发酵液PH不断下降.用20％的氢氧化钠溶液调PH7.0左右。
4.在磷脂化合物灭菌罐C中，将磷脂化合物加水配制成一定浓度50％的稀释液，灭菌后冷却后备用(也可以与液碱贮罐D中的20--25％的烧碱溶液混溶)。
5.在发酵后期16小时时，将磷脂化合物含量在0.6kg的磷脂化合物溶液，用流加罐流加到发酵罐中，同时把发酵温度控制在33--35℃，当发酵液的PH值基本不再降低，此时测量发酵液中的糖含量，一般会低于0.2％(用脲糖试纸进行半定量测定)；取发酵罐无菌样进行镜检，则可以观察到链球菌的菌体特别长，有些菌体开始自溶。这即表明已至发酵终点，可以放罐并收集透明质酸。
在上述发酵过程中，能否将代谢终产物全部分泌或转出胞外，是发酵生产成功的关键。该使用量范围较宽，在0.03～0.5％范围都有明显的效果。对微生物细胞膜无伤害(无毒性)，不改变微生物的代谢途径，提高发酵终产物水平。
实施例21.发酵条件培养基配方(％)蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、牛肉浸膏0.5％、葡萄糖0.5％、水合硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.2％、PH值6.5～7.0。采用体积为1200升发酵罐，料液配比按800升计，发酵前期温度为37℃，后期控制在35℃或33℃，这可以适度提高透明质酸的分子量，但同时会使周期延长，生产过程中应根据实际情况进行调节，以期达到产量、质量和费用的统一。通气量一般为0.3vvm～1.0vvm。
2.磷脂化合物溶液的配制与使用使用时先将磷脂化合物加去离子水配制成浓度为50％的稀释液，灭菌后冷却后备用；或者与25％的烧碱溶液混溶放在流加罐中。
3.在发酵后期放罐前的6～8小时即发酵时间16小时时，将0.6公斤的添加剂溶液流加入发酵罐中。同时把发酵温度控制在33--35℃，当发酵液的PH值基本不再降低，此时测量发酵液中的糖含量，一般会低于0.2％(用脲糖试纸进行半定量测定)；取发酵罐无菌样进行镜检，则可以观察到链球菌的菌体特别长，有些菌体开始自溶。这即表明已至发酵终点，可以放罐。酒精絮沉后，粗菌体离心甩干，称重26公斤。
需要说明的是1.该添加剂易溶于水和乙醇，无任何毒性和有害成分，2.在发酵后期添加磷脂化合物溶液时，采用流加的方式加入，并且要掌握好添加的时间、数量，才能更好地克服细胞壁、细胞膜存在而形成的渗透壁障对产物产量的影响。
3.在磷脂化合物溶液的使用过程中，可向对照罐中加入相同体积的无菌水，同时对照做试验，进行效绩评价，其它条件相同。
4.该磷脂化合物是甘油与磷脂化合而成的一种磷脂化合物，适用于放线菌和真菌。
权利要求
1.一种利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺，其特征是该工艺包括以下步骤使Lancefraeld法C族K56菌组的兽疫链条菌在培养基中发酵，在发酵过程中PH值在6.5--7.5之间，并且在发酵后期的6～8小时，加入磷脂化合物溶液，同时把发酵温度控制在33--35℃，当发酵液的PH值基本不再降低，取菌样进行镜检，则可以观察到链球菌的菌体特别长，有些菌体开始自溶，即表明已至发酵终点，可以收集透明质酸。
2.根据权利要求1所述的利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺，其特征是所述的磷脂化合物溶液是磷脂化合物加水配制成一定浓度50％的稀释液。
3.根据权利要求1所述的利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺，其特征是所述的磷脂化合物溶液也可以是磷脂化合物与20--25％的烧碱溶液混溶。
4.根据权利要求1、2或3所述的利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺，其特征是较详细的工艺步骤包括以下(1)将配制好的培养基加入发酵罐内，进行蒸汽加热，然后通入活蒸汽灭菌，灭菌后通入无菌空气，同时进行夹层冷却循环水降温，降温至35--37℃，将种子罐中的种子液通过移种管道移种至发酵罐中，37℃发酵；在发酵过程中调整溶液PH值在6.5--7.5之间；(2)将磷脂化合物加水配制成一定浓度的稀释液，灭菌冷却后备用；(3)在发酵后期12--16小时，将添加剂含量在0.03～0.10％的磷脂化合物溶液，分次流加到发酵罐中，当发酵液的PH值基本不再降低，测量发酵液中的糖含量，并取发酵罐无菌样进行镜检，观察到链球菌的菌体特别长，有些菌体开始自溶，表明已至发酵终点。
5.根据权利要求4所述的利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺，其特征是所述的培养基配方为蛋白胨1.0％、酵母粉0.5％、牛肉浸膏0.5％、葡萄糖0.5％、水合硫酸镁0.05％、磷酸氢二钾0.2％。
6.根据权利要求4所述的利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺，其特征是工艺步骤(2)所述的磷脂化合物也可以与20--25％的烧碱溶液混溶。
全文摘要
本发明涉及一种利用微生物代谢调控改变细胞膜通透性生产透明质酸新工艺。其技术方案是该工艺包括以下步骤兽疫链条菌在培养基中发酵，在发酵过程中pH值在6.5－7.5之间，并且在发酵后期的6～8小时，加入磷脂化合物溶液，同时把发酵温度控制在33－35℃，当发酵液的pH值基本不再降低，取菌样进行镜检，则可以观察到链球菌的菌体特别长，有些菌体开始自溶，即表明已至发酵终点，可以收集透明质酸。有益效果是利用微生物代谢调控规律，在发酵过程加入磷脂活性物质，来增强细胞夹膜活性，促进透明质酸的生物合成，本工艺发酵水平和产率高，生产成本低、分子量高、糖醛酸含量高、质量好，与国内外工艺相比具有竞争力。
文档编号C12P19/04GK1793183SQ20051010462
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者张照明, 袁利明, 王广博 申请人:东营市源聚生物制品有限公司