提高效率的芯片测试的制作方法

专利名称：提高效率的芯片测试的制作方法
提高效率的芯片测试
相关申i青
本申请要求号为60/958, 277、提交于2007年7月2日、名称为"提 高效率的芯片测试"的美国临时专利申请的优先权，并且本文中包含了 其全部内容。
背景技术：
1. 发明领域
本发明涉及测试，更具体来说涉及用于测试中的传感器。
2.
背景技术：
利用包含设置在基板上的 一 个或多个传感器的测试芯片可以实施多 种测试。每个传感器可以包括设置在所述基板上的工作电极、参比电极
所述参比电极具有固有电势，其他电极相对于该固有电势的电势可以测
j曰付。
在一些情况下，所述参比电极由单层金属制成以减少与制造该参比 电极有关的问题。然而，这些传感器通常会产生不一致的结果，因为所 述参比电极的电势会漂移。结果，需要能够提供一致结果的可制造的传 感器。
发明概述
所述芯片包括基板上的电极。所述电极包括工作电极、参比电极和 反电极。所述参比电极构造成不具有固有电势。自组装单层设置在所述 参比电极上。所述自组装单层包括间隔基和活性探针。所述活性探针构 造成对捕获探针具有比间隔基对该捕获探针更高的亲和性。
附图简要说明


图1A是具有检测靶试剂的存在和/或量的传感器的测试芯片顶视图。 图1B是图1A所示的测试芯片沿标记线B的剖面图。 图1C表示了具有多个传感器的测试芯片。
图2表示了设置在图1A传感器上的具有测试容器的传感器系统。图3A表示了一种适用于图1A中所示的测试芯片的通用测试实施例。 该测试采用了粘附层以将测试探针结合到所述工作电极上。所述粘附层 对捕获探针具有比工作电极对捕获探针更高的亲和性。 图3B表示了适于用作粘附层的不均匀自组装单层。 图3C表示了与图3A的测试探针结合使用的图3B的不均匀自组装单层。
图4表示了具有自组装单层的传感器，其包括具有链亲和素的活性 才笨针，所述链亲和素连接在DAD-C12-SH ( 12-巯基(8-生物素酰胺-3, 6-二氧辛基)十二酰胺)上，以及作为间隔基的11-巯基-l-十一醇。 图5A表示了图3A的测试适用于检测遗传物质的特定链的存在。 图5B表示了适用于图5A所示测试的反应机理的特殊实施例。 图6表示了图3A的测试适用于检测靶试剂的存在，包括但不限于蛋 白质和细月包。
图7表示了传感器芯片上十六个传感器的试验电流与时间结果。 图8表示了试验电流与浓度结果。 优选实施方式详细i兌明
芯片传感器具有在基板上的一个或多个传感器。所述每个传感器包 括在基板上的工作电极、参比电极、以及反电极。所述参比电极构造成 没有固有电势。例如，所述参比电极可包括金属单层。自组装单层位于 至少所述参比电极和/或至少所述工作电极上。
所述自组装单层是不均匀的自组装单层，其包括活性探针之间的间
果i,所述捕获探针优先结合于所i活性探针而非间隔基上。'、、所述捕获 探针结合于测试所针对的靶试剂。因此，所述活性探针参与将所述靶试 剂连接于所述电极上，而所述间隔基不连接所述靶试剂与电极。发明者 们发现，所述活性探针之间的间隔基的存在提高了所述参比电极的阻抗， 并因此防止或减少了所述传感器工作过程中的参比电极电势漂移。
所述间隔基还可以降低测试结果中的信噪比。例如， 一些测试情况 下，是通过测量流过工作电才及的电流来测定革巴试剂的存在，所述电流来 自介质与所述工作电极之间的反应。结果，工作电极上的非来自所述介 质的电流来源成为了测试结果中的噪声来源。发明者们发现，工作电极 上包括间隔基的自组装单层可以起到工作电极上介电层的作用。由此，所述自组装单层可以防止源自非所述介质的电流来源通过所述工作电
继续进行氧化还原反应。所述介质和工作电极之间继续氧化还原反应的 一个可能解释是，所述介质会在所述自组装单层中捕获并允许信号通过 所述自组装单层。
由于包括间隔基和活性探针的自组装单层能够防止或减少参比电极 电势的漂移和/或降低测试结果中的信噪比，故所述自组装单层提高了所 述传感器提供的结果的 一致性和/或效率。
图1A和图1B表示了具有传感器12的测试芯片IO—部分的实施例。 图1A是芯片IO的顶一见图，图1B是图1A中所示芯片IO沿标记线B的剖 面图。所述芯片10包括多个设置在基板16上的电极14。合适的基板16 包括但不限于，硅基板16。尽管示出的基板16是由单个材料构成的，但 所述基板16也可以具有复合结构。
电极14包括设置在工作电极22附近的参比电极18和反电极20。在 一些情况下，反电极2 0和参比电极18设置在所述工作电极22的相对两 边。所述反电极20和参比电极18可具有相同的形状，或者具有不同的 形状。所述反电极20和/或参比电极18可以设置成使得所述工作电极22 的一部分位于所述反电极20的不同区域之间，和/或位于所述参比电相^ 18的不同区域之间。尽管所述所示出的工作电极22为圓形，但该工作电 极22也可以具有各种其它的形状，包括但不限于矩形。
所述参比电极18可包括单层导电性材料如金属。例如，所述参比电 极可以由单层金属如金、银、铜、賴、铬、铅、钛和镍构成。所述工作 电极22、反电极20和参比电极18可以由相同的材料或不同的材料制成。 其它合适的电极14包括但不限于，金、银、铜、柏、铬、铝、钛和镍。
所述工作电极22可以构造成使得该工作电极22的最大尺寸小于 4腿、l誦、100Mm或50Mm。反电极20和参比电极18的合适宽度包括 4旦不限于小于20 iam、 100(im、 0. 5mm或3mm的宽度。所述工作电才及22 与参比电极18之间和/或所述工作电极22与反电极之间间隙的合适尺寸 包括但不限于，lMm、 1Q0ym、 0. 5mm或2mm。这些尺寸可4吏得传感器12 具有适用于现场测试设备中的紧凑尺寸。
所述工作电极22包括粘附层28。如下面更详细描述的那样，测试探 针的一部分可具有对粘附层28比对工作电极22更大的亲和性。这样，
7所述粘附层28可提高测试探针40的一部分对工作电极的亲和性。
尽管图1A和图1B所表示的芯片IO具有单个传感器，但芯片10也可包括多个传感器12,如图1C中所示那样。所述传感器12可以设置成芯片IO上的阵列。每个传感器12包括工作电极22、参比电极18和反电极20。芯片IO上不同的传感器12可以同时或者顺序地使用。每个传感器12可以用来测试不同靶试剂的存在。这样，芯片10可以提供针对多个不同靶试剂的高效测试。或者，多个传感器12可以用来测试相同輩巴试剂的存在。所述多个测试可以用作冗余检查，或者每个传感器12上进行的测试可以针对不同来源的耙试剂。
传感器系统29是在芯片10工作过程中形成的，如图2中所示。尽管粘附层28存在于所述电极的至少之一上，但粘附层28没有在图2中示出。所述传感器系统29包括设置在传感器12上的测试体积30。所述测试体积30设置在所述工作电极22、参比电极18和反电极20的共同上方。在一些情况下，表面张力保持了所述测试体积的形状，并使得该测试体积30保持在所述电极14的上方。
图3A提供了根据图2的传感器29的通用实施例。图3A是图2中所示的传感器系统29的剖面部分。
传感器29包括结合在工作电极上粘附层28上的测试探针40。 一个测试探针4Q出于说明目的被示出，然而，所述测试探针40在工作电极22上的密度通常高得多。所述测试探针40包括靶试剂42的一部分，位于捕获探针44和信号探针46之间。所述测试指示了耙试剂42的存在。合适的靶试剂42包括但不限于多糖、核酸、细胞和遗传物质如DNA或RNA的《连以及抗体。
粘附层28可提高捕获探针44对工作电极22的亲和性，以高于没有粘附层28时所述捕获探针44对工作电极22的亲和性。所述捕获探针44用于将工作电极22连接到耙试剂42上。如下面明显看出那样，适当的捕获探针44包括〗旦不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)以及蛋白质如抗体。
报告分子50结合在所述信号探针46上。所述信号探针46构造成连接着靶试剂42和才艮告分子50。至少一种介质52处于测试体积中。所述介质52和净艮告分子50可以分别以一种以上的状态存于测试体积30中。不同状态的实施例包括不同的氧化态。
8在所述芯片IO工作的过程中，该芯片IO与电子设备(未示出)的
电交流构造成向传感器12的工作电极22和参比电才及18之间施加电势，同时监控通过电路的电流，所述电路包括该电路的工作电极22、测试体积30和反电4及20。
介质52和报告分子50相互作用，使得所述介质52从第一介质态52A转化到第二介质态52B，而所述报告分子50从第一报告分子态转化到第二报告分子态。虚线标记A表示了所述第一介质态52A扩散到报告分子50处，在此转化成第二介质态52B。虛线标记B表示了所述第二介质态52B扩散通过所述测试体积30到达工作电极22。施加在所述工作电极22与参比电极18之间的电势升高到使得电子传递在工作电极22和所述第二介质态52B之间发生的水平。所述电子传递使得电流流过包括所述工作电极22、测试体积30和反电极20的电路。结果，流过所述工作电极22和反电极20之间的电流指示了所述介质52从第一介质态52A转化到第二介质态52B。
如下面明显看出那样，当靶试剂42不存在时。所述报告分子50并没有存在于测试体积30中。当报告分子不存在时，介质52不会从第一介质态52A转化到第二介质态52B。这样，当靶试剂42不存在于测试体积30中时，并不存在通过工作电极的电流。由于所述电流是当耙试剂42存在时存在，而当靶试剂42不存在时不存在，故所述电流指示了所述测试体积30中靶试剂42的存在。
图3B是包括电极14上的粘附层28的传感器剖面。所示的粘附层28和电极14可代表所述工作电极、参比电极和/或反电极上的设置。所述粘附层28包括或具有自组装单层，该自组装单层对捕获探针44具有的亲和性高于当电极14上不存在自组装单层时电极14对捕获探针44的亲和性。
自组装单层是一个分子厚度的二维薄膜，其中每个分子共价结合到表面上。自组装单层的经典实施例是烷基硫醇与金表面的反应。功能化
的分子一般会被沖洗掉，自组装单层可提供固定在所述表面上的一个分子厚度的薄膜。
所示的自组装单层是不均匀自组装单层，其包括在自组装单层中的不同化合物。例如，所示的自组装单层包括活性探针54和间隔基56。所述活性探针54包括电极连接基团58。所述电极连接基团58构造成连接着所述活性探针54与电极14。所述活性探针54还包括探针连接基团60。所述探针连接基团60构造成连接着所述活性探针54与捕获探针44。例如，所述探针连接基团可包括一个或多个结合位点，其中每个都构造成连接着捕获探针。在一些情况下，所述探针连接基团60设置在所述活性探针54的末端。
每个间隔基56包括电极连接基团62，其构造成连接着所述间隔基56与所述电极14。间隔基56还包括末端64。所述末端64对捕获探针44的亲和性小于所述探针连接基60对捕获探针44的亲和性。在一些情况下，末端64构造成使得所述间隔基56对捕获探针44基本不具有亲和性。因此，所述捕获探针44结合到所述活性探针54上而不是间隔基56上。
图3C表示了与图3B的测试探针和报告分子结合使用的图3A的传感器。所述活性探针54连接着测试探针，而间隔基56不连接测试探针。
每种用于活性探针54的化合物可以是相同的，或者所述活性探针54可包括多种不同的化合物，每种都用作活性探针54。每种用作间隔基56的化合物可以是相同的，或者所述间隔基54可包括多种不同的化合物，每种都用作间隔基54。自组装单层中间隔基56与活性探针54的比例会影响测试的性能。间隔基56与活性探针54的比例优选在100: 1到1:100、或10: l到l: 10、或5: l到l: 5的范围内。
合适的用于活性探针54的电极连接基团58包括但不限于硫醇基。从而，活性探针5 4可以为硫醇化的活性探针5 4 。当硫醇化的活性探针连接到电极14上时，所述硫醇化的活性探针包括了直接连接到电极14上的硫。当所述电极表面包括或具有金时，硫醇电极连接基团58适于用作电极连接基团58。
合适的用于间隔基56的电极连接基团62包括但不限于硫醇基。从而，活性探针54可以为硫醇化的间隔基56。当硫醇化的间隔基连接到电极14上时，所述硫醇化的间隔基包括了直接连接到电极14上的硫。当所述电极表面包括或具有金时，硫醇电极连接基团62适于用作电极连接基团62。所述间隔基56中采用的电极连接基团62可以与所述活性探针54中采用的电极连接基团62相同或不同。
所述探针连接基团60可根据所述捕获探针44的结构而定。探针连接基团60的实施例包括但不限于基团，如羟基(-OH )、胺基(-NH2、 NHR，其中R表示有机基团例如烷基)，以及包括这些基团的化合物。间隔基56的所述末端64的实施例包括但不限于烷基和其它基团，如羟基(-0H)、胺基(-仰2、 NHR,其中R表示有机基团例如烷基)。所述间隔基56的末端64可以不同于所述探针连接基团60。例如，当所述探针连接基团60是胺基时，所述间隔基56的末端64可以是羟基。
在一些情况下，所述活性探针54可以构造成使得所述探针连接基团60位于所述间隔基56的末端64的上面。例如，所述活性:探针54可以长于所述间隔基56。这样，所述探针连接基60就可容易地结合到位于传感器上的溶液中所包含的捕获探针44上。
合适的活性探针54可包括一种或多个亚烷基部分。每个亚烷基部分可具有一个或更多碳、两个或更多碳、三个或更多碳、或者四个或更多碳的主链。例如，所述活性探针54可包括一或多个由-(CH2)。-表示的部分，其中n为1个或更多、2个或更多、3个或更多、或者4个或更多。所述活性探针54中的一或多个亚烷基部分可以被取代和/或分支化。例如，合适的活性探针5 4可包括一或多个完全或部分由代化的亚烷基部分。当活性探针54包括了多个亚烷基部分时，不同的亚烷基部分可以通过醚键(-0-)、硫醚键(-S-)、胺键(-NR-,其中R表示卣素或有机基团例如烷基)、酮键(-CO-)、酯键(-C0-0-)、硫酯键(-S-C0-)或酰胺键(-CQ-NH )连接在一起。
合适的间隔基56包括一个或多个亚烷基部分。每个亚烷基部分可具有1个或更多碳、2个或更多碳、3或更多碳、或者4个或更多碳的主链。例如，所述间隔基56可包括一或多个由-(CH2) n-表示的部分，其中n为1个或更多、2个或更多、3个或更多、或者4个或更多。所述间隔基56中的一或多个亚烷基部分可以^皮耳又代和/或分支化。例如，合适的间隔基56可包括一或多个完全或部分卣代化的亚烷基部分。当间隔基56包括了多个亚烷基部分时，不同的亚烷基部分可以通过醚键(-0-)、硫醚键(-S-)、胺键(-NR-,其中R表示卣素或有机基团例如烷基)、酮键(-C0-)或酯键(-C00-)连接在一起。
合适的活性探针54的实施例包括但不限于，取代的生物素、结合到链亲和素上的取代生物素、葡聚糖、和MUDA (巯基十一烷酸)。例如，当所述测试用来识别遗传物质如DNA或RNA的存在、并且所述活性探针54要连接的电极14为金时，合适的活性探针54包括结合到链亲和素上 的生物素化硫醇。合适的生物素化硫醇实施例包括但不限于，DAD-C12-SH (12-巯基(8-生物素酰胺-3, 6-二氧辛基)十二酰胺)。合适的间隔基56 实施例包括但不限于，硫醇和羟基化硫醇，例如6-巯基-l-己醇。图4表 示了具有的自组装单层的传感器，其包括具有链亲和素的活性探针54， 所述链亲和素结合到DAD-C12-SH( 12-巯基(8-生物素酰胺-3， 6-二氧辛基) 十二酰胺)上，以及作为间隔基56的11-巯基-1-十一醇。所述链亲和素 包括数个表示为连接环(45到52个残基)的探针连接基团，所述连接环 用作生物素化捕获探针的结合位点。
图5A表示了图3A中所示的测试体积30,适用于检测遗传物质72如 DNA或RNA的链。所述捕获探针44、耙试剂42、信号探针46分别为遗传 物质72的链。捕获探针44的一部分互补于靶试剂42的一部分，以提供 所述捕获纟笨针44与靶试剂42的互补部分之间的》威基配对。所述靶试剂 42的一部分互补于信号探针46的一部分，以提供所述靶试剂42和信号 探针46的互补部分之间的碱基配对。
用于图5的测试化合物的合适报告分子50包括但不限于，辣根过氧 化物酶(服P) 、 AP U咸性磷酸酶)和葡萄糖过氧化物酶。用于HRP的合 适介质52包括但不限于3， 3， ，5， 5，-四曱基联笨胺(TMB)。用于AP的 合适介质包括但不限于尼克酸衍生物(NAD)。用于葡萄糖过氧化物酶的 合适介质包括但不限于六亚甲基四胺钌(II)。
在一些情况下，所述信号探针46进行了修饰以提高与报告分子50 的结合性。例如，当报告分子50包括辣根过氧化物酶(HRP)时，所述 信号探针46的一个或多个碱基可以修饰成促进所述信号探针46与HRP 的结合性。例如，所述信号纟笨针46的5，末端可以用用作连接到HRP上 的连接基团70的荧光素来修饰。
在一些情况下，所述捕获探针44用可提高捕获探针44与粘附层28 之间结合性的连接基团76进行了修饰。例如，当所述自组装单层包括链 亲和素时，所述捕获探针44可以用很容易与链亲和素结合位点相结合的 生物素进行修饰。在一些情况下，所述捕获探针44的5'末端用生物素 进行了修饰。
图5B表示了根据图5A的测试的机理，其中用辣根过氧化物酶(HRP) 作为报告分子50、 TMB作为包含过氧化氢的水溶液中的介质52。所述机理表示了以第 一报告分子态50A、第二报告分子态50B和第三报告分子态 50C存在的HRP。所述第一报告分子态50A是HRP的氧化态，而第二报告 分子态50B是HRP的另一种氧化态。所述机理还表示了以第一介质态52A 和第二介质态52B存在的TMB。
箭头标记A表示了第一报告分子态50A与过氧化氢反应生成了第二 报告分子态50B。箭头标记B表示了第一介质态52A被所述第二报告分子 态50B氧化形成了第二介质态52B。箭头标记C表示了第三报告分子态 50C被还原成第一报告分子态50A,其中* AH是TMB的氧化态。
箭头标记D表示了第二介质态5 2 B扩散到工作电极2 2上。箭头标记 E表示在工作电极22出发生了电子传递，从而将所述第二介质态52B还 原回第一介质态52A。箭头标记F表示所述第一介质态5卩A扩散回测试体 积30中，以与第二报告分子态50B发生反应。
如图6中所示，图3A中所示的测试还可以适用于4全测细胞74或蛋 白质的存在。例如，所述捕获探针44可以为夹心测试中的第一抗体。此 外，信号探针46可以为夹心测试中的第二抗体。用于夹心测试的合适靶 试剂包括但不限于，具有特异于所述抗体的结合位点的蛋白质、多糖和 核酸，或者具有特异于所述抗体的结合位点的蛋白质的细胞。
适用于图6的测试组分的合适报告分子50包括但不限于，辣根过氧 化物酶(服P) 、 AP U咸性磷酸酶)和葡萄糖过氧化物酶。用于HRP的合 适介质52包括但不限于3， 3， ，5,5，-四曱基联苯胺(TMB)。用于AP的 合适介质包括但不限于尼克酸衍生物(NAD)。用于葡萄糖过氧化物酶的
合适介质包括但不限于六亚甲基四胺钌(n)。
第一抗体可以被修饰成包括能提高与所述粘附层28的结合性的连接 基团。例如，当所述粘附层28包括暴露的链亲和素时，所述第一抗体可 以用很容易与所述链亲和素结合位点相结合的生物素来修饰。
所述第二抗体可以被修饰以提高与所述报告分子50的结合性。例如， 当所述报告分子包括HRP时，所述第二抗体可以进行修饰以促进所述信 号探针46与HRP的结合性。例如，所述第二抗体可以用用作连接到服P 上的连接基团70的荧光素来修饰。
在一些情况下，所述捕获探针44用可提高捕获探针44与粘附层28 之间结合性的连接基团76进行了修饰。例如，当所述自组装单层包括链 亲和素时，所述捕获探针44可以用很容易与链亲和素结合位点相结合的生物素进行修饰。
所述自组装单层可以通过足够晃动的化学孵育过程来合成。 尽管所述方法在所述工作电极、参比电极和反电极上形成了自组装 单层，但在形成所述自组装单层的过程中通过掩模遮挡某些电极，所述 方法还可以用于在所述电极的一部分上形成自组装单层。这样，所述传 感器可以具有至少位于参比电极上或者至少位于工作电极上的自组装单 层。所述掩模可以在所述传感器工作之前去处。或者，在所述掩模去除 之后，可以在之前掩模的电极(组)之上形成另一层自组装单层。这样， 可以将不同的自组装单层设置在不同的电极上。
通过在所述工作电极22上》文置一系列的溶液，可以在具有自组装单
层的传感器12上生成所述测试体积30。样品溶液由可能含有或不含靶试 剂42的样品制备而成。当靶试剂42处于所述样品中的细胞内部或者位 于细胞膜内时，可在适当的裂解条件下向所述样品中添加裂解剂。在允 许在样品溶液中形成测试探针40的条件下，向样品中添加捕获探针44 和信号探针46。在允许所述测试探针40结合到粘附层28上的条件下， 向工作电极22施加所述样品溶液。所述样品溶液可以施加以覆盖所述参 比电极18和反电极20。或者，可以利用表面张力来将所述样品溶液限制 在工作电才及22上。然后至少沖洗所述工作电极22上的所述样品溶液。 当靶试剂42存在于所述样品溶液中时，所述测试探针40保持与所述自 组装单层中的活性探针54相结合。
具有报告分子50的报告分子溶液放在至少所述工作电极22上。在 允许所述报告分子50与信号探针46相结合的条件下，将所述报告分子 溶液放在所述工作电极22上。所述报告分子溶液可以施加以覆盖所述参 比电极18和反电极20。或者，可以利用表面张力来将所述才艮告分子溶液 限制在工作电极22上。然后用洗涤液冲洗所述传感器12。所述报告分子 50与至少存在于工作电极22上的测试探针40保持结合，而剩余的报告 分子50被沖洗掉。这样，当样品中不存在耙试剂42时，报告分子50不 会存在。
具有介质52的介质溶液放在传感器12上，使得工作电极22、参比 电极18和反电极20分别被介质溶液所覆盖。存在于所述工作电极22上 的成〗分和施加到所述工作电才及22上的介质溶液部分起着测试体积30的 作用。号为60/339, 766、提交于2001年11月2日、名称为"集成样品制 备系统，，的美国临时专利申请在本文中全文结合进来；号为60/528，566、 提交于2003年12月9日、名称为"用于电化学传感器的盒"的美国临 时专利申请在本文中全文结合进来；号为60/873， 068、提交于2006年 12月6日、名称为"用于输送样品到传感器的系统"的美国临时专利申 请在本文中全文结合进来，其分别公开了 一种用于输送溶液到传感器上 的合适结构。
实施例1
在金表面上形成12-巯基(8-生物素酰胺-3, 6-二氧辛基)十二酰胺 (生物素-DAD-C12-SH， Roche GmBH， Germany)自组装单层。将棵露的 金表面清洁干净，并在50 mM的生物素-DAD-Cl2-SH乙醇与4. 5E-辆ll-巯基-l-十一醇(Aldrich Chemical Co. ， 44, 752-8 )溶液中温育18小 时。结果用乙醇和水冲洗。 实施例2
在自组装单层上形成活性探针和捕获探针。每个工作电极用2. 5 ja L 100mM的N-羟琥珀酰亚胺和400mM的N-3-二曱基氨基丙基-N_乙基》灰二亚 胺温育10分钟。在生物素(5 mg/ml,在50 mM醋酸钠中，Pierce, Rockford， IL)中温育所述传感器10分钟。将所述生物素化的传感器在4 juL 0. 5U/ml 链亲和素的无RNA酶H20 (目录号821739; MP Biomedicals, Aurora, 0H)中温育10分钟。将所述涂布有链亲和素的传感器用生物素化的捕获 探针(4 |uL; 1M磷酸盐緩沖液中为1 |uM， pH7. 4 )温育30分钟。
实施例3
将活性探针和捕获探针形成于根据实施例1构建的自组装单层上。 在所述传感器上形成测试体积并针对靶试剂进行测试。将N-羟琥珀酰亚 胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的混合物放在试管中并旋 转。用所述混合物覆盖每个工作电极。在室温下加盖的潮湿皮氏培养皿 中，使所述混合物在传感器器上温育10-15分钟。在温育时间结束后， 用去离子水冲洗所述传感器芯片，氮气干燥，然后将该传感器芯片放回 皮氏培养皿中。
用磷酸盐緩沖液(PBS )中的单克隆抗体制备捕获探针，其浓度在0. 01 到lmg/mL范围内，根据纯度和所述抗体对靶试剂的亲和性而定，较高的 亲和性允许浓度较低。每个工作电极用所述捕获探针溶液覆盖。盖上所述皮氏培养皿并在室温下温育10-90分钟，根据所述抗体的浓度而定。
在温育结束时，用去离子水沖洗所述传感器芯片，氮气干燥，然后放回
皮氏培养皿中。
将每个传感器所具有的工作电极或者全部三个电极用1M的乙醇胺 覆盖，并盖上所述皮氏培养皿。在室温下温育所述传感器芯片15分钟。 在乙醇胺温育结束时，用去离子水沖洗所述传感器芯片，氮气干燥，放 回皮氏培养皿中，并在室温氮气氛围的干燥条件下存放。
在每个工作电极上方，将可能含有耙试剂的耙溶液放到每个工作电
极上。将略微潮湿的滤纸放在皮氏培养皿中的传感器芯片下方以防止所 述样品变干，并盖上所述皮氏培养皿。温育所述靶溶液5-30分钟，根据 所述耙试剂的浓度而定。例如，对于pg/mL的靶溶液，可以温育30分钟， 对于ng/mL的则为5分钟等等。在靶溶液温育之后，用去离子水沖洗所 述传感器芯片，氮气干燥，然后放回皮氏培养皿中。
用含有缀合生物素单克隆信号抗体的信号溶液覆盖每个工作电极。 将所述信号溶液温育5-30分钟，根据所述靶浓度而定，用去离子水冲洗， 并氮气干燥。用具有链亲和素-HRP缀合物的报告分子溶液覆盖每个工作 电极。将所述报告分子溶液在室温下温育30分钟，用去离子水沖洗，并 氮气干燥。
从冰箱中取出3,3' ,5,5'-四曱基联苯胺(TMB底物)并放进覆盖 有铝箔的干净槽中。用DI水冲洗芯片并用氮气干燥。用所述TMB底物覆 盖每个传感器上的全部三个电极。
在-150mV下实施安培计测量，结果提供于图7和图8中。图7表示 了芯片上全部16个传感器的电流与时间结果。图8表示了电流与靶试剂 浓度的结果。所述电流是靶试剂浓度的函数，因此可以用作浓度的指标。
如上面所示，芯片可包括多个传感器。在一些情况下，所述传感器 可以同时采用来测试不同靶试剂的存在。在许多情况下，测试不同的靶 试剂可以采用不同的捕获探针44和/或不同的信号探针，而采用相同的 才艮告分子溶液和相同的介质溶液。这样，不同的样品溶液可以针对每种 被测耙试剂来制备。在一些情况下，可以针对不同的靶试剂采用不同的 报告分子溶液和/或介质溶液。
在一些情况下，芯片上不同的传感器可以同时使用，以测试相同不 同靶试剂的存在。当靶试剂来自相同的样品时，不同的报告分子溶液和/或介质溶液可以用于不同的传感器。在这些情况下， 一个传感器上的结 果可用作对另一传感器上结果的检查。当被测靶试剂相同、但来源与不 同的样品时，所制备来用于每个传感器的所述样品溶液是不同的。
在看了这些教导之后，本发明的其它实施方式、组合和改变对于本 领域普通技术人员来说很容易实现。因此，本发明必须仅受以下权利要 求的限制，其包括当看了上述说明并结合附图后的所有这种实施方式和 改变方式。
权利要求
1.一种电化学传感器装置，包括在基板上的电极，所述电极包括工作电极、参比电极、和反电极，所述参比电极构造成没有固有电势；以及所述参比电极上的自组装单层，所述自组装单层包括不均匀的化合物选择。
2. 权利要求l所述的装置，其中所述化合物选择包括间隔基和活性 探针，所述活性探针构造成对捕获探针具有比间隔基对该捕获探针更高的 亲和性。
3. 权利要求l所述的装置，其中所述活性探针比所述间隔基在所述 基板上延伸得更长。
4. 权利要求l所述的装置，其中所述活性探针长于所述间隔基。
5. 权利要求l所述的装置，其中所述活性探针包括生物素化的硫醇， 而间隔基包括羟基化硫醇。
6. 权利要求l所述的装置，其中所述生物素化硫醇与链亲和素相结合。
7. 权利要求l所述的装置，其中所述活性探针包括12-巯基(8-生物 素酰胺-3， 6-二氧辛基)十二酰胺)，所述间隔基包括ll-巯基-l-十一醇。
8. 权利要求l所述的装置，其中所述活性探针包括直接连接到参比 电才及上的辟"
9. 权利要求8所述的装置，其中所述活性探针包括直接连接到参比 电极上的硫。
10. 权利要求9所述的装置，其中所述活性探针包括与所述直接连接 到所述参比电极上的硫相对的末端，所述活性探针的末端包括选自由氨 基和羟基所组成的组的成分。
11. 权利要求9所述的装置，其中所述间隔基包括与所述直接连接到 所述参比电极上的硫相对的末端，所述间隔基的末端包括选自由烷基、氨基和羟基所组成的组的成分。
12. 权利要求l所述的装置，其中所述参比电极由单层金属所构成。
13. 权利要求l所述的装置，其中所述参比电极由单层金层所构成。
14. 权利要求l所述的装置，其中所述参比电极、工作电极和反电极 分别由单层金属所构成。
15. 权利要求l所述的装置，其中所述参比电极、工作电极和反电极 分别由单层金层所构成。
16. 权利要求l所述的装置，其中所述参比电极和反电极分别具有不 同于所述工作电极形状的形状。
17. 权利要求l所述的装置，其中所述传感器占据160 lam2到25 mm2 的面积、。
18. 权利要求l所述的装置，其中所述参比电极、工作电极和反电极 分别由单层导电性材料所构成。
19. 权利要求l所述的装置，其中所述自组装单层位于所述工作电极上。
20. 权利要求l所述的装置，其中所述参比电极设置在所述工作电极 的周围，使得所述工作电极的一部分设置在所述参比电极的不同区域之间。
21. 权利要求l所述的装置，其中所述反电极设置在所述工作电极的 周围，使得所述工作电极的一部分设置在所述参比电极的不同区域之间。
22. —种电化学传感器装置，包括在基板上的电极，所述电极包括工作电极、参比电极、和反电极， 所述参比电极构造成没有固有电势，并包括导电材料单层；以及 所述参比电极上的自组装单层，所述自组装单层包括间隔基和活性探针，所述活性探针构造成对捕获探针具有比间隔基对该捕获探针更高的 亲和性，所述活性探针比所述间隔基在所述基板上延伸得更长， 所述活性探针和间隔基分别包括直接连接到所述参比电极上的硫， 所述活性探针和间隔基分别包括一个或多个亚烷基部分， 所述活性探针包括与所述直接连接到所述参比电极上的硫相对的末 端，所述活性探针的末端包括选自由氨基和羟基所组成的组的成分， 所述间隔基包括与所述直接连接到所述参比电极上的硫相对的末端，所述间隔基的末端不同于所述活性探针的末端，所述间隔基的末端包括 选自由烷基、氨基和羟基所组成的组的成分。
23. —种方法，包括提供一种包括基板上的电极的装置，所述电极包括工作电极、参比电 极、和反电极，所述参比电极构造成没有固有电势；以及所述参比电极上的自组装单层，所述自组装单层包括不均勻的化合物 选才奪；以及采用所述电极来测定是否耙试剂存在于溶液中，和/或所述靶试剂在 所述溶液中的量。
全文摘要
所述芯片包括基板上的电极。所述电极包括工作电极、参比电极和反电极。所述参比电极构造成不具有固有电势。自组装单层设置在所述参比电极上。所述自组装单层包括间隔基和活性探针。所述活性探针构造成对捕获探针具有比间隔基对该捕获探针更高的亲和性。
文档编号G01N33/566GK101688866SQ200880023278
公开日2010年3月31日 申请日期2008年5月28日 优先权日2007年7月2日
发明者J·-J·高 申请人:吉恩弗路迪克斯公司