涉及昆虫胆碱乙酰转移酶活性的调节害虫的生理状况的试剂的制作方法

专利名称：涉及昆虫胆碱乙酰转移酶活性的调节害虫的生理状况的试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及调节害虫的生理状况、涉及昆虫胆碱乙酰转移酶活性的试剂等。
背景技术：
胆碱乙酰转移酶(乙酰CoA:胆碱0-乙酰转移酶，EC 2. 3. 1. 6 ；同义词胆碱乙酰 化酶，胆碱0-乙酰转移酶；ChAT)是负责催化神经递质乙酰胆碱从其前体乙酰辅酶A(乙酰 CoA)和胆碱生物合成的酶。乙酰胆碱是被报道的第一种神经递质，并且其在一些重要的大 脑过程如学习、记忆和睡眠中具有关键的作用。乙酰胆碱在周围和中枢神经系统的胆碱能 神经元中发挥作用。在周围神经系统中，乙酰胆碱通过神经元_肌肉连接刺激肌肉收缩，并 且在中枢神经系统中，乙酰胆碱促进学习和短时记忆形成。对于来自包括昆虫的无脊椎动物的胆碱乙酰转移酶有如下的许多报道。线虫 (C. elegans)胆碱乙酰转移酶富集在胆碱能神经元的联会区(Duerr等人，中西海岸蠕虫 会议摘要(Midwest Worm Meeting abstract) 39)。线虫胆碱乙酰转移酶基因的功能缺失 突变导致在Ll幼虫期时生长停滞，并导致死亡(Yook和Jorgensen，西海岸蠕虫会议摘要 (West Coast Worm Meetingabstract) 260)。线虫胆碱乙酰转移酶基因的严重功能下降突 变导致生长缓慢，身材小以及不规律的排便周期(Rand和Russell，遗传学(Genetics)， 106(2) :227-248，1984)。突变导致对乙酰胆碱酯酶抑制剂如涕灭威(aldicarb)或敌百虫 (trichlorfon)耐药，可能是由于乙酰胆碱的合成低下导致(Rand和RusselLGenetics (遗 传学)，106 (2) :227-248，1984)。在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的所有发育阶段中，胆碱乙酰转移酶广 泛地分布在其中枢神经系统中(Gorczyca和Hall，神经科学杂志(J. Neurosci. )，7 (5) 1361-1369,1987)。黑腹果蝇胆碱乙酰转移酶基因的隐性非条件性功能缺失突变体在胚 胎晚期死亡(Greenspan，比较生理学杂志(J. Comp. Physiol.), 137 (1) :83_92，1980)。黑 腹果蝇胆碱乙酰转移酶的温度敏感性功能下降突变体在限制性温度下孵育后发生瘫痪 (Kitamoto等人，神经生物学(J. Neurobiol.), 42 (2) :161_171，2000)。在黑腹果蝇胆碱乙 酰转移酶基因座处使用温度敏感性功能缺失突变，已经显示正常乙酰胆碱代谢不是神经系 统的初始形成所必需的，但是对于随后其结构完整性和功能的维持其是必需的(Chase和 Kankel，发育生物学(Dev. Biol.), 125(2) :361_380，1988)。过去农药的发现基于随机筛选方法，经常直接检测特定化学物质对整个生物体诸 如昆虫、真菌和/或植物的作用，并且测定生物活性。一旦发现具有适当的生物活性的化学 化合物，需要更深入的研究来具体地在分子水平确定这些化合物的作用模式或作用部位， 以便预测这些化合物的安全性和环境载荷。

发明内容
本发明描述一种更加基于目标的筛选农业化学品的方法，其中针对特定的目标筛选化合物，所述目标已经鉴定为与化学干扰目标部位以控制害虫生物体的目的在生物学和
/或生理学上相关。具体地，本发明描述了使用一种调节害虫的生理状况并具有调节昆虫胆碱乙酰转 移酶的活性的能力的试剂用于控制害虫。S卩，本发明提供1. 一种调节害虫的生理状况的试剂，其中所述试剂具有调节昆虫胆碱乙酰转移酶 的活性的能力。2.根据第1项所述的试剂，其中所述胆碱乙酰转移酶是棉蚜胆碱乙酰转移酶；3.根据第1项所述的试剂，其中所述试剂是杀虫剂；4.根据第1项所述的试剂，其中所述调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力是抑 制所述昆虫胆碱乙酰转移酶与乙酰辅酶A和胆碱的反应的能力。5. 一种杀虫剂，包括具有调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力的物质或所述物 质的农业上可接受的盐作为活性成分；6.根据第5项所述的杀虫剂，其中所述物质具有抑制所述昆虫胆碱乙酰转移酶与 乙酰辅酶A和胆碱的反应的能力；7.根据第6项所述的杀虫剂，其中所述物质具有在无细胞系统中抑制所述昆虫胆 碱乙酰转移酶与乙酰辅酶A和胆碱的反应的能力，其中在10 μ M或更多的所述物质的存在 下，所述胆碱乙酰转移酶的活性低于不存在所述物质时的活性；8.根据第6项所述的杀虫剂，其中所述物质具有在无细胞系统中以ΙΟΟμΜ或更小 的IC5tl抑制所述昆虫胆碱乙酰转移酶与乙酰辅酶A和胆碱的反应的能力；9. 一种测定测试物质的杀虫活性的方法，包括(1)测定反应系统中选自下面A组中的胆碱乙酰转移酶的活性的第一步骤，在所 述反应系统中所述胆碱乙酰转移酶与测试物质接触；以及(2)基于通过比较在所述第一步骤中测定的活性与对照的活性而获得的差值评价 所述测试物质的杀虫活性的第二步骤<Α 组 >(a)包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列的蛋白；(b)包括SEQ ID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨 基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(c)包括与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序 列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(d)包括与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序 列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(e)包括由SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白；(f)包括由与SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核 苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；
(g)包括由多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多核苷酸在严谨的条件 下与包括与SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中 所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；
(h)包括昆虫胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的蛋白；以及(i)包括棉蚜胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的蛋白；10. 一种筛选杀虫物质的方法，包括选择具有由第9项所述的方法评价的所述杀 虫活性的物质；11. 一种杀虫剂，包括通过第10项所述的方法选择的物质或其农业上可接受的盐 作为活性成分；12. 一种控制害虫的方法，包括向害虫、所述害虫的栖息地或要保护免受所述害虫伤害的植物施用有效量的第5、6、7、8或11项所述的杀虫剂；13. —种控制害虫的方法，包括鉴定具有由第9项所述的方法评价的所述杀虫活性的物质，以及将所述害虫与所述被鉴定的杀虫物质接触；14. 一种昆虫胆碱乙酰转移酶，包括选自下列B组的氨基酸序列<B组〉(a) SEQ ID NO 1 的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序 列，其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(c)与SEQ ID NO=I的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(d)与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(e)由SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(f)由与SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核苷酸 序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(g)由多核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多核苷酸在严谨的条件下与包括与 SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸 序列具有胆碱乙酰转移酶活性；和(h)棉蚜胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列；15.昆虫胆碱乙酰转移酶作为提供评价杀虫活性的指标的试剂的应用；16.第14项所述的昆虫胆碱乙酰转移酶作为提供评价杀虫活性的指标的试剂的 应用；17. 一种多核苷酸，包括编码第14项所述的胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的核苷 酸序列；18.根据第17项所述的多核苷酸，包括SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列；19. 一种多核苷酸，包括与第17项或第18项所述的多核苷酸的核苷酸序列互补的 核苷酸序列；20. —种多核苷酸，包括第17项或第18项所述的多核苷酸的部分核苷酸序列；或与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列；21.根据第20项所述的多核苷酸，包括SEQ ID NO :4或5的核苷酸序列；22. 一种获得包括编码胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括使用第20项或第21项所述的多核苷酸作为引物，通过聚合酶链式反应扩增所需 多核苷酸；鉴定扩增的所需多核苷酸；以及回收所述鉴定的多核苷酸；23. 一种获得包括编码胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，包括使用第19项、第20项或第21项所述的多核苷酸作为探针，通过杂交检测所需多 核苷酸；鉴定检测到的所需多核苷酸；以及回收所述鉴定的多核苷酸；24. 一种环状多核苷酸，包括第17项或第18项所述的多核苷酸的核苷酸序列，其 中所述核苷酸序列可操作地连接于噬菌体启动子；25.根据第24项所述的环状多核苷酸，其中所述启动子为T7RNA聚合酶基因启动 子；26.根据第24项或第25项所述的环状多核苷酸，其中所述多核苷酸包括用于在宿 主细胞中自主复制的复制起点；27. 一种产生环状多核苷酸的方法，包括将第17项或第18项所述的多核苷酸连接 到载体中；28. 一种转化体，其中导入了第17项或第18项所述的多核苷酸；29.根据第28项所述的转化体，其中所述转化体是转化的大肠杆菌；30. 一种产生转化体的方法，包括将第17项或第18项所述的多核苷酸导入至宿主 细胞中；31. 一种产生胆碱乙酰转移酶的方法，包括培养第28项或第29项所述的转化体以 及回收产生的胆碱乙酰转移酶的步骤；32.第14项所述的胆碱乙酰转移酶或第17项-第21项中任意一项所述的多核苷 酸作为研究工具的应用；33.根据第32项所述的应用，其中所述研究工具是用于筛选杀虫物质的实验工 具；和34. —种系统，包括输入、储存和管理关于测试物质的能力的数据信息的装置，其中所述的能力是调 节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力；基于所需的标准查询和检索所述数据信息的装置；和显示和输出查询和检索的结果的装置。本发明的实施方式下面将详细地解释本发明。在本发明中，“害虫”指通过直接伤害人和动物或通过损害庄稼使人类生活受伤害 或不适的小动物。其实例包括节肢动物诸如昆虫、螨类和虱类和线虫类，并且其典型的实例 如下
半翅目(Hemiptera)飞風科(Delphacidae)如灰飞風(Laodelphax striatellus)、揭飞虱(Nilaparvata lugens)和白背稻飞虱(Sogatella furcifera)，角顶叶蝉科 (Deltocephalidae)如黑尾叶蝶(Nephotettix cincticeps)禾口 Empoasca onukii,虫牙科 (Aphididae)如棉虫牙(Aphis gossypii)禾口桃虫牙(Myzus persicae),虫春科(Pentatomidae), 粉虱科(Aleyrodidae)如温室粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、甘薯粉虱(Bemisia tabaci)和 Bemisia argentifolli,蚧科(Coccidae)，网蝽科(Tingidae)，木虱科 (Psyllidae)，等；鳞翅目(L印idoptera)螟蛾科(Pyralidae)如二 化螟(Chilo suppressalis)、稻纵卷叶 Sf _ (Cnaphalocrocis medinalis) >yjfl 玉 f _ (Ostrinia nuhilalis)禾口 Parapediasiateterrella，夜娥科(Noctuidae)如斜岐贪夜娥(Spodoptera litura)、贪夜 _ (Spodoptera exigua)(Pseudaletia separata)(Mamestrabrassicae)、 小地老虎(Agrotis ipsilon)、粉夜蛾属(Trichoplusia spp.)、实夜蛾属(Heliothis spp. )、Helicoverpa spp.和山卷蛾(Earias spp.)，粉蝶科(Pieridae)如菜粉 蝶日本亚种(Pieris rapae crucivora)，卷蛾科(Tortricidae)如棉褐带卷蛾 (Adoxophyes orana fasciata)、梨小食心虫(Grapholitamolesta)禾口 苹果皮小卷娥 (Cydia pomonella),虫主果娥禾斗(Carposinidae)如桃虫主果娥(Carposina niponensis), Bucculatricidae 如桃潜夜蛾(Lyonetiaclerkella)，细蛾科(Gracillariidae)如金纹 小潜细蛾(Phyllonorycterringoniella)，夜潜蛾科(Phyllocnistidae)如柑橘夜潜蛾 (Phyllocnistiscitrella)，巢娥科(Yponomeutidae)如小菜娥(Plutella xylostella), 麦蛾科(Gelechiidae)如红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)，灯蛾科(Arctiidae)，谷 蛾科(Tineidae)，等；双翅目(Diptera)库蚊属(Culex)如淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、三带喙库蚊 (Culestritaeniorhynchus)禾口致倦库岐(Culex quinquefasciatus)，伊岐属(Aedes) 如埃及伊岐(Aedes aegypti)禾口白纹伊岐(Aedes albopictus)，按岐属(Anopheles) 如中华按岐(Anophelinae sinensis)，摇岐科(Chironomidae)，妮科(Muscidae)如家 蠅(Musca domestica)禾口 厩腐蠅(Muscina stabulans),丽蠅科(Calliphoridae),麻 妮禾斗(Sarcophagidae)，夏厕妮(Fannia canicularis)，花妮禾斗(Anthomyiidae)如灰 地种蝇(Delia Platura)和葱地种蝇(Deliaantigua)，实蝇科(Trypetidae)，果蝇科 (Drosophilidae)，毛蠓科(Psychodidae)，蚋科(Simuliidae)，虻科(Tabanidae)，螫蝇科 (Stomoxyidae)，潜妮禾斗(Agromyzidae)，等；翘翅目(Coleoptera)谷物食虫(Diabrotica)如西方谷物食虫(Diabrotica virgifera virgifera)禾口 胃力 I · Ji (Diabrotica undecimpunctata howardi), ik ^l1 (Scarabaeidae)如古铜异丽金龟(Anomala cuprea)禾口多色异丽金龟(Anomala rufocuprea),象虫禾斗(Curculionidae)如玉米象(Sitophiluszeamais)、禾 S /K 象 (Lissorphoptrus oryzophilus)禾口绿豆象(Calosobruchyschinensis),拟步甲禾斗(Tenebrionidae)如黄粉甲(Tenebrio moIitor)禾口赤拟谷盗(Tribolium castaneum)， Bf 甲科(Chrysomelidae)如 /K 稻负泥虫(Oulema oryzae)、黄守瓜(Aulacophora femoral is)、黄曲条菜跳甲(Phyllotreta striolata)和马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata)，窃蠹科(Anobiidae)，瓢虫(Epilachna spp.)如 二十八斑瓢虫 (Epilachnavigintioctopunctata)，^(Lyctidae)，jkM.^ (Bostrychidae)，^牛禾斗 (Cerambycidae)，毒β急@虫(Paederus fuiscipes)，等；缨翅目(Thysanoptera)蓟马科(Thripidae)，如包括棕榈蓟马(Thripspalmi)的蓟马属(Thripsspp.)， 包括西方花蓟马(Flankliniella occidentalis)的花蓟马属(Frankliniellaspp.)，包括 Sciltothrips dorsalis 白勺 Sciltothrips，管I^j马禾斗(Phlaeothripidae)，等；膜翅目(Hymenoptera)叶蜂科(Tenthredinidae)，蚁科(Formicidae)，胡蜂科(Vespidae)，等；网翅目(Dictyoptera)蜚蠊科(Blattidae)，Blattellidae,等；直翅目(Orthoptera)剑角蝗科(Acrididae)，蝼蛄科(Gryllotalpidae)，等；圣目(Siphonaptera)人蚤(Pulex irritans)，等；虱目(Anoplura)体Ml (Pediculus humanus capitis)，等；等翅目(Isoptera)白蚁科(Termi t i dae)，等；蜱螨目(Acarina)叶螨科(Tetranychidae)如 二 斑叶螨(Tetranychus urticae)、神泽氏叶螨 (Tetranychus kanzawai)、ttt tit H 虫菌(Panonychus citri)、m L (Panonychus ulmi)和小爪螨属(Oligonychus spp.)，瘿螨科(Eriophyidae)如橘刺皮瘿螨(AcuIops pelekassi)和斯氏针刺瘿螨(Aculusschlechtendali)，附线螨科(Tarsonemidae)如 侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus),细须螨科(Tenuipalpidae),杜克螨科 (Tuckerellidae),硬蝶禾斗(Ixodidae)如长角血蝶(Haemaphysalislongicornis)、褐黄血蝶(Haemaphysalis flava)、台湾革蝶(Dermacentortaiwanicus)、卵形硬蝶(Ixodes ovatus)、全沟硬蝶(Ixodes persulcatus)禾口微小牛蝶(Boophilus microplus)，粉觸科 (Acaridae)如腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae),皮刺螨禾斗(Dermanyssidae),肉食 虫茜禾斗(Cheyletidae)如粉尘虫茜(Dermatophagoides farinae)禾口屋尘虫茜(Dermatophagoides ptrenyssnus),诸如普通肉食觸(Cheyletus eruditus)、马六甲肉食觸(Cheyletus malaccensis)禾口 Cheyletus moorei、皮刺螨(Dermanyssus spp.)，等；线虫类(Nematodes)咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)，伪短体线虫(Pratylenchus fallax)，大 豆异皮线虫(Heterodera glycines)，马铃暮金线虫(Globoderarostochiensis)，北方牛艮结 线虫(Meloidogyne hapla),南方根结线虫(Meloidogyne incognita),等。
在本发明中，“调节害虫的生理状况”是指将诸如活体内各种现象或其机制的状况 改变成不同于通常状况的状况，所述现象是用于维持害虫生存的现象，例如，诸如呼吸、消 化、分泌、体液循环、新陈代谢和神经传递。实例包括通过停止呼吸以致不提供用于害虫体 内新陈代谢所必需的氧气而改变状况，和通过停止害虫的神经传递功能以致害虫的各种运 动停止而改变状况。 在本发明中，“调节害虫的生理状况的试剂”是当施用于害虫时可以调节害虫的生 理状况的试剂。在本发明中，“昆虫胆碱乙酰转移酶”是指在昆虫中存在的胆碱乙酰转移酶，是 在各种生物体中存在的胆碱乙酰转移酶之一。在本文中，昆虫是在动物界(Animalia)， 节肢动物门(Arthropod)，昆虫纲(Insecta)下分类的动物，并且它的实例包括下列 各目的节肢动物原尾目(Protura，弹尾目(Collembola)，双尾目(Diplura)，缨尾目 (Thysanura),蜉蝣目(Ephemeroptera),蜻蜒目(Odonata),织翼夜蛾目(Plecoptera)， 蛩蠊目(Grylloblattodea)，直翅目(Orthoptera)，竹节虫目(Phasmatodea)，革翅目 (Dermaptera), if g (Mantodea), Blattaria, S (Isoptera), g (Embioptera), 啮虫目(Psocoptera)，食毛目(Mallophaga)，虱目(Anoplura)，缨翅目(Thysanoptera)，半 翅目(Hemiptera)，脉翅目(Neuroptera)，长翅目(Mecoptera)，毛翅目(Trichoptera)J-翅目(L印idoptera)，鞘翅目(Coleoptera)，双翅目(Diptera)，膜翅目(Hymenoptera)，蚤 巨(Siphonaptera), § (Strepsiptera)，等。胆碱乙酰转移酶(乙酰CoA:胆碱O-乙酰转移酶，EC 2. 3. 1. 6 ；同义词胆碱乙酰 化酶，胆碱O-乙酰转移酶；ChAT)催化神经递质乙酰胆碱从其前体乙酰辅酶A(乙酰CoA)和 胆碱合成的反应。胆碱乙酰转移酶的活性可使用基于放射性测量的体外测定法来监测。例如，如 Heo Ho-Jin等人，生物科学、生物技术和生物化学(Biosci. Biotechnol. Biochem.) ,67(6)， 1284-1291,2003所报道的，在使用放射性标记的14C乙酰辅酶A在乙酰辅酶A和胆碱的底 物上进行胆碱乙酰转移酶催化的反应后，用四苯硼(TPB)萃取形成的14C-乙酰胆碱。将两 相分离，并在液体闪烁计数器上测量上面的相的放射活性。可用来测量胆碱乙酰转移酶活性的另一种测定法是吸光度测定法。吸光度测定法 的原理是可通过使用5，5’_ 二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)试剂测量由胆碱乙酰转移 酶反应形成的游离辅酶A(CoA)来测定胆碱乙酰转移酶活性。DTNB与溶液中游离的巯基反 应以产生5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)。TNB是黄色的，并且在412nm处具有最大吸光度。 然后此有色的TNB可通过405nm处的吸光度来测量。在上述的胆碱乙酰转移酶活性的测定法中，使用DTNB的测定法优选用于在大量 样品中机械地和有效地测量胆碱乙酰转移酶活性。具体来说，在乙酰辅酶A和胆碱底物上 进行胆碱乙酰转移酶反应后，加入DTNB，然后通过酶反应形成的游离CoA通过测量405nm处 的吸光度而被定量。昆虫胆碱乙酰转移酶的活性可通过类似于上述的方法测量。已经在不同的昆虫物种中鉴定了几种胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列，诸如黑腹 果蝇(亚型A，登记号NP_477004;和亚型B，登记号NP_996239)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)(登记号 XP_975503)、意大利蜜蜂(Apismellifera)(登记号 XP_392463)、埃及伊岐(Aedes aegypti)(登记号 XP_001660851)和冈比亚按岐(Anopheles gambiae)(登记 号XP_312586)，它们可以在公共数据库中找到。 此外，已经在不同的昆虫物种中鉴定了几种胆碱乙酰转移酶基因的核苷酸序 列，诸如黑腹果蝇(亚型A，登记号NM_057656 ；和亚型B，登记号NM_206517)、赤拟谷盗 (Tribolium castaneum)(登记号 XM_970410)、意大利蜜蜂(Apis mellifera)(登记号 XM_392463)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(登记号 XM_001660801)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)(登记号XM_312586)，它们可以在公共数据库中找到。另外，根据下述的方法，可从棉蚜鉴定胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列和胆碱乙酰 转移酶基因的核苷酸序列。鉴定的棉蚜胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列显示在SEQ ID NO 1 中，并且棉蚜胆碱乙酰转移酶基因的核苷酸序列显示在SEQ ID N0:2中。已经在除昆虫之外的动物中鉴定了几种胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列，所述动物 诸如秀丽线虫(Ceanorhabditis elegans)(登记号 AAB88370)和人类(Homo sapiens)(登 记号NP065574)，它们可在公共数据库中找到。在除昆虫之外的动物中也已经鉴定了几种胆 碱乙酰转移酶基因的核苷酸序列，所述动物诸如秀丽线虫(登记号ZC416. 8)和人类(登记 号NM_020549)，它们可在公共数据库中找到。表1显示棉蚜胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)和棉蚜胆碱乙酰转移 酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)与在其它动物中发现的胆碱乙酰转移酶及其基因的序 列的序列同一性。表1 调节昆虫胆碱乙酰转移酶活性的能力是指增加或者减少昆虫胆碱乙酰转移酶活 性的能力，即，意指激活胆碱乙酰转移酶的能力，或者抑制胆碱乙酰转移酶活性的能力。并 且，可以向测量胆碱乙酰转移酶活性的反应系统中加入测试物质，以研究所述测试物质对 胆碱乙酰转移酶活性的影响。已经知道几种具有抑制胆碱乙酰转移酶的活性的能力的物质，诸如溴化乙酰胆碱 (Sastry 和 Janson，眼科药理学杂志(J. Ocular Pharmacol.)，10 :203_215，1994)、茶黄素 (Sugatani 等人，国际变态反应和免疫学文献(Int. Arch. Allergy Immunol.)，134 =17-28, 2004)和 α -NETA (Sastry 等人，药理学和试验治疗学杂志(J. Pharmacol. Exp. Ther.), 245 72-80，1988)。反应中测试物质的IC5tl值意指不含测试物质的反应的活性的50%被抑制时的测 试物质的浓度。测试物质的IC5tl值可以通过这样确定将不同浓度的测试物质添加到胆碱 乙酰转移酶活性测量反应系统中，测量在加入的测试物质的各个浓度(剂量)下的胆碱乙 酰转移酶活性(反应)，产生剂量-反应曲线，并且计算胆碱乙酰转移酶活性被抑制50%时 所加入的测试物质的浓度。更具体地，剂量_反应曲线可以使用4参数逻辑模型或S形剂 量_反应模型生成 气 f.以计算IC5tl值。特别地，IC5tl值可以使用市售的计算软件XLfit(由IDBS制作) 进行计算。具有调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力的试剂是一种含有具有调节昆虫胆 碱乙酰转移酶的活性的能力的物质作为活性成分的试剂。在本发明中，“调节害虫的生理状况的试剂，其中所述试剂具有调节昆虫胆碱乙酰 转移酶的活性的能力”是一种具有通过前文提及的测量方法鉴定的调节昆虫胆碱乙酰转移 酶的活性的能力的试剂，并且意指可以调节害虫的生理状况的试剂。所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中昆虫胆碱乙酰转移酶是棉蚜胆碱乙酰转移酶。另外，所述试剂的优选实例包括这样的试剂，即，其中调节害虫的生理状况的试剂是杀虫剂。另外，所述试剂 的优选实例包括这样的试剂，即，其中调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力是抑制使用 乙酰辅酶A和胆碱作为底物的反应的能力。在本发明中，“杀虫剂”是指具有控制害虫的能力的试剂。除本发明中公开的方法之外，用于测量控制害虫的能力的方法的实例还包括，测 定对害虫的杀虫活性的方法。具体地，例如，可以按照下述方法检测杀虫活性。按照昆虫饲养手册(Handbook of Insect Rearing)第1卷(Elsevier科学出版 社(Elsevier Science Publisers) 1985)第35-36页所述的方法，除了制备具有表2中所 示的组成的无菌人工饲料之外，并且按人工饲料体积的0. 5%加入在DMSO中的测试试剂溶 液，并且混合，饲养棉蚜，在6天后研究存活的棉蚜的数目，并且按照下述方程获得控制值。表2氨基酸_ (mg/100 ml)维生素_(mg/100 ml) 控制值(%) = U-(CbXTai)/(Cai X Tb)} xlOO在所述方程中的字母代表下述含义Cb 在未处理部分中在处理之前存活的蠕虫数目Cai 在未处理部分中在观察时存活的蠕虫数目Tb 在未处理部分中在处理之前存活的蠕虫数目Tai 在处理部分中在观察时存活的蠕虫数目可以这样说，表现出显著高的控制值的测试试剂具有杀虫活性。优选地，可以确 定，具有30%或更大的控制值的测试试剂实质上具有杀虫活性，并且可以确定，具有小于30%的控制值的测试试剂实质上没有杀虫活性。
本发明的杀虫剂包含具有调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力的化学物质或 其农业上可接受的盐作为活性成分。在本发明中，农业上可接受的盐是指以这样的形式存在的盐，S卩，控制试剂的制备 及所述制剂的应用是可能的，并且可以是任何形式的盐。具体地，所述盐的实例包括与无机 酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、和磷酸，有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥 珀酸、延胡索酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、和乙磺酸，或酸性氨基酸如 天冬氨酸和谷氨酸的酸式加成盐；与无机碱如钠、钾、镁和铝的盐，与有机碱如甲胺、乙胺和 乙醇胺，或碱性氨基酸如赖氨酸和鸟氨酸的盐；以及铵盐。在本发明中，“包含具有调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力的物质或其农业 上可接受的盐作为活性成分的杀虫剂”意指以下试剂，其可以通过包含具有在所述测量方 法中鉴定的调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力的物质或其农业上可接受的盐作为活 性成分而控制害虫。所述物质的优选实例包括具有抑制胆碱乙酰转移酶与乙酰辅酶A和胆 碱反应的能力的化合物。所述物质的更优选的实例包括具有在无细胞系统中抑制昆虫胆碱 乙酰转移酶与乙酰辅酶A和胆碱反应的能力的物质，其中在10 μ M或更多的所述物质的存 在下，胆碱乙酰转移酶的活性低于在不存在所述物质时的活性。另外，所述物质的进一步优 选的实例包括具有在无细胞系统中以ΙΟΟμΜ或更小的IC5tl抑制昆虫胆碱乙酰转移酶与乙 酰辅酶A和胆碱反应的能力的物质。在本发明中，“测定测试物质的杀虫活性的方法，其包括测量反应系统中选自下面 A组中的胆碱乙酰转移酶的活性的第一步骤，在所述反应系统中所述胆碱乙酰转移酶与测 试物质接触；以及基于通过比较在所述第一步骤中测量的活性与对照的活性而获得的差值 评价所述测试物质的杀虫活性的第二步骤”是指特征在于在用于测定测试物质的杀虫能力 的各种方法中包括所述第一步和所述第二步的方法。在本文中，A组是指(a)包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列的蛋白；(b)包括SEQ ID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨 基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(c)包括与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序 列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(d)包括与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序 列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(e)包括由SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白；(f)包括由与SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核 苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(g)包括由多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多核苷酸在严谨的条件 下与包括与SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中 所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(h)包括昆虫胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的蛋白；以及(i)包括棉蚜胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的蛋白。
第一步是在通过将测试物质加入到前文提及的各种胆碱乙酰转移酶活性测量反 应系统中而使得胆碱乙酰转移酶与测试物质接触的状态下测量胆碱乙酰转移酶活性的步骤。第二步是比较测试物质测量的活性与对照物质的活性并且基于该差值评价杀虫 能力的步骤。在本文中，对照意指，例如，在将溶解在溶剂中的测试物质添加到反应系统中 的情况下，其中只加入与用来溶解所述测试物质相同的溶剂的检测部分。在具有第一步骤和第二步骤的用于测定测试物质所拥有的杀虫能力的方法中，所 用的胆碱乙酰转移酶是在A组中所示的蛋白。在A组的蛋白中，在由(a)表示的蛋白的氨 基酸序列和由(b)，(c)，(e), (f)，(g)，(h)和(i)表示的蛋白的氨基酸序列之间可以识别 的差异是部分氨基酸的缺失、置换、添加等。这些包括，例如，由于具有由(a)表示的氨基酸 序列的蛋白在细胞中经受的加工所引起的缺失。另外，实例包括由以下所产生的氨基酸的 缺失、置换、添加等由于剪接差异或蛋白来源的生物体的个体差异而引起的天然存在的基 因突变，或通过定点诱变、随机诱变、突变处理等而人工引入的基因突变。经受缺失、置换、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现胆碱乙酰转移酶的胆碱 乙酰转移酶活性的范围内的数目。另外，氨基酸置换的实例包括用在疏水性、电荷、PH和 空间结构上特征相似的氨基酸进行置换。所述置换的具体实例包括在下列各组中的置换 (1)甘氨酸，丙氨酸；(2)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨 酰胺，(4)丝氨酸，苏氨酸；(5)赖氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。人工引入氨基酸的缺失、添加或置换(下文，在一些情形中总称为氨基酸的改 变)的方法的实例包括将定向突变引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中，并且 然后通过常规方法表达这一 DNA的方法。在此处，定点诱变的实例包括应用琥珀突变 的方法(缺口双链方法(gapped duplexmethod)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，12， 9441-9456 (1984))、通过使用用于引入突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸 的方法的实例包括将突变随机引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中并且然后通过 常规方法表达这一 DNA的方法。在此处，随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种 前文提及的氨基酸序列的DNA作为模板并且使用可以扩增各种全长DNA的引物对在下列反 应条件下进行PCR的方法即，在用作底物的各种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从常 规浓度改变的反应条件下，或在促进聚合酶反应的Mg2+的浓度从常规浓度升高的反应条件 下。PCR方法的实例包括，例如，在分子生物学方法(Methodin Molecular Biology)，(31)， 1994,97-112中所述的方法。另一个实例包括在WO 0009682中所述的方法。在本文中，“序列同一性”是指两个核苷酸序列或两个氨基酸之间的同一性。“序 列同一性”通过比较待比较的序列的所有区域中以最适状态排列的两个序列而确定。在此 处，在待比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比对中，可以允许添加或缺失(例如，缺口 等)。可以通过使用如FASTA[Pearson和Lipman，美国科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，4，2444-2448 (1988)]、BLAST [Altschul 等，分子生物学杂志(Journal ofMolecular Biology)，215，403-410(1990)]、和 CLUSTAL W[Thompson, Higgins 和 Gibson，核酸研究 (Nucleic Acid Research)，22，4673-4680 (1994a)]等的程序分析同源性以生成序列比对 来计算序列同一性。所述程序可从日本DNA数据库日本信息生物学和DNA数据库中心 (Center for InformationBiology and DNA Data Bank of Japan) f= 的国P示 DNA —库；CIB/DDBJ的网站(http://www.ddbj.nig.ac.jp)上获得。序列同一性还可以使用市 售的序列分析软件来分析。具体地，可以使用GENETYX-WIN第5版(由软件开发有限公 司(Software Development Co. Ltd.)制造)通过 Lipman-Pearson 方法Lipman，D. J.禾口 Pearson, W. R.，科学(Science)，227，1435-1441，(1985)分析同源性以生成序列比对而计
算序列同一性。
当如上所述的两个最优排列的氨基酸序列在序列中由于保守氨基酸置换而具有 差异时，使用“序列相似性”以便表示置换的氨基酸的保守性。可以这样说，在具有由保守 氨基酸置换引起的序列中差异的序列对之间存在序列相似性。此种类型的序列相似性可使 用诸如上面FASTA的程序来分析。氨基酸可分为四组疏水性氨基酸、中性氨基酸、酸性氨 基酸和碱性氨基酸。氨基酸被同一组的另一氨基酸置换称为保守氨基酸置换。疏水氨基酸组包括丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，蛋氨酸(M)， 色氨酸(W)，苯丙氨酸(F)和脯氨酸⑵。中性氨基酸组包括甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，半胱氨酸(C)，酪氨酸(Y)， 天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。酸性氨基酸组包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。碱性氨基酸组包括赖氨酸(K)，组氨酸(H)和精氨酸(R)。在(g)中所述的“严谨的条件”的实例包括以下条件在该条件下，在根据例 如，Sambrook J.，Frisch E. F.，Maniatis T.，分子克隆第二版，冷泉港实验室出版社 (Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratorypress)中所述白勺常 规方法进行的杂交中，在45°C下在含有6 X SSC (含有1.5m NaCl和0. 15m柠檬酸钠的溶液 是10XSSC)的溶液中形成杂交物，并且然后将该杂交物用2XSSC在50°C下洗涤(分子生 物学(MolecularBiology), John Wiley 和 Sons，纽约(1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6) 洗涤步骤中 的盐浓度可选自从2XSSC(低严谨度条件)至0.2XSSC(高严谨度条件)的条件。洗涤步 骤中的温度可选自，例如，从室温(低严谨度条件)至65°C (高严谨度条件)的条件。可选 地，盐浓度和温度两者都可改变。(i)中所述的蛋白表示存在于棉蚜中的胆碱乙酰转移酶，是昆虫胆碱乙酰转移酶 的一种，并且包括(a)中所述的氨基酸序列。尽管A组的蛋白包括(c)中所述的蛋白，其包括与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有 50%或更高的序列同一性的氨基酸序列，并具有胆碱乙酰转移酶活性，但可优选地使用具 有胆碱乙酰转移酶活性并包括与SEQ ID N0:1的氨基酸序列具有至少55、60、65、70、75或 80%的序列同一性的氨基酸序列，并且可高度优选具有胆碱乙酰转移酶活性并包括与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少85、90或95%的序列同一性的氨基酸序列。尽管A组的蛋白也包括(d)中所述的蛋白，其包括与SEQ ID NO=I的氨基酸序列 具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序列，并具有胆碱乙酰转移酶活性，但可优选地使 用具有胆碱乙酰转移酶活性并包括与SEQ IDNO 1的氨基酸序列具有至少80%的序列相似 性的氨基酸序列，并且可高度优选具有胆碱乙酰转移酶活性并包括与SEQ ID N0:1的氨基 酸序列具有至少85、90或95%的序列相似性的氨基酸序列。具有杀虫能力的物质可以通过使用测量对上文提及的害虫的杀虫能力或控制作 用来测定杀虫能力的方法进行筛选。
可选地，具有杀虫能力的物质还可以通过前文提及的使用胆碱乙酰转移酶测定杀 虫能力的方法进行筛选。具体地，当通过前文提及的使用胆碱乙酰转移酶测定杀虫能力的 方法鉴定测试物质的杀虫能力是特定的值以上，或者特定的值以下时，可以通过选择所述 物质而筛选具有杀虫能力的物质。由于通过所述筛选方法选择的物质具有杀虫能力，所以它可以用作包含所述物质 或其农业上可接受的盐作为活性成分的杀虫剂。害虫的控制通常可以通过将有效量的杀虫剂施用于将被保护的农作物、害虫或害 虫的栖息地而进行。
当将杀虫剂用于农业和林业时，其使用量通常关于每1000m2，杀虫剂的量为0. 1到 IOOOgo当将杀虫剂配制成乳剂、水可分散的粉剂、易流动的制剂、微胶囊制剂等时，所述试 剂通常通过用水将活性成分稀释至1到10，OOOppm的浓度，并且将其喷雾而施用，并且当杀 虫剂配制成颗粒剂、粉剂等时，所述试剂通常按照原样进行施用。杀虫剂可以通过叶面_处理诸如农作物等应该保护免受害虫伤害的植物而使用， 并且还可以通过在移栽农作物的植株之前处理苗床，或者处理栽植时的栽植穴或品系基部 (strain base)而使用。此外，为了控制害虫在耕地的土壤中栖息的目的，可以通过处理 所述土壤而使用所述试剂。可选地，所述试剂可以通过将已经加工成薄片或细线的树脂制 剂缠绕在农作物上，将所述制剂在农作物附近铺开和/或散布在品系基部的土壤表面而使 用。当将杀虫剂用作害虫控制剂用于防止流行病时，乳剂、水可分散的粉剂、流动剂等 通常通过用水稀释以致活性成分的浓度为0. 01到10，OOOppm而施用，并且油性试剂、气溶 胶、薰剂、毒饵等按照原样进行施用。杀虫剂的一种用途的实例包括控制家畜如牛、绵羊、山羊和鸡或小动物如狗、猫、 大鼠和小鼠的体外寄生虫，在这种情形中，所述试剂可以通过兽医学已知的方法施用给动 物。作为一种具体的施用方法，当意欲全身控制时，例如，所述试剂通过片剂、混合在饲料 中、栓剂、注射剂(肌内、皮下、静脉内、腹膜内等)等而施用，当意欲非全身控制时，所述试 剂通过喷雾油性试剂或水性液体试剂、在处理时进行倾倒或打点、用洗发精制剂清洗动物 或给动物附上已经加工成项圈或耳签的树脂制剂的方法而使用。当施用给动物体时杀虫剂 的量通常在0. 1到1，OOOmg范围内，其表示为每Ikg动物的化合物A和化合物B的总量。它们的施用量和施用浓度都取决于这样的情形而不同，所述情形诸如制剂种类、 施用时间、施用位置、施用方法、害虫种类、损害程度等，可以增加或减少，而不管前文提及 的范围，并且可以适当地进行选择。前文提及的杀虫剂可以用于如上所述的控制害虫的方法中。另外，还可以通过前文提及的测定测试物质拥有的杀虫能力的方法鉴定具有杀虫 能力的物质(所述鉴定方法包括使用选自A组的胆碱乙酰转移酶的第一步骤和第二步骤)， 并且将所鉴定的具有杀虫能力的物质与害虫接触而控制害虫。在此处，为了将所鉴定的具 有杀虫能力的物质与害虫接触，可以使用前文提及的制备方法、施用方法等。B组中所示的氨基酸序列是昆虫胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列，其包含下述(a) 到(h)的任一种氨基酸序列(a) SEQ ID NO 1 的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序 列，其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(c)与SEQ ID NO=I的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(d)与SEQ ID NO=I的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(e)由SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列编码的氨基酸序列； (f)由与SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核苷酸 序列编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(g)由多核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多核苷酸在严谨的条件下与包括与 SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述氨基酸 序列具有胆碱乙酰转移酶活性；和(h)棉蚜胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列。在B组的氨基酸序列中，在由(a)表示的氨基酸序列和由(b)，(C)，(e)，(f)，(g) 和(h)表示的氨基酸序列之间可以识别的差异是部分氨基酸的缺失、置换、添加等。这些包 括，例如，由于具有由(a)表示的氨基酸序列的蛋白在细胞中经受的加工引起的缺失。另 夕卜，实例包括由下面各项所产生的氨基酸的缺失、置换、添加等由于剪接差异或蛋白来源 的生物体的个体差异而引起的天然存在的基因突变，或通过定点诱变、随机诱变、突变处理 等而人工引入的基因突变。经受缺失、置换、添加等的氨基酸数目可以是在可以发现胆碱乙酰转移酶的肽酶 活性的范围内的数目。另外，氨基酸置换的实例包括用在疏水性、电荷、PH和空间结构上特 征相似的氨基酸进行置换。所述置换的具体实例包括在下列各组中的置换(1)甘氨酸，丙 氨酸；(2)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；(3)天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，(4)丝氨 酸，苏氨酸；(5)赖氨酸，精氨酸；(6)苯丙氨酸，酪氨酸等。人工引入氨基酸的缺失、添加或置换(下文，在一些情形中总称为氨基酸的改变) 的步骤的实例包括将定点突变引入到编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中，并且然后通 过常规方法表达这一 DNA的方法。在此处，定点诱变的实例包括应用琥珀突变的方法(缺 口双链方法，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，12，9441-9456 (1984))、通过使用用于引入 突变的引物的PCR的方法等。另外，人工改变氨基酸的步骤的实例包括将突变随机引入到 编码由(a)表示的氨基酸序列的DNA中并且然后通过常规方法表达这一 DNA的方法。在此 处，随机引入突变的方法的实例包括使用编码任一种前文提及的氨基酸序列的DNA作为模 板并且使用可以扩增各种全长DNA的引物对在下列反应条件下进行PCR的方法S卩，在用作 底物的每种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的添加量从常规浓度改变的反应条件下，或在促进聚 合酶反应的Mg2+的浓度从常规浓度升高的反应条件下。PCR方法的实例包括，例如，在分子 生物学方法(Method in Molecular Biology), (31)，1994，97-112 中所述的方法。另一个 实例包括在WO 0009682中所述的方法。在本文中，“序列同一性”是指两个核苷酸序列或两个氨基酸之间的同一性。“序 列同一性”通过比较待比较的序列的所有区域中以最适状态排列的两个序列而确定。待 比较的核苷酸序列或氨基酸序列的最佳比对可以允许添加或缺失(例如，缺口等)。可以通过使用如 FASTA[Pearson 和 Lipman，美国科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)， 4,2444-2448(1988)]、BLAST[Altschul 等，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)，215，403-410(1990)]、和 CLUSTAL W[Thompson, Higgins 和 Gibson，核酸研究 (Nucleic Acid Research)，22，4673-4680 (1994a)]等的程序分析同源性以生成序列比对 来计算序列同一性。所述程序可从日本DNA数据库日本信息生物学和DNA数据库中心 (Center for Information Biology and DNA DataBank of Japan) f= 的国P示 DNA — 库；CIB/DDBJ]的网站(http://www. ddbj. nig. ac. jp)上获得。序列同一性还可以使用市 售的序列分析软件来分析。具体地，可以使用GENETYX-WIN第5版(由软件开发有限公 司(Software Development Co. Ltd.)制造)通过 Lipman-Pearson 方法Lipman, D. J.禾口 Pearson, W. R.，科学(Science)，227，1435-1441，(1985)分析同源性以生成序列比对而计 算序列同一性。当如上所述的两个最优排列的氨基酸序列在序列中由于保守氨基酸置换而具有差异时，使用“序列相似性”以便表示置换的氨基酸的保守性。可以这样说，在具有由保守 氨基酸置换引起的序列中差异的序列对之间存在序列相似性。此种类型的序列相似性可使 用诸如上面FASTA的程序来分析。氨基酸可分为四组疏水性氨基酸、中性氨基酸、酸性氨 基酸和碱性氨基酸。氨基酸被同一组的另一氨基酸置换称为保守氨基酸置换。疏水氨基酸组包括丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，蛋氨酸(M)， 色氨酸(W)，苯丙氨酸(F)和脯氨酸⑵。中性氨基酸组包括甘氨酸(G)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，半胱氨酸(C)，酪氨酸(Y)， 天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。酸性氨基酸组包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。碱性氨基酸组包括赖氨酸(K)，组氨酸(H)和精氨酸(R)。在(g)中所述的“严谨的条件”的实例包括以下条件，在该条件下，在根据例 如，Sambrook J.，Frisch E. F.，Maniatis T.，分子克隆第二版，冷泉港实验室出版社 (Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratorypress)中所述白勺常 规方法进行的杂交中，在45°C下在含有6 X SSC (含有1.5m NaCl和0. 15m柠檬酸钠的溶液 是10XSSC)的溶液中形成杂交物，并且然后将该杂交物用2XSSC在50°C下洗涤(分子生 物学(MolecularBiology), John Wiley 和 Sons，纽约(1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6) 洗涤步骤中 的盐浓度可选自从2XSSC(低严谨度条件)至0.2XSSC(高严谨度条件)的条件。洗涤步 骤中的温度可选自，例如，从室温(低严谨度条件)至65°C (高严谨度条件)的条件。可选 地，盐浓度和温度两者都可改变。具有(h)中所述的氨基酸序列的蛋白表示存在于棉蚜中的胆碱乙酰转移酶，是昆 虫胆碱乙酰转移酶的一种，并且包括含有(a)中所述的氨基酸序列的蛋白。尽管B组的氨基酸序列包括(c)中所述的氨基酸序列，其具有与SEQ IDNO 1的氨 基酸序列具有50%或更高的序列同一性，并具有胆碱乙酰转移酶活性，但可优选地使用具 有胆碱乙酰转移酶活性并与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少55、60、65、70、75或80% 的序列同一性的氨基酸序列，并且可高度优选具有具有胆碱乙酰转移酶活性并与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少85、90或95%的序列同一性的氨基酸序列。尽管B组的氨基酸序列也包括(d)中所述的氨基酸序列，其与SEQ IDNO 1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性，并具有胆碱乙酰转移酶活性，但可优选地使用具有 胆碱乙酰转移酶活性并与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少80%的序列相似性的氨基 酸序列，并且可高度优选具有胆碱乙酰转移酶活性并与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至 少85、90或95%的序列相似性的氨基酸序列。具有在B组中所示的氨基酸序列的蛋白可以按照下文所述的方法、使用编码在B 组中所示的氨基酸序列的多核苷酸进行制备。
昆虫胆碱乙酰转移酶可以用作提供评价杀虫活性的指示剂的试剂。具体地，例如， 昆虫胆碱乙酰转移酶可以通过用作在使用胆碱乙酰转移酶测定杀虫能力的方法中使用的 胆碱乙酰转移酶而用作提供评价杀虫活性的指示剂的试剂。另外，更具体的方法可以根据 前文所述的测量胆碱乙酰转移酶的活性的方法而进行。另外，当昆虫胆碱乙酰转移酶用作提供评价杀虫活性的指示剂的试剂时，优选地， 昆虫胆碱乙酰转移酶是具有选自B组的氨基酸序列的胆碱乙酰转移酶。具有编码在B组中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下，在一些情 形中叫作多核苷酸B组)具有这样的核苷酸序列，在生物体的细胞中或体外翻译系统中可 以从该核苷酸序列产生具有B组中所示的氨基酸序列的蛋白。多核苷酸B组可以是从自然 界克隆的DNA，例如通过定点诱变或随机诱变向从自然界克隆的DNA中引入核苷酸的缺失、 替代或添加的DNA，或人工合成的DNA。具体地，实例包括包含SEQ ID NO 2的核苷酸序列 的多核苷酸。<第一种获得方法>例如，将在下文中显示获得包括SEQ ID NO :3的核苷酸序列的多核苷酸的方法。该 多核苷酸含有包括SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸，并包括在多核苷酸B组中。该 方法包括从棉蚜获得总RNA，从该RNA合成cDNA文库，并且进行PCR扩增以获得目的多核苷酸。将在盆栽黄瓜的叶片上养殖的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和幼虫用小刷 子从叶片表面刮下，并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的 冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由日本基因(Nippon Gene)制造)按下述分 离RNA。在将IOml ISOGEN加入到研钵中的冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末保持在 冰上碾磨10分钟。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml 氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制造)。立即 将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4°C以12，OOOxg 离心15分钟，并且将每个5ml水层转移到两个新管中。在将5ml ISOGEN加入到各管中后， 将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4°C以 12，OOOxg离心15分钟，并且将各个IOml水层分别转移到新的50ml管中。随后，将IOml异 丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制造)加入到各管中，并且将混合物在冰上放置30分 钟。将得到的混合物在4°C以12，OOOxg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中 加入20ml 70%乙醇。将得到的混合物在4°C以10，OOOxg离心5分钟。去除上清后，将总 RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在Iml市售的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque公司) 中。在260nm测量制备的总RNA的吸光度，以根据常规方法计算浓度。应用通过上述方法获得的棉蚜总RNA作为模板，并且根据试剂附带的手册使用随机引物(由 Invitrogen 制造)和 superscript III (由 Invitrogen 制造)进行 RT-PCR，以 合成第一链cDNA。应用通过上述方法获得的棉蚜cDNA文库作为模板，并且根据试剂附带的手册使 用包括SEQ ID NO 4的核苷酸序列的寡核苷酸引物和包括SEQID NO 5的核苷酸序列的寡 核苷酸引物以及Pfu Ultra HF Taq聚合酶(由Stratagene制造)进行PCR。PCR的条件 如下在94°C起始变性10分钟；然后是35个PCR循环，一个循环为94°C 20秒，53°C 20秒， 和72°C 3分钟；接着在72°C 7分钟。如上文所述，可以获得包括SEQ ID NO 3的核苷酸序列的多核苷酸。 〈第二种获得方法〉在多核苷酸B组中所示的多核苷酸还可以通过制备具有由利用琥珀突变的方法 引入的突变的多核苷酸而获得，所述方法为上文提及的定点诱变，为一种使用包括SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列的多核苷酸作为模板通过使用用于引入突变等的引物的PCR方法。〈第三种获得方法〉还可以通过使用包括SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列的多核苷酸作为探针的杂交 方法而获得在多核苷酸B组中所示的多核苷酸。更具体地，第三种获得方法可以根据在前 文提及的由冷泉港实验出版社出版的Sambrook J.，Frisch E. F.，Maniatis T.，分子克隆 第二版中所述的常规杂交而进行。〈第四种获得方法〉可选地，在多核苷酸B组中所示的多核苷酸还可以通过基于已知的昆虫胆碱乙酰 转移酶的氨基酸序列制备引物并且进行PCR而获得。为了从其它昆虫物种如德国蟑螂(德 国小蠊(Blatella germanica))分离胆碱乙酰转移酶基因的同源物，应用Codehop程序(在 由Fred Hutchinson癌症研究中心内运行的Blocks蛋白质分析服务器(Blocks Protein Analysis Server)的网站 http://blocks. fhcrc. org/blocks/codehop. html 上可公共地 获得)，并且基于前文提及的棉蚜胆碱乙酰转移酶基因的序列和先前已知的来自诸如黑腹 果蝇(NCBI登记号P07668)，秀丽线虫(P32756)和R比亚按蚊(XP_312586)的氨基酸序列， 设计简并引物。选择的昆虫物种的胆碱乙酰转移酶基因的同源物的部分序列通过一系列PCR扩 ±曾，所述PCR使用来源于昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处，所述作为模板的第一链 cDNA通过前文提及的方法使用SuperscriptIII制备。PCR扩增使用作为正向引物和反向 引物的一组简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制造) 根据所述试剂附带的生产厂商的方法而进行。PCR条件为进行递降PCR的那些条件，如下 在94°C起始变性10分钟；然后是10个递降-PCR循环，一个循环为94°C 30秒，60°C 1分 钟，每个循环降低1°C，和72°C 1分30秒；接着是25个PCR循环，一个循环为94°C 30秒， 50 0C 1分钟和72 °C 1分30秒；并且接着在72 °C 7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行 分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen 制造)中，并且测序。然后，设计对所得到的胆碱乙酰转移酶基因的昆虫同源物的部分序列特异的引 物，并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以获得所述基因的全长序列。3’RACE PCR这样进 行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用SMART PCR cDNA合成试剂盒(由Clontech制造)根据所述试剂盒附带的生产厂商指导说明书而进行。5’ RACE PCR 这样进行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用第二代5’/3’RACE 试剂盒(由罗氏(Roche)制造)根据所述试剂盒附带的生产厂商指导说明书而进行。
在3，RACE反应中，对目的序列特异的正向引物与SMART PCR cDNA合成试剂盒中 包含的通用引物混合物(UPM)组合使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件，如下在 94°C起始变性10分钟；然后是10个递降-PCR循环，一个循环为94°C 20秒，60°C 20秒，每 个循环降低1°C，和72°C 2分钟；接着是25个PCR循环，一个循环为94°C 20秒，50°C 20秒 和72°C 3分钟；并且接着在72°C 7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和 纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen制造) 中，并且测序。当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进 行嵌套式PCR。被设计成与第一轮PCR产物的内部序列结合的特异性正向引物与作为反向 引物的SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的NUP引物组合用作引物。PCR条件如下在 95°C起始变性10分钟；然后是35个PCR循环，一个循环为95°C 20秒，50°C 20秒，和72°C 3 分钟；接着是72°C 7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目 的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen制造)中，并且测序。在5’ RACE反应中，对目的序列特异的反向引物与作为正向引物的第二代 5，/3，RACE 试剂盒中包含的 01 igo-d (T)-锚定引物 1 (Oligo-d (T)-anchorprimerl)组合 使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件，如下在94°C起始变性10分钟；然后是10个 递降-PCR循环，一个循环为94°C 30秒，58°C 30秒，每个循环降低1°C，和72 °C 2分钟；接 着是25个PCR循环，一个循环为94°C 30秒，48°C 1分钟和72°C 2分钟；并且接着在72°C 7 分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获 得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen制造)中，并且测序。当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进 行嵌套式PCR。被设计成与第一轮PCR产物的内部序列结合的特异性反向引物与作为正 向引物的第二代5’ /3’ RACE试剂盒中包含的PCR锚定引物(anchor primer)组合用作引 物。PCR条件如下在94°C起始变性10分钟；然后是10个PCR循环，一个循环为94°C 15 秒，550C 30秒，和72°C 40秒；接着是25个PCR循环，一个循环为94°C 15秒，55°C 30秒， 和72°C 40秒，每个循环延伸20秒；接着是72°C 7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶 电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由 Invitrogen制造)中，并且测序。上述测序结果显示5’ -端序列和3’ -端序列，其每一端分别编码昆虫胆碱乙酰转 移酶的N-端区域和C-端区域。因此，在多核苷酸B组中所示的多核苷酸可以通过基于已知的昆虫胆碱乙酰转移 酶的氨基酸序列制备引物、通过PCR而获得。包括与多核苷酸B组的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸可以用来应用 杂交方法获得在多核苷酸B组中所示的多核苷酸。本发明中的获得方法包括通过杂交检测所需多核苷酸的步骤，鉴定检测到的所需 多核苷酸的步骤，和回收所鉴定的所需多核苷酸的步骤。各步骤将在下文中具体地解释。
通过杂交检测所需多核苷酸的步骤和鉴定检测到的所需多核苷酸的步骤可以 这样进行，即，通过使用具有与多核苷酸B组的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核 苷酸作为探针，根据例如记述在“分子克隆实验室手册第二版(Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd edition) ”(1989)，冷泉港实验室出版社，“当代分子生物学 方法(Current Protocols InMolecular Biology)，，(1987)，John Wiley 禾口 Sons 公司 ISBN0-471-50338-X等中的方法进行。具体地，例如，将包括与SEQ ID NO 2的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA通 过已知的方法用放射性同位素标记标记或荧光标记，其使用随机引发的DNA标记试剂盒 (Random Primed DNA Labelling Kit，由 Boehringer 制造)、随机引物 DNA 标记试剂盒第 2 版(由TAKARA SHUZO有限公司制造)、ECL直接核酸标记和检测系统(ECL Direct Nucleic AcidLabelling and Ditection System,由安玛西亚生物禾斗学(AmershamBiosciences)制 造)，或Megaprime DNA-标记系统(由安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)制造) 进行标记，并且这可以用作探针。用于杂交的条件的实例包括严谨的条件，并且具体地，实例包括这样的条件，即， 在所述条件下，在65°C在存在6X SSC(0. 9M NaCl, 0. 09M柠檬酸钠)、5XDenhart，s杂交溶 液(0. 1% (w/v)菲克(Ficoll)400，0. 1% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0. 1% BSA),0. 5% (w/v) SDS和100 μ g/ml变性的鲑鱼精子DNA的条件下，或者在含有100 μ g/ml变性的鲑鱼精子 DNA 的 DIG 便易杂交溶液(DIG EASY Hby solution, Boehringer Mamnnheim)中进行孵育， 然后，在室温下在存在1XSSC(0. 15m NaCl,0. 015m柠檬酸钠)和0. 5% SDS的条件下进行 孵育两次，持续15分钟，并且此外，在68°C在存在0. IX SSC (0.015m NaCl, 0. 0015m柠檬酸 钠)和0. 5% SDS的条件下进行孵育持续30分钟。更具体地，例如，可以通过应用包括与多核苷酸B组的核苷酸序列互补的核苷酸 序列的多核苷酸作为模板，使用Megaprime DNA-标记系统(由安玛西亚法玛西亚生物技术 (Amersham Pharmacia Biotech)制造)并且使用在试剂盒中指定的反应溶液，而制备用32P 标记的探针。使用这一探针根据照常规方法进行菌落杂交，在65°C下在存在6XSSC(0. 9M 妝(1，0.0911柠檬酸钠)、5\06111^汁，8杂交溶液(0. 1% (w/v)菲克 400，0. (w/v)聚乙 烯吡咯烷酮，0. BSA)、0. 5% (w/v) SDS和100 μ g/ml变性的鲑鱼精子DNA的条件下，或 者在含有100 μ g/ml变性的鲑鱼精子DNA的DIG便易杂交溶液(DIG EASY Hby solution, Boehringer Mamnnheim)中进行温育，然后，在室温下在存在 1 XSSC(0. 15m NaCl,0. 015m 柠檬酸钠)和0. 5% SDS的条件下进行孵育两次持续15分钟，并且此外，在68°C在存在 0. 1XSSC(0. 015m NaCl，0. 0015m柠檬酸钠)和0. 5% SDS的条件下进行孵育持续30分钟， 由此可以检测(包含菌落的)杂交的多核苷酸。因此，可以通过杂交检测所需的多核苷酸， 并且可以鉴定检测到的所需多核苷酸。对于回收所鉴定的所需 多核苷酸，可以从含有通过前文提及的方法，例如，根据 如在冷泉港实验室出版社的“分子克隆实验室手册第二版”(1989)中所述的碱法的方 法检测并且鉴定的多核苷酸的菌落回收质粒DNA。所回收的所需多核苷酸(质粒DNA)的 核苷酸序列可以通过马克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如，在Maxam， A. M 和 W.Gilbert，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，74，560，1977 等中 所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在Sanger, F.和A. R. Coulson,分子生物学杂志(J. Mol. Biol.) ,94,441,1975, Sanger, F.和 Nicklen 和 A. R. Coulson.，美国国家 科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，74，5463，1977等中所述)进行验证。因此，例 如，可以使用市售的Termo测序酶II染料终止子循环测序试剂盒(由安玛西亚生物科学 (AmershamBiosciences)制造)、染料终止子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系 统(Applied Biosystems)制造)等。
包括多核苷酸B组的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多核苷酸或包括与所述部 分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸可以用来使用PCR获得在多核苷酸B组中所示 的多核苷酸。更具体地，实例包括包含SEQ IDNO :4或5的核苷酸序列的多核苷酸。本发明 中的获得方法包括通过PCR扩增所需的多核苷酸的步骤，鉴定所扩增的所需的多核苷酸的 步骤，和回收所鉴定的所需的多核苷酸的步骤。各步骤将在下文中具体解释。在通过PCR扩增所需的多核苷酸的步骤中，具体地，基于约20bp_约40bp的核苷 酸序列，例如，选自SEQ ID NO 2的核苷酸序列和与SEQ IDNO 2的核苷酸序列互补的序列 的核苷酸序列，从多核苷酸B组的核苷酸序列的部分核苷酸序列或与所述部分核苷酸序列 互补的核苷酸序列设计并且合成的DNA，可以用作引物对。引物对的实例包括一组包含由 SEQ IDNO :4表示的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列的多核苷酸。 例如，通过将市售的PCR试剂盒指定的反应溶液添加到通过前文提及的方法制备的cDNA文 库中而制备PCR反应溶液。反应条件可以变化，这取决于要用的引物组，并且例如，可以应 用下列条件可使用这样的条件，即在所述条件下，在94°C孵育10秒后，重复大约40个循 环，1个循环为94°C 15秒，60°C 15秒，和72°C 3分钟，并且继续在72°C进行孵育3分钟； 可使用这样的条件，即，在所述条件下，在94°C进行孵育2分钟，然后在约8°C进行孵育3分 钟，并且然后重复大约40个循环，1个循环为94°C 30秒，55°C 30秒，和72°C 4分钟；或者 这样的条件，即在所述条件下，进行5-10个循环，1个循环为94°C孵育5秒，然后72°C 4分 钟，并且继续进行约20-40个循环，1个循环为在94°C孵育5秒，然后在70°C 4分钟。在PCR 中，例如，可以使用PfuUltra高保真度聚合酶(由Stratagene制造)，Amplitaq Gold(由 应用生物系统制造)，Takara Heraculase (商标)(由TAKARA SHUZO有限公司制造)，包 含在优势 cDNA PCR 试剂盒(Advantage cDNA PCR Kit)中的 DNA 聚合酶(由 Clonetech 供应)，TaKaRa Ex Taq (由TAKARA SHUZO有限公司制备)，PLATINUMTM PCR超级混合物 (PLATINUMTM PCRSUPER Mix，由东方生命技术(Lifetech Oriental)制造)。通过PCR扩增的所需的多核苷酸的鉴定可以通过琼脂糖凝胶电泳，根据冷泉港实 验室出版社的“分子克隆实验室手册第二版”(1989)中所述的方法测量分子量而进行。另 夕卜，关于所扩增的所需的多核苷酸，使用市售的DNA测序反应试剂盒，例如，染料终止子循 环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统制造)，根据试剂盒附带的手册进行测序反应， 并且使用DNA测序仪3100 (由应用生物系统制造)分析核苷酸，由此，可以读取扩增片段的 核苷酸序列。回收所鉴定的所需的多核苷酸的方法的实例包括根据冷泉港实验室出版社的“分 子克隆实验室手册第二版”(1989)中所述的方法从琼脂糖凝胶纯化，并且回收通过琼脂糖 凝胶电泳鉴定的前文提及的多核苷酸的方法。另外，这样回收的多核苷酸或通过PCR扩增 的所需的多核苷酸可以根据冷泉港实验室出版社的“分子克隆实验室手册第二版”(1989) 和“当代分子生物学方法”(1987)，John Wiley和Sons公司ISBN0-471-50338-X中所述的常规方法克隆到载体中。要用的载体实例包括pUCA119(由TAKARASHUZO有限公司制造)， pTVA118N(由 TAKARA SHUZO 有限公司制造)，pBluescriptll (由 Toyobo 有限公司制造)， PCR2. 1-T0P0(由Invitrogen制造)等。另外，克隆的多核苷酸的核苷酸序列可以通过马 克萨姆吉尔伯特方法(Maxam Gilbert method)(例如，在Maxam，A. M和W. Gilbert，美国 国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，74，560，1977中所述)或桑格方法(Sanger method)(例如，在 Sanger，F.和 A. R. Coulson，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.), 94,441, 1975，Sanger, F. &Nicklen 和 A. R. Coulson.，美国国家科学院学报(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，74，5463，1977中所述)进行验证。因此，例如，可以使用市售的Termo测序酶II染料 终止子循环测序试剂盒(由安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences)制造)、染料终止 子循环测序FS快速反应试剂盒(由应用生物系统(Applied Biosystems)制造)等。另外，具有多核苷酸B组的核苷酸序列的部分核苷酸序列的多核苷酸或具有与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸可以用来获得多核苷酸B组中所示的多 核苷酸，其不但使用PCR方法还使用前文提及的杂交方法。更具体地，实例包括包含由SEQ ID NO :4或5表示的核苷酸序列的多核苷酸。制备包括在B组中所示的氨基酸序列的蛋白的方法的实例包括培养其中引入选 自多核苷酸B组的多核苷酸的转化体并且回收所生产的蛋白的方法。另外，为了制备本文 所用的转化体，其是这样的工作，诸如制备包含这样的多核苷酸的环状多核苷酸，即，在所 述多核苷酸中，选自多核苷酸B组的多核苷酸可操作地与噬菌体启动子连接。该方法将在 下文详细阐述。另外，在使用胆碱乙酰转移酶测定杀虫活性的方法中使用的A组中显示的胆碱乙 酰转移酶可通过类似的方法，使用包括编码胆碱乙酰转移酶的核苷酸序列的多核苷酸制备 和获得。噬菌体启动子意指包含在噬菌体基因组中的基因的启动子。在它们中，用于表达 外源基因的噬菌体启动子的实例包括下列各项的启动子T7RNA聚合酶基因、T3RNA聚合酶 基因和SP6RNA聚合酶基因。在本发明中，“可操作地连接”意指将包含目的基因的多核苷酸连接到包含启动子 序列的多核苷酸的下游，以便目的基因可以在所用的转录系统中进行转录。具体地，例如， 当使用后面描述的T7RNA聚合酶基因的启动子时，包含目的基因的多核苷酸可以连接到 T7RNA聚合酶基因启动子的下游。另外，例如，当使用除T7RNA聚合酶基因启动子之外的启 动子时，还可以将包含目的基因的多核苷酸连接到包含除T7RNA聚合酶基因启动子以外的 启动子序列的多核苷酸的下游。更具体地，例如，当使用利用T7RNA聚合酶基因启动子的质 粒pET41a(+) (Novagen)载体时，可以通过将目的基因连接到位于T7 RNA聚合酶基因启动 子下游的限制酶位点如 NcoI，EcoRV, BamHI，EcoRI，StuI,PstI, SacI，SalI，HindiII，NotI， EagI和Xhol而可操作地连接多核苷酸。在本发明中，“环状多核苷酸”是通过将多核苷酸链的末端结合而成环状的多核苷 酸，并且实例包括除了质粒DNA、杆粒DNA等以外的许多细菌的染色体DNA。质粒DNA是相对低分子量的环状多核苷酸，并且实例包括PET (由Takara Mirus 生物公司制造)和pBluescriptll (由Stratagene制造)，其用于在大肠杆菌(E. coli)中 克隆和表达。其它实例包括 pFastBacl，pFastBac HT A, pFastBac HT B, pFastBac HT C,pFastBac Dual, pBlueBacII (由 Invitrogen ^ijit)， pAcSG2 (由 Pharmingen ^ijit) ，胃 包含杆状病毒表达盒。
杆粒是由BAC (细菌人工染色体)组成的高分子量DNA，所述BAC包含完整的杆状 病毒基因组，例如在DHlOBac 大肠杆菌细胞(invitrogen)中存在的bM0N14272 (136kb)。 杆粒DNA在大肠杆菌细胞中作为大质粒增殖，并且可以包含用于在杆状病毒启动子控制下 表达外源基因的表达盒。在其中将包含编码在B组中所示的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸可操作 地连接到噬菌体启动子上的环状多核苷酸具体地为，例如，含有包括与噬菌体T7 RNA聚合 酶启动子可操作地连接的棉蚜胆碱乙酰转移酶基因的DNA的环状多核苷酸，并且例如，可 以根据下述方法制备并且获得。使用包含根据前文提及的方法克隆的包含棉蚜胆碱乙酰转移酶基因的质粒DNA 作为模板，使用对所述胆碱乙酰转移酶基因特异的添加了 BamHI限制性位点的引物和对所 述胆碱乙酰转移酶特异的添加了 XhoI限制性位点的引物，通过PCR扩增包含所述胆碱乙 酰转移酶基因的DNA片段。将得到的PCR产物用BamHI和XhoI切割，并且将得到的包含 棉蚜胆碱乙酰转移酶基因的约2. 2kbp DNA片段与预先用BamHI和XhoI消化的质粒载体 pET41a(+)(由Novagen制造)连接。以这种方式获得的质粒是含有包括与噬菌体T7RNA聚 合酶启动子可操作性连接的棉蚜胆碱乙酰转移酶基因的DNA片段的环状多核苷酸的一个 实例。类似地，可以通过将编码B组所示的氨基酸序列的核苷酸连接到载体中而制备环 状多核苷酸。在本发明中，“复制起点”是对于自身在宿主细胞中复制所必需的特异性DNA序列。 复制起点的实例包括用于细菌质粒的colEl和Π。转化体是真核细胞或原核细胞，所述细胞已经通过向细胞中引入外源多核苷酸而 被遗传改变。转化体的实例包括通过将用于基因克隆或基因表达的质粒如PET(Novagen) 或pBluescript II (Stratagene)引入到大肠杆菌中而转化的大肠杆菌细胞。另外，将DNA 引入到宿主细胞中的技术的实例包括转化、转染、原生质体融合、脂质转染法、电穿孔等。其中引入编码B组所示的氨基酸序列的多核苷酸的转化体的实例包括转化的大 肠杆菌，在其中引入包含与噬菌体T7 RNA聚合酶启动子可操作地连接的棉蚜胆碱乙酰转移 酶基因的DNA。具体地，所述转化体可以根据下述方法进行制备。转化体可以这样制备，即通过根据在冷泉港实验室出版社的“分子克隆实验室手 册第二版”(1989)中所述的方法，将在BamHI位点和Xho I位点之间插入包含棉蚜胆碱乙 酰转移酶基因的DNA的质粒载体pET41a(+) (Novagen)引入到大肠杆菌细胞中而制备。可 选地，还可以通过根据大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen)附带的手册所述的方 法，通过用前文提及的质粒DNA转化大肠杆菌而制备转化体，在所述质粒DNA中插入了包含 噬菌体T7 RNA聚合酶启动子和棉蚜胆碱乙酰转移酶基因的片段。胆碱乙酰转移酶可以通过培养由前文提及的方法制备的转化体并且回收所生产 的来源于昆虫的胆碱乙酰转移酶而制备。胆碱乙酰转移酶蛋白可以通过重组大肠杆菌表达系统生产。该系统是最常用的 用于高水平生产异源蛋白的原核表达系统。大肠杆菌是已知的遗传和生理学表征最佳的生物体，其易于操作，许多工具是可用的，它能够非常快速地生长，它在廉价的复合物或充分-限定的极限培养基上生长，并且它具有极高的合成异源蛋白的能力。可选地，例如，胆碱乙酰转移酶蛋白可以通过重组杆状病毒/Sf9细胞表达系统生 产。这一系统是最有力和通用的可用真核表达系统之一，并且可以用来表达来自许多不同 来源的异源基因，所述来源包括真菌、植物、细菌和病毒。另外，将通过培养转化体而生产的昆虫来源的胆碱乙酰转移酶通过诸如超声、弗 氏压碎器和Dyno碾碎机的方法进行裂解，并且以包含在细胞粗提物中的形式回收，并且可 通过使用通常在酶纯化中所用的方法诸如离子交换柱层析、反相柱层析、凝胶过滤柱层析 等而获得纯化的蛋白。可选地，当设计来源于昆虫的胆碱乙酰转移酶以具有His-标记的形 式生产时，可以通过特异性识别并且结合His-标记的亲和柱层析快速从细胞粗提物中获 得纯化的蛋白。通过所述方法，可以制备来源于昆虫的胆碱乙酰转移酶。例如，昆虫来源的胆碱乙酰转移酶蛋白可以通过培养用含有与噬菌体T7 RNA聚合 酶启动子可操作地连接的棉蚜胆碱乙酰转移酶基因的DNA片段转化的大肠杆菌细胞，并且 用弗氏压碎器将细胞碾碎，然后用柱层析纯化而制备。更具体地，例如，将通过上述方法制备的重组大肠杆菌在37°C以250rpm旋转培养 过夜，所述重组大肠杆菌含有包含与噬菌体T7 RNA聚合酶启动子可操作地连接的棉蚜胆碱 乙酰转移酶基因的DNA片段。第二天早上，将培养物用含有50mg/L卡那霉素的LB培养基 以1/100稀释，并向所述培养物中加入IPTG至终浓度为101^，在221，60印111培养4天以 在大肠杆菌中产生重组的胆碱乙酰转移酶蛋白。将培养物以7，OOOrpm离心10分钟以收集 大肠杆菌。向收集的大肠杆菌中加入裂解缓冲液(0. IM磷酸钠缓冲液pH7. 6，1片完全无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物(Complete EDTA-free proteaseinhibitor cocktail) (Roch 制 造))并且混悬。此外，使用弗氏压碎器(由ThermoSpectronic制造)根据记述在所附使 用说明书中的方法，将大肠杆菌用l，300psi-l，500psi之间的压力裂解。将弗氏加压的溶 液以14，000印111，21离心60分钟，并且将得到的上清液通过0.45 4111滤器过滤。将样品注 射到用His缓冲液A (0. IM磷酸钠缓冲液pH 7. 6，10%甘油)平衡的HiTrap螯合HP (由安 玛西亚生物科学制造)柱或HisTrapHP (由安玛西亚生物科学制造)柱上。然后，用5个柱 体积的下列缓冲液洗涤柱，在所述缓冲液中，混合95%的His缓冲液A和5%的His缓冲液 B (0. IM磷酸钠缓冲液pH 7.6，500福咪唑，10%甘油)。接下来，用15个柱体积的混合有 90%的His缓冲液A和10%的His缓冲液B的缓冲液洗涤柱。然后，用15个柱体积的混合 有85%的His缓冲液A和15%的His缓冲液B的缓冲液洗涤柱。然后，用15个柱体积的 混合有80 %的His缓冲液A和20 %的His缓冲液B的缓冲液洗涤柱。此后，制备15个柱 体积的混合有60%的His缓冲液A和40%的His缓冲液B的缓冲液并且注射到柱中。汇 集Iml的洗脱级分等分试样，并且用SDS-PAGE分析等分试样，以确定含有115kDa胆碱乙酰 转移酶的级分。这些级分是富含目标胆碱乙酰转移酶的溶液。包含B组中所示的氨基酸序列的昆虫胆碱乙酰转移酶可以用作研究工具。例如， 它可以用作进行诸如测定杀虫能力、筛选具有杀虫能力的化学物质等的研究的研究工具。 另外，例如，在分析作用于胆碱乙酰转移酶的试剂的作用和机制的研究中，胆碱乙酰转移酶 也可以被利用作为研究工具。另外，编码在B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸和具有与它们有互补性的核苷酸序列的多核苷酸，以及编码在B组中所示的氨基酸序列的多核苷酸的部分核苷酸序列， 或具有与所述部分核苷酸序列有互补性的核苷酸序列的多核苷酸，和符合由SEQ ID NO 4 或5表示的核苷酸序列的多核苷酸，可以用作研究工具。例如，它们中的一部分的作用是用 于如上所述的制备胆碱乙酰转移酶的方法中的多核苷酸。另外，部分可以用作重要的研究 工具，用于进行使用PCR获得在多核苷酸B组中所示的多核苷酸，或者使用杂交获得在多核 苷酸B组中所示的多核苷酸，如上文所述。特别地，当实施杀虫剂的筛选时，它们可以用作用于进行筛选的实验的实验工具。 具体地，它们可以用作在测定杀虫能力、筛选具有杀虫能力的化学物质等的实施时进行的 实验的实验工具。 此外，本发明还包括这样的系统，所述系统包括输入、存储和管理测试物质的能力 的数据信息的设备，其中所述能力是调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力(以下，在一 些情形中，称为设备a)，基于所需的标准查询并且检索所述数据信息的设备(以下，在一些 情形中，称为设备b)，和显示并且输出查询和检索的结果的设备(以下，在一些情形中，称 为设备c)(以下，在一些情形中称为本系统)。首先，将解释设备a。设备a意指，当输入关于测试物质具有的调节来源于昆虫的 胆碱乙酰转移酶活性的能力的数据信息之后，存储并且管理所输入的信息，如上文所述。信 息通过输入设备1输入，并且通常在存储设备2中存储。输入设备的实例包括可以输入信 息的设备诸如键盘和鼠标。当完成信息的输入和存储、管理时，步骤前进至下一种设备b。 对于存储、管理所述信息，可以通过使用硬件如计算机、和软件如OS和数据库管理而输入 具有数据结构的信息，并且将所述信息存储到适当的存储装置中，例如计算机可读记录介 质如软盘、光磁盘、CD-ROM、DVD-ROM和硬盘，而有效地存储和管理大量的数据。将解释设备b。设备b是一种通过基于获得需要的结果的标准的设备查询并且检 索所存储和管理的数据信息的设备，如上文所述。对于所述信息，当将用于查询和检索的标 准通过输入设备1输入，并且在通常存储在存储设备2中的信息中选择符合所述标准的信 息时，步骤前进至下一设备c。选择的结果通常存储在存储设备2中，并且可以进一步通过 显示输出设备3显示。将解释设备c。设备c是显示并且输出查询和检索的结果的设备，如上文所述。显 示输出设备3的实例包括显示器、打印机等，并且所述结果可以在计算机的显示装置上显 示，或者可以通过打印在纸上输出。实施例下面将通过实施例的方式更详细地解释本发明，但是本发明不限于这些具体的实 施例。实施例1 (从棉蚜和德国蟑螂提取总RNA)(1)从棉蚜提取总RNA将在盆栽黄瓜的叶片上养殖的一群棉蚜(Aphis gossypii)的成虫和幼虫用小刷 子从叶片表面刮下，并且将630mg得到的群体用研钵和研棒在液氮中压成粉末。从得到的 冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由日本基因(Nippon Gene)制造)根据下述 分离RNA。在将IOml ISOGEN加入到研钵中的冷冻压碎的粉末中后，将所述压碎的粉末保持 在冰上碾磨10分钟。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)制造)。立即 将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟，然后，将得到的混合物在4°C以12，OOOxg 离心15分钟，并且将每个5ml水层转移到两个新管中。在向每一管中加入5ml ISOGEN后， 将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。然后，将得到的混合物在4°C以 12，OOOxg离心15分钟，并且将每个IOml水层分别转移到新的50ml管中。随后，将IOml异 丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制造)加入到各管中，并且将混合物在冰上放置30分 钟。将得到的混合物在4°C以12，OOOxg离心10分钟以沉淀RNA。去除上清后，向剩余物中 加入20ml 70%乙醇。将得到的混合物在4°C以10，OOOxg离心5分钟。去除上清后，将总 RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在Iml市售的不含RNA酶的水(Nacalai Tesque有限公 司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸光度计算)为6. 9mg/ml。(2)从德国蟑螂提取总RNA提供人工培养的德国蟑螂(德 国小蠊(Blatella germanica))的成虫、若虫和卵 囊(oothecae)作为样品。10只雄性成虫和10只雌性成虫(个体，每一只已经去除卵囊) 用作1. Ig的成虫样品，将10只雄性若虫和10只雌性若虫用作1. Og的若虫样品，并且将26 只卵囊用作l.Og的卵囊样品。将这三种样品使用独立的研钵和研棒独立地在液氮中压成 粉末。从每一份得到的冷冻压碎的粉末中使用RNA提取试剂ISOGEN(由日本基因(Nippon Gene)制造)根据下述分离RNA。在将IOml ISOGEN加入到研钵中的冷冻压碎的粉末中 后，将所述压碎的粉末保持在冰上碾磨10分钟。碾磨后，将流体样品用移液管转移到15ml 试管中，并且向其中加入2ml氯仿(由Wako纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)供应)。立即将混合物用力振荡15秒，然后在室温静置3分钟。然后， 将得到的混合物在4°C以12，OOOxg离心15分钟，并且将每5ml水层转移到两个新管中。在 向每一管中加入5ml ISOGEN后，将混合物立即用力振荡15秒，并且然后在室温静置3分钟。 然后，将得到的混合物在4°C以12，OOOxg离心15分钟，并且将每个IOml水层分别转移到新 的50ml管中。随后，将IOml异丙醇(由Wako纯化学工业有限公司制造)加入到各管中， 并且将混合物在冰上放置30分钟。将得到的混合物在4°C以12，OOOxg离心10分钟以沉淀 RNA。去除上清后，向剩余物中加入20ml 70%乙醇。将得到的混合物在4°C以10，OOOxg离 心5分钟。去除上清后，将总RNA的沉淀稍微干燥，并且然后溶解在Iml市售的不含RNA酶 的水(Nacalai Tesque公司)中。制备的总RNA的浓度(从在260nm的吸光度计算)在来 源于成虫的总RNA的情况下为1. lmg/ml，在来源于若虫的总RNA的情况下为2. 5mg/ml，并 且在来源于卵囊的总RNA的情况下为1. 4mg/ml。实施例2 (分离棉蚜胆碱乙酰转移酶基因)使用来自棉蚜的总RNA，用于RT-PCR的随机引物(Invitrogen)禾Π Superscript III (Invitrogen)，根据Superscript III的生产厂商的方法而制备第一链cDNA。通过使用包含核苷酸序列SEQ ID NO :4的寡核苷酸和包含核苷酸序列SEQ ID N0:5的寡核苷酸(它们为对所述基因特异的引物)，和Pfu UltraHF Taq聚合酶(由 Stratagene制造)根据生产厂商的方法进行PCR而扩增棉蚜胆碱乙酰转移酶的全长cDNA。 将如上述制备的第一链cDNA用作模板。PCR条件如下起始变性在94°C 5分钟；然后是35 个PCR循环，一个循环为94°C 20秒，53°C 20秒，和72°C 3分钟；接着在72°C 10分钟。得 到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen制造)中，并且测序以确定SEQID NO 3中显示的 2360bp的核苷酸序列。基于该序列，编码棉蚜胆碱乙酰转移酶的ORF被鉴定为具有SEQ ID NO :2中显示的22Ilbp的核苷酸序列。从SEQ ID NO 3的核苷酸序列推定的氨基酸序列为 SEQ ID NO 1的氨基酸序列。实施例3 (分离德国蟑螂胆碱乙酰转移酶基因) 为了从其它昆虫物种如德国蟑螂(德国小蠊(Blatella germanica))分离胆碱乙 酰转移酶基因的同源物，应用Codehop程序(在由Fred Hutchinson癌症研究中心内运行 的 Blocks 蛋白质分析月艮务器(Blocks Protein AnalysisServer)的网站 http://blocks. fhcrc. org/blocks/codehop. html上可公共地获得)，并且基于前文提及的棉蚜胆碱乙酰 转移酶的氨基酸序列和先前已知的来自诸如黑腹果蝇(NCBI登记号P07668)，秀丽线虫 (P32756)和冈比亚按蚊(XP_312586)的氨基酸序列，设计简并引物。选择的昆虫物种的胆碱乙酰转移酶基因的同源物的部分序列通过一系列PCR扩 ±曾，所述PCR使用来源于昆虫物种的第一链cDNA作为模板。在此处，所述作为模板的第一链 cDNA通过前文提及的方法使用SuperscriptIII制备。PCR扩增使用作为正向引物和反向 引物的一组简并引物以及Amplitaq Gold(由应用生物系统(Applied Biosystems)制造) 根据所述试剂附带的生产厂商的方法而进行。PCR条件为进行递降PCR的那些条件，如下 在94°C起始变性10分钟；然后是10个递降-PCR循环，一个循环为94°C 30秒，60°C 1分 钟，每个循环降低1°C，和72 °C 1分30秒；接着是25个PCR循环，一个循环为94 °C 30秒， 50 0C 1分钟和72 °C 1分30秒；并且接着在72 °C 7分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行 分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen 制造)中，并且测序。因此，获得德国小蠊胆碱乙酰转移酶基因的部分序列。然后，设计对所得到的胆碱乙酰转移酶基因的昆虫同源物的部分序列特异的引 物，并且进行3’RACE PCR或5’RACE PCR，以获得所述基因的全长序列。3’RACE PCR这样进 行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用SMART PCR cDNA合成试剂 盒(由Clontech制造)根据所述试剂盒附带的生产厂商指导说明书而进行。5’ RACE PCR 这样进行，即，应用从昆虫总RNA制备的第一链cDNA作为模板，并且使用第二代5’/3’RACE 试剂盒(由罗氏(Roche)制造)根据所述试剂盒附带的生产厂商指导说明书而进行。在3，RACE反应中，对目的序列特异的正向引物与SMART PCR cDNA合成试剂盒中 包含的通用引物混合物(UPM)组合使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件，如下在 94°C起始变性10分钟；然后是10个递降-PCR循环，一个循环为94°C 20秒，60°C 20秒，每 个循环降低1°C，和72°C 2分钟；接着是25个PCR循环，一个循环为94°C 20秒，50°C 20秒 和72°C 3分钟；并且接着在72°C 7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和 纯化，以获得目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen制造) 中，并且测序。当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进 行嵌套式PCR。被设计成与第一轮PCR产物的内部序列结合的特异性正向引物与作为反向 引物的SMART PCR cDNA合成试剂盒中包含的NUP引物组合用作引物。PCR条件如下在 95°C起始变性10分钟；然后是35个PCR循环，一个循环为95°C 20秒，50°C 20秒，和72°C 3分钟；接着是72°C 7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目 的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen制造)中，并且测序。在5’ RACE反应中，对目的序列特异的反向引物与作为正向引物的第二代 5，/3，RACE 试剂盒中包含的 01 igo-d (T)-锚定引物 1 (Oligo-d (T)-anchorprimerl)组合 使用。PCR条件为进行递降PCR的那些条件，如下在94°C起始变性10分钟；然后是10个 递降-PCR循环，一个循环为94 °C 30秒，58°C 30秒，每个循环降低1°C，和72 °C 2分钟；接 着是25个PCR循环，一个循环为94°C 30秒，48°C 1分钟和72°C 2分钟；并且接着在72°C 7 分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得目的DNA。此外，将获 得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen制造)中，并且测序。当通过第一轮PCR没有获得明显的扩增产物时，使用第一轮PCR产物作为模板进 行嵌套式PCR。被设计成与第一轮PCR产物的内部序列结合的特异性反向引物与作为正向 引物的第二代5’ /3’ RACE试剂盒中包含的PCR锚定引物组合用作引物。PCR条件如下在 94°C起始变性10分钟；然后是10个PCR循环，一个循环为94°C 15秒，55°C 30秒，和72°C 40 秒；接着是25个PCR循环，一个循环为94°C 15秒，55°C 30秒，和72°C 40秒，每个循环延伸 20秒；接着是72°C 7分钟。得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析和纯化，以获得 目的DNA。此外，将获得的DNA克隆到pCR4-T0P0载体(由Invitrogen制造)中，并且测 序。上述测序结果显示5’ -端序列和3’ -端序列，各自分别编码昆虫胆碱乙酰转移酶 的N-端区域和C-端区域。实施例4 (构建重组质粒)使用作为对基因特异的引物的包括SEQ ID NO 4的核苷酸序列的寡核苷酸，和作 为对基因特异的引物的包括SEQ ID NO :5的核苷酸序列的寡核苷酸；和Pfu Ultra HF Taq 聚合酶(由Stratagene制造)，根据生产厂商的使用说明书的方法，通过PCR扩增胆碱乙酰 转移酶基因片段，该片段将被克隆到用于在大肠杆菌中表达的载体中。将在实施例2中获 得的cDNA用作模板。所用的PCR条件如下在94°C起始变性5分钟；然后是35个PCR循 环，一个循环为94°C 20秒，53°C 20秒，和72°C 3分钟；然后72°C 10分钟。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(由Qiagen制造)根据试剂盒附带的使用说明书 纯化所得到的PCR产物。将纯化后的DNA片段用Bam HI和XhoI消化，因为SEQ ID NO 4 的寡核苷酸含有Bam HI限制性位点，SEQ ID NO 5的寡核苷酸含有Xho I限制性位点。棉蚜胆碱乙酰转移酶基因的Bam HI/XhoI DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，分 离，纯化并且连接到大肠杆菌表达载体pET41a(+)(由Novagen制造)的Bam HI/XhoI克隆 位点。所得到的载体称为PGBJ005。重组胆碱乙酰转移酶与两个His-标记和一个GST-标记一起翻译提供一种1021 个氨基酸的重组蛋白。在Qiagen质粒纯化手册中所述的步骤后，使用Qiafliter质粒Maxipr印(Qiagen) 制备 PGBJ005。 实施例5 (制备重组大肠杆菌) 按照生产厂商的使用说明书，使用1 μ 1浓度为 Ing/ μ 1的pGBJ005转化大肠杆菌 BL21(DE3)(由Invitrogen制造)的感受态细胞。转化的大肠杆菌克隆在含有50mg/L卡那霉素(由西格玛(Sigma)制造)的LB琼脂平板上在37°C生长过夜。实施例6 (在大肠杆菌中表达胆碱乙酰转移酶)将用pGBJ005转化的大肠杆菌BL21 (DE3)在含有50mg/L卡那霉素(由西格玛制造)的LB-培养基中在37°C，250rpm旋转培养过夜。第二天早上，将培养物用含有50mg/ L卡那霉素的LB培养基以1/100稀释，并向所述培养物中加入IPTG至终浓度为ΙΟμΜ，在 22°C，60rpm生长4天以在大肠杆菌中产生重组的胆碱乙酰转移酶蛋白。将所述培养物以 7，OOOrpm离心10分钟，以收集大肠杆菌。弃掉上清，并且将剩余的大肠杆菌在液氮中快速 冷冻，并且保存在-80°C备用。实施例7 (纯化胆碱乙酰转移酶)将棉蚜胆碱乙酰转移酶克隆在pET41a(+)中，pET41a(+)的阅读框中具有N-端 GST (谷胱甘肽S-转移酶)-标记和His-标记和C-端His-标记。重组的胆碱乙酰转移酶 蛋白使用His-标记纯化。(1)制备粗提物将冷冻的诱导的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的细胞沉淀物重悬在30ml裂解缓 冲液(0. IM磷酸钠缓冲液pH 7. 6，1片完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail) (Roch 制造))中，并且随后使用弗氏压碎器 (由Thermo Spectronic制造)在裂解缓冲液中裂解。在破碎细胞的步骤期间，压力保持 在1300-1500psi。将弗氏加压的溶液在2°C以14，OOOxg离心60分钟，以收集上清液。将 收集的上清液通过0. 45 μ m过滤器过滤并且保存在冰上。(2)使用His-标记纯化使用金属亲和层析，使用HiTrap螯合HP (安玛西亚生物科学)或HisTrap HP (安 玛西亚生物科学)柱，按照生产厂商(安玛西亚生物科学)的使用说明书，纯化重组蛋白。 对于大规模纯化，使用XK-16/20柱(安玛西亚生物科学)，该柱用螯合快速流动琼脂糖(安 玛西亚生物科学)填充。纯化步骤在AEKTA-FPLC(安玛西亚生物科学)上进行。已经根据生产厂商的试验方案(安玛西亚生物科学)制备了 Hitrap，HisTrap, AX-16/20亲和柱(安玛西亚生物科学)。缓冲液A，即结合缓冲液，由0. IM磷酸钠缓冲液 PH 7.6和10%甘油制成。缓冲液B，即洗脱缓冲液，由0. IM磷酸盐缓冲液pH 7.6，500mM咪 唑，和10%甘油制成。使用His-标记纯化棉蚜胆碱乙酰转移酶根据下述步骤进行⑴样品注射；(ii)用5个柱体积(CV)的95%缓冲液A/5%缓冲液B (25mM咪唑)洗掉未结合的 样品；(iii)用15个CV的90%缓冲液A/10%缓冲液B (50mM咪唑)洗涤；(iv)用15个CV的85%缓冲液A/15%缓冲液B (75mM咪唑)洗涤；(ν)用15个CV的80%缓冲液A/20%缓冲液B (IOOmM咪唑)洗涤；(vi)用15个CV的60%缓冲液A/40%缓冲液B (200mM咪唑)洗脱纯化的蛋白；和(vii)用5个CV 100%缓冲液B(500mM咪唑)洗涤柱。汇集通过用60%缓冲液A/40%缓冲液B洗脱获得的级分，并且保存在冰上。分析所得到的洗脱级分，以验证重组的棉蚜胆碱乙酰转移酶蛋白的存在。使用8%的聚丙烯酰胺凝胶用于所表达的115kDa胆碱乙酰转移酶蛋白的最优化凝胶电泳分辨。
将下述染色液和脱色液用于聚丙烯酰胺凝胶的考马斯染色。染色液由lg/Ι考马 斯亮蓝R，50 (ν/ν) %甲醇，12 (ν/ν) %乙酸和38 (ν/ν) %蒸馏水制成。混合后，过滤溶液，以 去除未溶解的亮蓝R染料。脱色液由25 (ν/ν) %甲醇，10 (ν/ν) %乙酸和65 (ν/ν) %蒸馏水 制成。对于蛋白质印迹分析，将1 500稀释的抗-His(H15)sC-803兔多克隆IgG抗体 (tebubio)用作一抗。二抗是以1 10000稀释的山羊-抗-兔-HRP(Pierce)。在通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析聚丙烯酰胺凝胶后，汇集目的级分，并且确定 蛋白浓度。蛋白浓度通过Bradford方法确定，使用预先稀释的蛋白测定标准物(Pierce) 牛血清白蛋白级分V系列，用Bradford Bio-Rad蛋白测定法(Bio-Rad)，按照生产厂商的 方案进行。然后，将汇集的级分分成几个等分试样，并且立即在液氮中快速冷冻，并且保存 在-80"C。实施例8 (选择抑制胆碱乙酰转移酶活性的化合物)调节胆碱乙酰转移酶活性的化合物的选择在用于测量并且评价胆碱乙酰转移酶 的活性的系统中进行，所述活性通过将测试化合物添加到使用在实施例7中制备的棉蚜胆 碱乙酰转移酶的体外反应系统中而被调节。至于棉蚜胆碱乙酰转移酶活性的测量，在使用乙酰辅酶A和胆碱作为底物的胆碱 乙酰转移酶的酶促反应后，使用5，5’ - 二硫代-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)试剂测量由胆 碱乙酰转移酶反应形成的游离辅酶A。DTNB与溶液中游离的巯基反应以产生5-硫代-2-硝 基苯甲酸(TNB)。TNB是黄色的，并且在412nm处具有最大吸光度。比色测量产生的TNB以 计算胆碱乙酰转移酶活性。为了测量该活性，当包含溶解在DMSO中的测试化合物至10 μ M的终浓度时，测量 蚜虫胆碱乙酰转移酶的活性。另外，当包含DMSO代替测试化合物时，测量蚜虫胆碱乙酰转 移酶的活性。然后，计算包含溶解在DMSO中的测试化合物时蚜虫胆碱乙酰转移酶活性的测 定值相对于在包含DMSO代替所述测试化合物时蚜虫胆碱乙酰转移酶活性的测定值的比率 (%),并且将通过从100%减去所计算的值而得到的值用作抑制程度(％ )。各测试化合物 中的结果与实施例9的结果一起显示在实施例9中的表4中。当包含溶解在DMSO中的测试化合物至100 μ Μ，30 μ Μ，10 μ Μ，3 μ Μ，1 μ Μ，0. 3 μ Μ， 0. ΙμΜ或0.03 μΜ中的各个浓度的终浓度时，测量蚜虫胆碱乙酰转移酶的活性。使用浓 度-依赖性检测分析软件XL fit(由idbs制造)，从各测试化合物在各浓度的结果计算 IC50 ( μ M)。结果与实施例9的结果一起显示在实施例10的表5中。实施例9 (杀虫活性检测)制备具有下述组成(表3)的无菌人工饲料。然后，根据与在昆虫饲养手册 (Handbook of Insect Rearing)第 1卷(Elsevier 科学出版社 1985)第 35-36 页中所述的 方法相同的方法，不同之处在于将溶解在DMSO中至终浓度50ppM的测试化合物以该人工饲 料的0. 5%体积加入，并且混和各成分，饲养棉蚜。饲养后6天，研究存活的棉蚜数目，并且 通过用下述方程获得控制值而将表现出显著控制值(例如，30%或更大的控制值)的实体 确定为具有杀虫活性控制值(%) = {1- (Cb X Tai) / (Cai X Tb)} X 100
在所述方程中的字母表示下述含义Cb 在未处理部分中在处理之前存活的蠕虫数目Cai 在未处理部分中在观察时存活的蠕虫数目Tb 在处理的部分中在处理之前存活的蠕虫数目Tai 在处理的部分中在观察时存活的蠕虫数目结果与实施例8的结果一起显示在实施例9中的表4中。表3 表 4 实施例10 (杀虫活性检测)根据与实施例9的方法相同的方式，进行杀虫活性检测，并且结果与实施例8的结 果一起显示在实施例10中的表5中。表5 工业应用性根据本发明，能够提供靶向性更强的筛选农业化学品的方法，由此针对特定目标 筛选化合物，目的在于化学性地干扰目标位点以控制昆虫或其它害虫生物体。序列表中的自由文本(free text)SEQ ID NO 4设计的PCR寡核苷酸引物SEQ ID NO 5设计的PCR寡核苷酸引物
权利要求
一种测定测试物质的杀虫活性的方法，包括(1)测量反应系统中选自下面A组中的胆碱乙酰转移酶的活性的第一步骤，在所述反应系统中所述胆碱乙酰转移酶与测试物质接触；以及(2)基于通过比较在所述第一步骤中测量的活性与对照的活性而获得的差值，评价所述测试物质的杀虫活性的第二步骤<A组>(a)包括SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白；(b)包括SEQ ID NO1的氨基酸序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(c)包括与SEQ ID NO1的氨基酸序列具有50％或更高的序列同一性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(d)包括与SEQ ID NO1的氨基酸序列具有75％或更高的序列相似性的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(e)包括由SEQ ID NO2或3的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白；(f)包括由与SEQ ID NO2或3的核苷酸序列具有50％或更多的序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(g)包括由多核苷酸编码的氨基酸序列的蛋白，其中所述多核苷酸在严谨的条件下与包括与SEQ ID NO2或3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并且其中所述蛋白具有胆碱乙酰转移酶活性；(h)包括昆虫胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的蛋白；以及(i)包括棉蚜胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的蛋白。
2.一种筛选杀虫物质的方法，包括选择具有由权利要求1所述的方法评价的所述杀虫 活性的物质。
3.—种杀虫剂，包括通过权利要求2所述的方法选择的物质或其农业上可接受的盐作 为活性成分。
4.一种调节害虫的生理状况的试剂，其中所述试剂具有调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活 性的能力。
5.根据权利要求4所述的试剂，其中所述胆碱乙酰转移酶是棉蚜胆碱乙酰转移酶。
6.根据权利要求4所述的试剂，其中所述试剂是杀虫剂。
7.根据权利要求4所述的试剂，其中所述调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力是抑 制所述昆虫胆碱乙酰转移酶与乙酰辅酶A和胆碱的反应的能力。
8.—种杀虫剂，包括具有调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力的物质或所述物质的 农业上可接受的盐作为活性成分。
9.根据权利要求8所述的杀虫剂，其中所述物质具有抑制所述昆虫胆碱乙酰转移酶与 乙酰辅酶A和胆碱的反应的能力。
10.根据权利要求9所述的杀虫剂，其中所述物质具有在无细胞系统中抑制所述昆虫 胆碱乙酰转移酶与乙酰辅酶A和胆碱的反应的能力，其中在10 μ M或更多的所述物质的存 在下，所述胆碱乙酰转移酶的活性低于不存在所述物质时的活性。
11.根据权利要求9所述的杀虫剂，其中所述物质具有在无细胞系统中以ΙΟΟμΜ或更小的IC5tl抑制所述昆虫胆碱乙酰转移酶与乙酰辅酶A和胆碱的反应的能力。
12.—种控制害虫的方法，包括向害虫、所述害虫的栖息地或要保护免受所述害虫伤害 的植物施用有效量的权利要求3、8、9、10或11所述的杀虫剂。
13.—种控制害虫的方法，包括鉴定具有由权利要求1所述的方法评价的所述杀虫活性的物质，以及 将所述害虫与所述鉴定的杀虫物质接触。
14.一种昆虫胆碱乙酰转移酶，包括选自下列B组的氨基酸序列 〈B组〉(a)SEQ ID NO 1的氨基酸序列；(b)SEQID NO :1的氨基酸序列中缺失、添加或置换一个或多个氨基酸的氨基酸序列， 其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(c)与SEQID NO :1的氨基酸序列具有50%或更高的序列同一性的氨基酸序列，其中 所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(d)与SEQID NO :1的氨基酸序列具有75%或更高的序列相似性的氨基酸序列，其中 所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(e)由SEQID NO :2或3的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(f)由与SEQID NO :2或3的核苷酸序列具有50%或更多的序列同一性的核苷酸序列 编码的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有胆碱乙酰转移酶活性；(g)由多核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述多核苷酸在严谨的条件下与包括与SEQ ID NO :2或3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，其中所述氨基酸序列具有 胆碱乙酰转移酶活性；和(h)棉蚜胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列。
15.昆虫胆碱乙酰转移酶作为提供评价杀虫活性的指标的试剂的应用。
16.权利要求14所述的昆虫胆碱乙酰转移酶作为提供评价杀虫活性的指标的试剂的应用。
17.一种多核苷酸，包括编码权利要求14所述的胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的核苷 酸序列。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸，包括SEQID NO :2或3的核苷酸序列。
19.一种多核苷酸，包括与权利要17或18所述的多核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸 序列。
20.一种多核苷酸，包括权利要求17或18所述的多核苷酸的部分核苷酸序列；或 与所述部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的多核苷酸，包括SEQID NO :4或5的核苷酸序列。
22.—种获得包括编码胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方 法，包括使用权利要求20或21所述的多核苷酸作为引物，通过聚合酶链式反应扩增所需多核 苷酸；鉴定扩增的所需多核苷酸；以及回收所述鉴定的多核苷酸。
23.一种获得包括编码胆碱乙酰转移酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方 法，包括使用权利要求19、20或21所述的多核苷酸作为探针，通过杂交检测所需多核苷酸； 鉴定检测到的所需多核苷酸；以及 回收所述鉴定的多核苷酸。
24.一种环状多核苷酸，包括权利要求17或18所述的多核苷酸的核苷酸序列，其中所 述核苷酸序列可操作地连接于噬菌体启动子。
25.根据权利要求24所述的环状多核苷酸，其中所述启动子为T7RNA聚合酶基因启动子。
26.根据权利要求24或25所述的环状多核苷酸，其中所述多核苷酸包括用于在宿主细 胞中自主复制的复制起点。
27.—种产生环状多核苷酸的方法，包括将权利要求17或18所述的多核苷酸连接到载 体中。
28.一种转化体，其中导入了权利要求17或18所述的多核苷酸。
29.根据权利要求28所述的转化体，其中所述转化体是转化的大肠杆菌(E.coli)。
30.一种产生转化体的方法，包括将权利要求17或18所述的多核苷酸导入至宿主细胞中。
31.一种产生胆碱乙酰转移酶的方法，包括培养权利要求28或29所述的转化体以及回 收产生的胆碱乙酰转移酶的步骤。
32.权利要求14所述的胆碱乙酰转移酶或权利要求17-21中任意一项所述的多核苷酸 作为研究工具的应用。
33.根据权利要求32所述的应用，其中所述研究工具是用于筛选杀虫物质的实验工具。
34.一种系统，包括输入、储存和管理关于测试物质的能力的数据信息的装置，其中所述的能力是调节昆 虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力；基于所需的标准查询和检索所述数据信息的装置；和显示和输出查询和检索的结果的装置。
全文摘要
本发明提供了一种调节害虫的生理状况的试剂，其中所述试剂具有调节昆虫胆碱乙酰转移酶的活性的能力；一种测定测试物质的杀虫活性的方法，该方法包括测量反应系统中胆碱乙酰转移酶的活性，在该反应系统中胆碱乙酰转移酶与被测物质接触，等等。
文档编号G01N33/50GK101868725SQ20088011684
公开日2010年10月20日 申请日期2008年11月21日 优先权日2007年11月22日
发明者伯特·德梅, 大槻纯子, 安内利斯·罗布罗卡, 盖伊·尼斯, 马克·范·德·克雷恩 申请人:住友化学株式会社