专利名称：用于检测生物靶点的快速和灵敏的方法
技术领域：
本发明涉及检测生物样品中的至少一种生物标志。因此，本发明还提供检测给定样品中的多种(例如两种、三种)生物标志，因此其提供获得数据的方法，所述数据(例如)为诊断信息、生物标志的相关表达、蛋白、基因、或一种或多种蛋白和一种或多种基因的组合的组(panel)的数据。作为例子(但非限制性的)，例如可在癌症诊断分析(例如乳腺癌分析)中同时筛选HER2蛋白和HER2基因。另一个非限制性例子包括(例如)筛选三种标志以检测子宫癌。标志可包括Ki67/mib-1和细胞增殖标志p16(INK4a)、以及诸如蛋白或核酸之类的用于人乳头瘤病毒的标志。然而另一个非限制性例子包括筛选与前列腺癌有关的多个标志。这些标志可包括AMACR P504S、聚合物量细胞角蛋白(HMW-CK)、和p63。筛选标志的这种组合提供了一种从恶性前列腺肿瘤中区别良性前列腺肿瘤的方法。
例如在检测多种标志时需要使交联剂之间的交叉反应性最小化。这可通过在检测步骤中使用不同探针和不同报道分子来实现。这种体系的例子示于图3中，其中使用下列步骤来检测两种不同生物标志，例如两种不同细胞受体 (1)孵育样品和第一探针1(1P1)(例如HRP偶联的抗体AB1)； (2)在存在交联剂(例如DAB)的条件下孵育样品(1)和报道子1(R1)(例如阿魏酸-PNA1偶联物)； (3)孵育样品(2)和过氧化氢(＞3％v/v)； (4)孵育样品(3)和第一探针2(1P2)(例如HRP-偶联的抗体AB2)； (5)孵育样品(4)和报道子2(R2)(例如阿魏酸-PNA2偶联物)； (6)孵育样品(5)和第二探针1(2P1)(例如PNA1’-FITC)以及第二探针2(2P2)(例如PNA2’-德克萨斯红)。
结果，从R1沉积的靶位点中检测到绿色荧光信号(从PNA1’-FITC发出)，从R2沉积的靶位点中检测到红色荧光信号(从PNA2’-德克萨斯红发出)，并且从R1和R2沉积的靶位点(即同时存在靶A1和A2的位点)中检测到黄色荧光信号。
该方法的所有步骤(从(a)至(c))可在2-20分钟内完成。这种快速检测可有利地用于自动或半自动检测靶生物标志。自动染色装置是本领域中已知的，并且该方法可适用于这些装置。
自动染色装置可用在本发明的多种实施方式中，例如用于检测多种生物标志。检测多种生物标志通常需要从不同可检测物质中发出的信号的平衡。自动步骤可包括多个将从靶生物标志中发出的信号放大的步骤。当检测多种标志时这是特别有利的。
抗体探针 术语“探针”是指可与靶特异性结合的物质，其中靶可以是生物标志、另外探针、报道子、或任何与所述生物标志、另外探针或报道子有关的分子。
在一个实施方式中，探针为抗体探针。
在本文中使用的抗体是指免疫球蛋白或其一部分，其包括任何包含抗原结合位点的多肽，而不论其来源、制备方法和其他特性如何。该术语包括(例如)多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂交、变异和CDR移植的抗体。一部分抗体可包括任何仍能够结合抗原的片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv。抗体来源通过基因组序列来限定，而不论制备方法如何。
本文中使用的第一抗体是指与生物样品内存在的目标生物标志特异性结合的抗体。在某些实施方式中，第一抗体可聚合。第一抗体可衍生自任何温血种类，例如哺乳动物、鸟。
本文中使用的第二抗体是指具有这样的抗原结合域的抗体，所述抗原结合域与第一探针(例如第一抗体)、或沉积在靶位点中的半抗原、或者直接或间接与第一探针连接的半抗原特异性结合。
本文中使用的第三抗体是指具有这样的抗原结合域的抗体，所述抗原结合域与第二探针(例如第二抗体)、或与第二探针连接的半抗原、或与偶联至第二探针的聚合物连接的半抗原、或沉积在靶位点中的半抗原特异性结合。
有时抗体可同时起到第二抗体和第三抗体的作用。
本发明中使用的抗体(包括第一抗体、第二抗体和第三抗体)可衍生自任何哺乳动物种类，例如小鼠、大鼠、山羊、豚鼠、驴、兔、马、羊驼(lama)、骆驼、或任何鸟类种类(例如鸡、鸭)。本文中使用的衍生自任何哺乳动物或鸟类种类是指编码特定抗体的至少一部分核酸序列源自特定哺乳动物(例如小鼠、大鼠、山羊、或兔)或特定鸟类(例如鸡、鸭)的基因组序列。抗体可以是任何同型，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、或任何亚类，例如IgG1、lgG2、lgG3、lgG4。
在某些实施方式中，第一抗体含有可与生物样品包含的细胞表达的生物标志特异性结合的抗原结合区域。所述标志可表达在细胞表面上，或在细胞膜内(即在细胞的内部，例如在细胞质内、在细胞核内、在内质网内)。在一些实施方式中，生物标志选自细胞，因此存在于溶液中，例如在细胞培养基中、在血液或血浆中。
在某些实施方式中，第二抗体含有与第一抗体特异性结合的抗原结合区域，例如第一抗体的恒定区域。在某些实施方式中，第二抗体与聚合物偶联。在一些实施方式中，聚合物与2-20种第二抗体偶联。在其他实施方式中，聚合物与2-10种第二抗体偶联。
在某些实施方式中，第三抗体含有与第二抗体特异性结合的抗原结合区域，例如第二抗体的恒定区域、或与第二抗体连接的半抗原、或与第二抗体偶联的聚合物。在某些实施方式中，第三抗体与聚合物偶联。在一些实施方式中，聚合物与1-20种第三抗体偶联。在其他实施方式中，聚合物与1-5种第三抗体偶联。
本发明的方法和组合物中可使用的抗体包括单克隆和多克隆抗体、工程化抗体，包括使用噬菌体展示技术或可选择的技术制备的嵌合、CDR移植和人工选择的抗体。
已经公开了多种制备抗体的技术，例如参见Kohler和Milstein，(1975)Nature 256495、Harlow和Lane，Antibodiesa Laboratory Manual，(1988)(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)，其通过引用的方式并入本文。制备重组抗体分子的技术在上述参考文献中有所公开，此外还在(例如)EP 0623679、EP 0368684和EP 0436597中有所公开。
可以以重组或合成的方式来制备抗体。编码抗体的核酸可分离自cDNA库。编码抗体的核酸可分离自噬菌体库(例如参见McCafferty et al.1990，Nature 348552，Kang et al.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884363、EP 0 589877 B1)。编码抗体的核酸可通过已知序列的基因改组来获得(Mark et al.1992，Bio/Technol.10779)。编码抗体的核酸可通过体内重组来分离(Waterhouse et al.1993，Nucl.Acid Res.212265)。本发明的方法和组合物中使用的抗体包括人源化免疫球蛋白(美国专利No.5,585,089，Jones et al.1986，Nature 332323)。
所述抗体可以是包含效应子蛋白(例如毒素或标记(例如可检测物质))的改变抗体。
抗体可得自动物血清，或在单克隆抗体或其片段的情况下在细胞培养基中制得。根据建立的方法，重组DNA技术可用于在细菌、酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞培养基中制备抗体。在某些实施方式中，选择的细胞培养基体系优选分泌抗体产物。
核酸探针 在另一个实施方式中，第一探针可以是或包含核酸或核酸类似物分子(例如DNA分子、RNA分子、PNA分子)以用在原位杂交中。核酸探针可以化学合成，或在细胞中重组制备(例如参见Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press)。在一些实施方式中，探针包含肽核酸(PNA)。肽核酸为核酸分子，其中通常存在于DNA和RNA中的脱氧核糖或核糖骨架被肽骨架取代。制备PNA的方法是本领域已知的(例如参见Nielson，2001，Current Opinion inBiotechnology 1216)(通过引用的方式并入本文)。在其他实施方式中，探针包含锁核酸(LNA)(Sorenson et al.2003，Chem.Commun.7(17)2130)。在一些实施方式中，核酸探针与生物标志(例如生物样品中所含的核酸分子)特异性结合。
在特定实施方式中，核酸探针至少包含与生物样品中的靶序列(例如核酸序列(例如基因组DNA序列或mRNA序列))在特定严格条件下特异性杂交的序列。在本文中使用的术语“在特定严格条件下杂交”旨在描述在彼此显著互补的核苷酸序列保持彼此结合的情况下杂交和洗涤的条件。该条件为使得至少70％、至少80％、至少85-90％互补的序列保持彼此结合。互补百分率按照下列文献所述来测定Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402(通过引用的方式并入本文)。
具体的严格条件是本领域已知的，并且可在下列文献中找到CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(Ausubel et al.1995eds.)，第2、4和6章(通过引用的方式并入本文)。另外，具体的严格条件在下列文献中有所描述Sambrook et al.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Press，第7、9和11节(通过引用的方式并入本文)。在一些实施方式中，杂交条件为高度严格条件。高度严格杂交条件的例子为在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在65-70℃下杂交或在4X SSC和50％甲醛中在42-50℃下杂交，然后在1X SSC中在65-70℃下进行一次或多次洗涤。应理解另外试剂可加入杂交和/或洗涤缓冲液中，例如封闭剂(BSA或鲑鱼精子DNA)、去污剂(SDS)、螯合剂(EDTA)、Ficoll、PVP等。
在一些实施方式中，核酸探针与样品中的靶序列在中度严格条件下杂交。本文中使用的中度严格杂交条件包括本领域普通技术人员基于(例如)DNA的长度可以容易地确定的条件。示例性条件在下列文献中有所阐述Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(通过引用的方式并入本文)，并且包括使用预洗涤液(5X SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0))，杂交条件为50％的甲醛、6X SSC、在42℃下(或其他类似的杂交溶液，例如在50％甲醛中的Stark’s溶液、在42℃下)，洗涤条件为60℃、0.5X SSC、0.1％SDS。
在一些实施方式中，核酸探针与样品中的靶序列在低度严格条件下杂交。本文中使用的低度严格杂交条件可包括本领域普通技术人员基于(例如)DNA的长度可以容易地确定的条件。低度严格杂交条件可包括(例如)在40℃下、在含有35％甲酰胺、5x SSC、50mM Tris-HCI(pH 7.5)、5mMEDTA、0.1％PVP、0.1％Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中预处理DNA6小时。在相同溶液中进行杂交，不同之处在于进行下列改变0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA、10％(wt/vol)硫酸葡聚糖，并使用5-20x106 CPM探针。将样品在杂交混合物中在40℃下孵育18-20小时，然后在55℃下在含有2x SSC、25mMTris-HCI(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中洗涤1.5小时。将洗涤液用新鲜溶液取代，并在60℃下另外孵育1.5小时。
探针的其他实施方式包括肽序列，例如所述肽序列衍生自不同蛋白的蛋白或核酸结合域、不同细胞和细胞核受体以及它们的衍生物的配体、可与大的生物分子的某些结构单元特异性结合的小分子，然而这仅仅列出了可用作本发明的目的的探针的物质的非限制性例子。
实施例 1.本发明的报道子和交联剂分子的实施例 缩写 MBHA 4-甲基二苯甲基胺 NMPN-甲基吡咯烷酮 HATU 2-(1h-7-叠氮苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐； 甜菜碱 DIPEA 二异丙基乙胺 DCM二氯甲烷 TFA三氟乙酸 TFMSA 三氟甲基磺酸 Fer阿魏酸 FLU荧光素 Tyr酪氨酸 Lys赖氨酸 Dex葡聚糖 HPLC 高效液相色谱法 equi. 当量 1.1.Fer-L30-Lys(Flu)-NH2(D17158) 使用Fmoc-Lys(ivDDE)来卸载MBHA树脂至负载量为150微摩尔/g。使用在NMP中的20％的哌啶使200mg树脂去Fmoc化，并用Boc-L30-OH(1.5mL，在NMP中0.26M，使用0.9当量的HATU、2当量的DIPEA预活化2分钟)进行一次20分钟的偶联。使用NMP中的5％的肼来除去ivDDE基团，用羧基荧光素(Flu)(1.5mL，在NMP中0.2M，使用0.9当量的HATU、2当量的DIPEA预活化2分钟)标记赖氨酸侧链2x20分钟。使用在NMP、NMP、DCM、然后DCM中20％的哌啶处理树脂。使用TFA∶TFMSA∶间甲酚(7∶2∶1，1.5ml，1小时)将中间产物H-L30-Lys(Flu)-NH2从树脂上分开，使用二乙基醚沉淀，重新悬浮在TFA，使用二乙基醚沉淀，重新悬浮在NMP，再次使用二乙基醚沉淀。使用100微升DIPEA将其制成碱性，并直接溶解在用0.9当量的HATU和2当量的DIPEA预活化的0.5mL 0.3M的阿魏酸中。在25分钟后，将粗产物用二乙基醚沉淀，并溶解在450微升NMP和50微升乙二胺中。在5分钟后，将产物用二乙基醚沉淀，并溶解在水中的15％乙腈(8mL)中，使用100微升TFA进行酸化，并进行RP-HPLC纯化。
1.2.Fer-L150-Lys(Flu)-NH2(D17157) 使用Boc-Lys(Fmoc)来卸载MBHA树脂至负载量为100微摩尔/g。用Boc-L30-OH对100mg树脂进行5次偶联循环(a.如1中那样使用Boc-L30-OH进行偶联。b.使用在NMP∶吡啶1∶1中2％的乙酸酐封端2分钟。c.使用在TFA中的5％的间甲酚去Boc化2x5分钟)。将赖氨酸侧链去Fmoc化，并如1中那样使用羧基荧光素标记。将中间产物H-L150-Lys(Flu)-NH2从树脂上分开，并用阿魏酸标记N末端，然后如1.1那样进行纯化。
1.3.βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16127) 使用标准固相化学法(如1.1和1.2)在0.5g的MBHA树脂上制备Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)。使用在NMP中的20％的哌啶从赖氨酸侧链中除去Fmoc基团，然后使化合物进行重复的羧基荧光素标记(3x30分钟)。在使用TFA除去Boc基团后，在固相上使用β-丙氨酸-N，N-二乙酸(βα)叔丁基酯标记N末端。在从树脂上分开并进行HPLC纯化后，分离βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2。
1.4.H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(D16126) 制备Boc-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-L90Lys(Fmoc)树脂，并使用1.3中所述的方法利用荧光素来标记。在除去Boc基团后，使用N-Boc-S(4-甲氧基苄基)-Cys-OH来标记N末端。将化合物从柱上分开，并通过HPLC纯化。
分子1.1、1.2、1.3和1.4为包含荧光素残基的报道子的非限制性实施方式。
1.5.Fer-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2(D17128) 将Boc-Lys(Fmoc)(2个循环)、Boc-L30-OH(5个循环)和Boc-Lys(2CIZ)-OH依次偶联至MBHA树脂。在存在10％的茴香硫醚清除剂的条件下将中间产物从树脂分开，从而除去2CIZ基团。如1.1那样使用阿魏酸标记N末端和5个脱保护的赖氨酸侧链(2x30分钟)。然后在纯化之前使用在NMP中的10％的乙二胺除去C末端赖氨酸残基中的N上的Fmoc基团。
1.6.Fer-(Lys(Fer)-L30)5-Lys(NH-βα((L90-Lys(Flu))3-NH2)-NH2(D17134) 将500nmol的βα-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(化合物1.4)溶解在88微升NMP和2微升吡啶中，并通过与10微升二异丙基碳二亚胺反应10分钟来转化成环状酸酐。将该酸酐用二乙基醚沉淀，然后将小球溶解在包含250nmol的Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2的100微升NMP中。在20分钟后，加入5微升乙二胺，在5分钟后将产物用二乙基醚沉淀，酸化，然后进行HPLC纯化。
1.7.Ac-(Tyr(OH)-L30)6-L90-Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-Lys(Flu)-NH2(D18044) 在MBHA树脂上制备Ac-(Tyr(2BrZ)-L30)6-L90-Lys(Fmoc)-L90-Lys(Fmoc)-Lys(Fmoc)。在固相上除去Fmoc基团，并且使用羧基荧光素来标记赖氨酸侧链。在从树脂上分开后，将产物进行HPLC纯化。
1.8. Fer-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L60-Lys(Fer)-Lys(Fer)-L30Lys(NH2)-NH2(D17140) 在MBHA树脂上制备Boc-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L60-Lys(2CIZ)-Lys(2CIZ)-L30-Lys(Fmoc)。在从树脂上分开后，通过沉淀来分离中间产物H-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L60-Lys(NH2)-Lys(NH2)-L30-Lys(Fmoc)，并如1.1那样用阿魏酸标记。通过HPLC来分离最终产物。
例子1.5.-1.8.是具有下式的交联剂分子的例子 (R1)n-(X)q-R2(m)， 其中 R1和R2为不同的HRP的底物部分(例如Fer或Tyr)， X为具有下式的连接分子
其中R3和R4为Lys的残基，并且m、n和q为1至6。
具有荧光素、阿魏酸(1.6)和/或酪氨酸(1.7)的数个残基的线性聚合物交联剂(例如上述分子1.6.和1.7.)也是可在存在另外交联剂(例如DAB)的条件下被HRP沉积的报道子的实施方式。当HRP酶部分与不容易在(例如)细胞核(例如DNA)中受到影响或暴露的靶位点结合时，这种线性、相对低分子量(MW＜15kDa)的交联剂/报道子可以是特别有用的。当过氧化物酶部分位于更容易受到影响的靶位点中时，可使用大的报道分子，例如含有与数十和数百个标记(例如Flu和/或Fer和/或Tyr)偶联的葡聚糖分子(例如下述分子1.9.)的报道子。
1.9.与交联剂1.5.和交联剂1.4.偶联的Dex70(D17130) 使10nmol的葡聚糖(MW 70kDa，用二乙烯基砜活化)与500nmol的Fer-(Fer-L30)5-Lys(NH2)-NH2(化合物1.5)在总体积300微升的0.16M的NaHCO3(pH9.5)中在40℃下反应30分钟。在观察到少量沉淀后，进一步加入100微升的水，并使反应进行另外30分钟。进一步加入200微升的0.15M的NaHCO3和500nmol的H-Cys-L90-Lys(Flu)-L90Lys(Flu)-L90-Lys(Flu)-NH2(化合物1.4)。在40℃下1小时后，通过加入50微升的0.165M的半胱氨酸使反应混合物淬火30分钟，将溶液过滤，将产物通过FPLC在superdex200上用在含有10mM CHES、pH 9.0和0.1M NaCl的水溶液中的20％EtOH进行纯化。洗脱产物为包含约56个荧光素和113个阿魏酸残基的葡聚糖偶联物。
1.10.山羊-抗-小鼠-Dex70-HRP(D18033) 将葡聚糖(70kDA MW)用13.7nmol的二乙烯基砜活化，并在600微升缓冲液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和602nmol HRP在30℃下反应3小时。然后加入在105微升水中的41.1nmol的山羊-抗-小鼠F(ab)2抗体，继续反应另外16小时。通过加入70微升的0.165M的半胱氨酸来使反应混合物淬火30分钟，将产物在superdex 200上在100mM NaCl、10mM HEPES(pH 7.2)中纯化。洗脱产物为包含山羊-抗-小鼠(GaM)和HRP的葡聚糖偶联物(dex∶GaM∶HRP的比＝1∶1∶1)。
1.11.抗-FITC-Dex70-HRP(D18058) 将葡聚糖(70kDA MW)用10nmol的二乙烯基砜活化，并在400微升缓冲液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和440nmol的HRP在30℃下反应3小时。然后，加入在80微升水中的30nmol的抗-小鼠F(ab)2抗体，在40℃下继续反应另外90分钟。通过加入50微升的0.165M的半胱氨酸来使反应混合物淬火30分钟，将产物在superdex 200上在100mM NaCl、10mM HEPES(pH 7.2)中纯化。洗脱产物为具有抗-FITC和HRP的葡聚糖偶联物(dex/抗-FITC/HRP比＝1/2/9)。
1.12.抗-FITC-Dex70-HRP(D17030) 将葡聚糖(70kDA MW)用10nmol的二乙烯基砜活化，并在374微升缓冲液(100mM NaCl、25mM NaHCO3、pH 9.5)中和440nmol HRP以及25nmol F(ab)2抗-FITC在30℃下反应16。通过加入50微升的0.165M的半胱氨酸来使反应混合物淬火30分钟，将产物在superdex 200上在100mMNaCl、10mM HEPES(pH7.2)中纯化。洗脱产物为包含抗-FITC和HRP的葡聚糖偶联物(比为1∶1∶1)。
分子1.10、1.11和1.12表示可用作检测沉积的报道分子的探针的抗体-葡聚糖-HRP偶联物的实施方式。偶联物1.10.还可用作检测与沉积的报道子结合的探针的另外的探针(例如上述在检测靶位点中的标志的方法中的步骤(b)中)。
3.使用本发明的方法进行IHC染色的实施例 在福尔马林固定、石蜡嵌入的扁桃体上进行IHC。将3-5个微切片切削、烘烤并储存在4℃下直到使用为止。然后通过二甲苯(2x5分钟)、99％乙醇(2x2分钟)、70％乙醇(2x2分钟)、并最终通过水来除去石蜡。将玻片置于靶修复溶液(pH 9)(DAKO S2367)中，然后在微波炉中加热(沸腾10分钟)。此后，使玻片冷却，然后转移至洗涤缓冲液(DAKO S3006)。该步骤后面是使用3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性5分钟的步骤，然后再次将玻片转移至洗涤缓冲液中，然后进行染色。为了使玻片与玻片之间差异最小化，在相同日子使用连续切片进行各种比较试验。使用从0至4的评分等级来对具体和背景信号进行评分，其中0表示根本没有染色，1表示较弱程度染色，2表示中等程度染色，3表示较强程度染色，4表示过度染色。
IHC试验1. 将细胞角蛋白、山羊-抗-小鼠-HRP和抗-FITC-HRP分别稀释在BCPT-缓冲液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。将报道子D17128和DAB(DAKO K5007C)稀释在DAB的底物缓冲液(DAKO K5007 B)中。所有孵育持续5分钟，接着在DAKO洗涤缓冲液中洗涤2分钟，除了在孵育后使用D17128的情况以外，在该情况中在10mM CHES(pH 9)+0.1％Tween20中进行洗涤。下表和描述概括了试验的实施方式 玻片1-标准DAB-HRP染色(没有放大)。标准DAB DAKO试剂(K7005C)含有3mM DAB。
玻片4-在存在1mM DAB-GaM-HRP偶联物D18033(与玻片1相比其稀释25倍)的条件下沉积报道子D17128-一步放大。
玻片7和玻片9-与玻片1相比进一步稀释GaM-HRP偶联物D18033，并且进行另外的报道子沉积步骤。
玻片1、4和7都具体染色评分为2.5至3。由于在存在DAB的条件下沉积报道子D17128、接着通过抗-FITC-HRP探针D17030来识别该报道子，因此获得放大250倍的信号(与玻片1相比的玻片9)。玻片7和9的明显染色保持鲜明(即非扩散的)，其中染色和未染色区域之间的强烈边界表明在沉积位点发生非常少的扩散。
IHC试验2. 将细胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP都稀释在BCPT-缓冲液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。将D17128和DAB(DAKO K5007 C)稀释在DAB的底物缓冲液(DAKO K5007 B)中。所有孵育持续5分钟，接着在DAKO S3006中洗涤2分钟，除了在孵育后使用D17128的情况以外，在该情况中在10mMCHES(pH 9)+0.1％Tween20中进行洗涤。
下表和描述概括了试验的实施方式 玻片12和14强烈和特异性地染色(评分都为2)，而玻片9未被染色(评分为0)。结果表明在没有交联剂(例如DAB(玻片14)或D17140(玻片12))的情况下HRP不会引起报道子沉淀。
试验进一步示出减少预孵育(10分钟)第一抗体和第二抗体-HRP偶联物的步骤次数的可能性。
IHC试验3. 将细胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP分别稀释在BCPT-缓冲液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。将D17128和DAB(DAKO K5007C)稀释在DAB的底物缓冲液(DAKO K5007B)中。所有孵育持续5分钟，接着在DAKO S3006中洗涤2分钟，除了在孵育后使用D17128和D18044的情况以外，在该情况中在10mM CHES(pH 9)+0.1％Tween20中进行洗涤。当具有DAB的玻片(玻片3和5)在底物缓冲液中进行第三孵育步骤时，孵育时间为1分钟。
下表和描述概括了试验的实施方式 玻片2是染色密度最高的玻片(评分3)，这表明第三步骤的对于玻片3(评分2，5)特别施加1分钟的DAB不是很大改善，而是相当轻微降低染色密度。在缺乏交联剂的条件下对于缺乏对于玻片4(评分0)的染色符合IHC试验2(上述)中获得的结果。在玻片5(其中在施加报道子偶联物D17128之前施加DAB)上观察到染色(评分2)，尽管这些染色不如玻片3上的染色那样密度高。
该结果表明在孵育具有报道子和交联剂的玻片(即预孵育步骤)之前可以首先在单独步骤施加交联剂。所观察到的在沉积标记的报道子前施加DAB的另一种积极作用是明显降低背景染色(玻片2评分为0.5-1，玻片3评分为0)，尽管特定信号强度并没有降低太多。在许多情况下通过在沉积前1分钟的额外DAB步骤，实质上消除了与山羊-抗-小鼠-HRP偶联物的非特异性结合有关的特别弱的扩散背景染色。
IHC试验4. 将细胞角蛋白、GaM-HRP和抗-FITC-HRP全部稀释在BCPT-缓冲液(2％BSA、0.2％酪蛋白、2％PEG、0.1％Tween20、0.1M NaCL、10mM HEPES、pH 7.2)中。将D17128、D18044和DAB(DAKO K5007C)稀释在DAB的底物缓冲液(DAKO K5007B)中。所有孵育持续5分钟，接着在DAKO S3006中洗涤2分钟，除了在孵育后使用D17128和D18044的情况以外，在该情况中在10mM CHES(pH9)+0.1％Tween20中进行洗涤。
下表和描述概括了试验的实施方式 该试验示出了交联剂浓度对于两种不同类型的报道子沉积的影响。玻片9是染色浓度最高的玻片(评分4)。以稀释度1∶150将作为交联剂的DAB(1mM)施加在玻片9上。DAB的更高(1∶50(3mM)，玻片8)或更低(1∶500(30mM)，玻片10)浓度产生密度稍低的染色(评分3.5)。和DAB的预孵育的背景降低效果也是可见的；6个玻片(上表)中没有一个具有明显的背景染色。
低分子量报道子(例如上述报道子18044)在较低浓度的DAB(玻片13；评分3)下被更好地沉积，随着DAB浓度的增加(玻片12，评分2.5；玻片11，评分2)，染色密度降低。
该试验还示出为了获得相同或甚至更好的染色结果，与包含相同但更少的过氧化物酶的底物部分的小的报道分子(例如D 18044，t 5μM)相比，可以使用更少量的包含多个过氧化物酶的底物部分的大的报道分子(例如荧光素-阿魏酸葡聚糖偶联物D17128，50nM)。
4.使用本发明的方法放大核酸探针信号的实施例 通过在Chromogen溶液和信号增强溶液中使用和不使用DAB来试验样品，可以示出DAB的沉淀效果。通过进一步稀释探针、抗体或通过省略第二过氧化物酶-封闭步骤，可以获得本发明信号放大的进一步解释。
组织福尔马林-固定石蜡嵌入的扁桃体。
荧光素标记的探针靶向于染色体11的着丝粒。
在实施例中使用下列溶液 抗原修复/预处理(Dako K 5599) 洗涤缓冲液1(Dako K5331) 洗涤缓冲液2(Dako S 3006) 胃蛋白酶RTU(Dako K 5331) 严格的洗涤缓冲液(Dako K 5331) R-a-Fitc/HRP，F(ab)(Dako P 5100) 抗体稀释液(Dako S 2022) 探针(Dako Y 5505) 过氧化物酶-封闭液(Dako S 2023) 核快红(Dako S1968) Chromogen缓冲液(Dako K5007) 杂交剂(Dako S2451)被用于杂交探针。
Chromogen溶液和信号增强溶液的制备 溶液A 将102.5mg的5-氨基-2-(3-[5-氨基-1，3-二氢-3，3-二甲基-1-(4磺基丁基)-2H吲哚-2-亚基]-1-丙烯基]-3，3二甲基-1-(4磺基丁基)-3H-吲哚鎓三氟乙酸盐溶解在4,525mL的丙二醇/水(8∶2)中。
溶液B 将59,6mg的3，3’-二氨基盐酸联苯胺溶解在5,96mL的丙二醇/水(8∶2)中。加入13,7μL 12M的盐酸。
溶液C 按照1mL A∶9mL B的比混合溶液A和溶液B。
Chromogen溶液 为了染色，将这些储存液稀释成试剂盒(得自Dakocytomation code#K5007)的chromogen缓冲液。
将1mL的溶液C与19mL的Chromogen缓冲液混合。
溶液D 将1mL的溶液B用499mL的Chromogen缓冲液稀释。
信号增强溶液 其为在20％的乙醇中的D1734、0,1M NaCl、10mM CHES(pH 9,0)的溶液，用溶液D稀释至Fer-L30-FITC浓度为250nM或50nM。在溶液中没有DAB的情况下，直接在Chromogen缓冲液中进行稀释。
组织染色过程 将人扁桃体组织玻片去石蜡化、洗涤并在微波炉中进行10分钟的抗原修复。在另一次洗涤后，在37℃下进行胃蛋白酶处理，洗涤，使玻片脱水并和PNA探针孵育。在85℃下使样品变性5分钟后，将探针在45℃下杂交1小时。将玻片在65℃下严格洗涤10分钟。将过氧化物酶封闭3分钟，将玻片洗涤并和兔-抗-FITC/HRP(以1∶20稀释)孵育。在30分钟后，将玻片洗涤并和信号增强溶液孵育。在30分钟后，将玻片洗涤，并将过氧化物酶封闭3分钟，再次洗涤，将玻片和兔-抗-FITC/HRP(以1/20稀释)孵育。在30分钟后，将玻片洗涤并和Chromogen溶液孵育。在使用水洗涤后，将玻片用核快红复染，洗涤和设置。
试验建立和染色结果示于下表中
玻片1为示出探针需要获得信号的对照。
玻片2示出在信号增强溶液中没有交联剂，无法获得特定信号。
玻片3示出向信号增强溶液中加入交联剂(DAB)导致高的信号放大。这仅是chromogen溶液中没有DAB的玻片。
玻片4示出向chromogen溶液中加入交联剂进一步增强了信号(与玻片3相比)。
玻片6示出通过增加信号增强剂(D17134)的浓度，可以在没有交联剂的情况下获得弱的信号。然而，加入交联剂导致该信号更强的放大(如玻片5所示)。
权利要求
1.一种在靶位点沉积报道子的方法，所述方法包括在包含报道子和交联剂的介质中孵育靶位点，其中所述靶位点具有过氧化物酶活性，其中所述报道子为可检测分子，以及其中所述交联剂是包含至少两个过氧化物酶的底物部分的分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述过氧化物酶活性与所述靶位点中存在的至少一个过氧化物酶部分有关。
3.权利要求2所述的方法，其中所述过氧化物酶选自辣根过氧化物酶(HRP)或大豆过氧化物酶(SP)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述交联剂为具有下式的分子
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2为过氧化物酶的底物的部分，
X为连接基团或化学键，以及
m、n和q为1至10的整数。
5.根据权利要求4所述的方法，其中
R1和R2为邻苯二胺的部分，
X为共价键，以及
m、n和q为1。
6.根据权利要求4所述的方法，其中
R1和R2为阿魏酸的部分，
X为具有下式的连接基团
其中R3和R4为氨基酸赖氨酸的残基，和
m和n为2至10的整数，
以及q为1至10的整数。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述交联剂在所述介质中的存在量为约10-5至约10-2M。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述报道子为包含骨架聚合物和至少一种可检测物质的分子，其中所述至少一种可检测物质通过化学键或通过连接基团与所述骨架聚合物相连。
9.根据权利要求9所述的方法，其中所述报道子包含至少两种相同或至少两种不同的可检测物质。
10.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述可检测物质选自荧光标记、发光标记、生物发光标记、放射性标记或显色标记、酶、酶的底物、半抗原或特异性结合对的成分。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述报道子是小分子。
12.根据权利要求12所述的方法，其中所述小分子选自荧光或显色物质、半抗原、特异性结合对的成分或酶的底物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶位点包含生物标志。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述介质包含过氧化物化合物。
15.一种具有下式的化合物
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2为过氧化物酶的底物的部分，
X为连接基团，以及
m、n和q为1至10的整数。
16.根据权利要求16所述的化合物，其中
R1和R2为阿魏酸的部分，
X为具有下式的连接基团
其中R3和R4为氨基酸赖氨酸的残基，和
m和n为2至10的整数，
以及q为1至10的整数。
17.一种水缓冲化介质，包含
(i)能够在存在过氧化物酶活性的条件下使至少两种报道分子交联的化合物，其中所述化合物为包含至少两个过氧化物酶的底物部分的分子，并且其中所述两种报道分子为可检测分子，以及
(ii)过氧化物化合物，
所述介质的pH为约4至约9。
18.根据权利要求17所述的介质，其中所述能够在存在过氧化物酶活性的条件下使至少两种报道分子交联的化合物为具有下式的分子
(R1)n-(X)q-R2(m)，
其中
R1和R2为过氧化物酶的底物的部分，
X为连接基团或化学键，以及
m、n和q为1至10的整数。
19.根据权利要求18所述的介质，其中所述化合物为二氨基联苯胺。
20.根据权利要求18所述的介质，其中所述化合物为权利要求15或16中所限定的化合物。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的介质，其中所述介质中所述化合物的量为约10-5至约10-2M。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的介质，其中所述介质中所述过氧化物化合物的量为约10-4至约10-2M。
23.根据权利要求22所述的介质，包含0-20％的有机改性剂和0-2M的有机盐或无机盐。
24.根据权利要求23所述的介质，还包含过氧化物酶活性增强剂。
25.根据权利要求23或24所述的介质，还包含铁螯合剂。
26.根据权利要求23、24或25任一项所述的介质，还包含去污剂。
27.根据权利要求17所述的介质，其中所述报道子为包含骨架聚合物和至少一种可检测物质的分子，所述至少一种可检测物质通过化学键或通过连接基团与所述骨架聚合物相连，其中所述至少一种可检测物质选自荧光标记、发光标记、生物发光标记、放射性标记或显色标记、酶、酶的底物、半抗原或特异性结合对的成分，或其中所述报道分子为选自荧光或显色物质、半抗原、特异性结合对的成分或酶的底物的小分子。
28.一种体外检测生物样品中的生物标志的方法，包括下列步骤
d)将推测包含生物标志的生物样品与一种或多种探针进行孵育，其中所述一种或多种探针中的至少一种包含辣根过氧化物酶(HRP)的至少一个部分，从而所述生物标志与包含HRP至少一个部分的至少一种探针形成络合物；
e)在包含报道子和交联剂的介质中孵育样品，所述样品含有步骤(a)的所述生物标志与包含HRP至少一个部分的至少一种探针形成的络合物，从而使所述报道子沉积在存在步骤(a)的络合物的位点中；
f)检测(b)的所述沉积的报道子，从而检测所述生物标志。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物标志为选自蛋白、核酸、脂质、碳水化合物中的生物分子，或者为包含两种或多种所述生物分子或其衍生物的分子络合物或聚合物，或者为细胞状结构。
30.根据权利要求24所述的方法，其中所述探针为特异性结合对的成分，或为包含特异性结合对的成分的偶联物，其中所述特异性结合对的成分能够与所述生物标志特异性结合。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述探针选自核酸、核酸类似物、肽或蛋白。
32.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(b)的所述孵育介质为权利要求18至23中任一项所限定的介质，其中所述介质还包含报道子。
33.根据权利要求24或28所述的方法，其中孵育步骤(b)包括至少如下两个步骤
(iii)在根据权利要求22或23所述的介质中孵育所述样品；然后
(iv)在包含报道子的根据权利要求22或23所述的介质中孵育所述样品。
34.根据权利要求24、28或29任一项所述的方法，其中所述报道子如权利要求9至13中任一项所限定。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述步骤(i)和(ii)重复进行。
36.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(c)包括下列步骤将所述样品和能够与所述沉积的报道子特异性结合的物质进行孵育。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述物质被可检测地标记。
38.根据前述权利要求24至33中任一项所述的方法，其中所述方法在2至20分钟内进行。
39.根据权利要求24至34中任一项所述的方法，其中所述方法用于生物标志的自动、半自动或人工检测。
全文摘要
本发明涉及通过自由基链式反应发生的生物标记方法。由于可检测的报道分子从包含含有至少两个过氧化物酶的底物部分的物质(本文中称为“交联剂”)的介质中沉积到包含过氧化物酶活性和生物标志的靶位点中，因此发生标记。本文中所述的标记反应可通常用于检测试验方案(其用于检测并使生物或化学靶可视化)的宿主中的靶，所述试验方案包括免疫组织化学法(IHC)，原位杂交法(ISH)例如ELISA、DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法的抗体基染色法，和其他方法。
文档编号G01N33/58GK101836117SQ200880112656
公开日2010年9月15日 申请日期2008年9月16日 优先权日2007年9月18日
发明者J·洛泽, K·H·彼得森 申请人:丹麦达科有限公司