以PA_C-PB1_N复合物为靶点的抗流感病毒抑制剂的高通量筛选方法

专利名称：以PA_C-PB1_N复合物为靶点的抗流感病毒抑制剂的高通量筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种抗流感病毒物质的筛选方法及其应用，具体通过酶联免疫吸附和高通量药物筛选的体系，以禽流感病毒PA亚基C端(PA。片段)-PBl亚基N端(PBIn片段)复合物为底物对中药提取物进行抗流感病毒的活性筛选，并由此得到具有活性的中药提取物丁香、老鹤草、血见愁或余甘子等。
背景技术：
流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的一种常见的急性呼吸道传染病，以冬春季多见，临床以高热、乏力、头痛、全身酸痛等全身中毒症状重而呼吸道其它症状较轻为特征。流感病毒属正粘病毒科，可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，易发生大范围流行。近年来，由属于甲型病毒的H5N1亚型禽流感病毒导致的禽类与人的疫情的广泛传播对人类健康造成了全球性的重大威胁，最近，墨西哥爆发了甲型HlNl流感并传播到全球数十个国家，进一步加剧了这种威胁。由于流感病毒的高速变异和进化，使得传统的疫苗很难对未来的流感疫情具有针对性，并且流感病毒本身也不断对目前已有的药物产生抗药性，因此开发新型抗流感药物已成为各国极为迫切的重大课题。目前，针对流感的疫苗和药物主要针对的是流感病毒包膜上的HA受体、NA神经氨酸酶、M2离子通道，而这些蛋白由于突变较快，能很快产生抗性。相比之下，作为流感病毒RNA聚合酶三元复合物的PA、PB I和PB2亚基，由于一方面在流感病毒基因组转录和复制过程中具有非常重要的生物学功能，其中PB I亚基具有聚合酶和核酸内切酶活性，PB2亚基负责帽结合，PA亚基涉及RNA复制和蛋白水解活性，PBl能与PB2或PA形成二元复合物，但PB2和PA则无法形成复合物，所述复合物均在流感病毒基因组转录和复制中起重要作用；另一方面在整体氨基酸序列尤其是活性位点处具有高度的保守性。因此使得上述亚基尤其是PA亚基成为一个非常理想的新型药物设计和筛选的靶标。2008年下半年以来，生物物理所刘迎芳研究院课题组和饶子和院士领导团队联合解析了禽流感病毒(A/goose/Guangdong/l/1996(H5Nl))PA 亚基 C 端(PA。片段)-PBl 亚基N端(PBIn片段)复合物和以及PA亚基N端(PAn片段)两个部分的晶体结构，并对其功能也做了相应的研究。禽流感病毒的PA。片段与PBl亚基的N端25个氨基酸被证明具有很强的特异性相互作用，能够在体外形成非常稳定的二元复合物(参见图1)，这对于RNA聚合酶三元复合体的顺利组装并且发挥聚合酶活性具有重要意义。同时，也有文献报道在细胞内单独表达的PB IN端25个氨基酸的小肽能有效抑制禽流感病毒在细胞内的复制，这说明PA。是与PBl相互作用的主要部位。如果能够用小分子将PA。片段中负责与PBl结合的口袋部位屏蔽，将会有效阻止RNA聚合酶三元复合物的组装，从而直接抑制了禽流感病毒在宿主细胞内的转录和复制。因此，本发明根据PA。片段的这一性质，以阻断PA。片段-PBIn复合物的形成作为本发明药物筛选的直接对象和目标之一。
天然产物又称次级代谢产物(Secondary Metabolites),具有结构的多样性和生物活性的多样性。天然产物及其衍生物在以往的疾病治疗中发挥了无可限量的作用，也是当今药物研发过程中最具潜力的资源之一。现在对中药等传统药物、海洋生物以及微生物代谢过程中的天然产物研究方兴未艾，每年都会有大量结构新颖的化合物被发现提供出来，这些新颖化合物是合成方法所无法实现的药物和药物先导化合物的重要源泉，在新药和先导化合物的发现中起着重要作用。传统中药是本发明中华民族几千年来在治疗各种疾病过程中积累的宝贵的知识财富，很多常见的疾病在中医理论中都有针对的药方存在；同时，中药中存在的天然生物活性小分子的种类和数目是极其庞大的，本身也是一个非常丰富的小分子药物库，其中有非常多的小分子是传统的化工合成所不能合成的。因此，使用天然产物提取物如中药提取物作为本发明药物筛选的平台，具有传统的药物筛选平台所不具有优点，同时也有利于发展我国的中药事业，赋予其更加科学的理论基础。酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)是将酶催化作用的高效性与抗原抗体反应的特异性相结合的一种微量分析技术。酶免疫测定包括酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA),其可用于测定可溶性抗原或抗体。由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用，包括用于多种细菌和病毒等疾病的诊断，用于鉴定涉及生物过程重要物质的调节物如CN 101076602A中所公开的内容。基于突光的热量变化体系(Thermal shift assay):这是一种常用的筛选革巴蛋白抑制剂的方法。利用对环境敏感的荧光粉来控制蛋白热量的释放(unfolding)，比较靶蛋白的抑制剂存在和不存在时引起的ATm(转移温度)的变化来评估抑制剂的活性。以ΒΑ0Ε1(β位点淀粉前体物蛋白剪切酶I)抑制剂的筛选为例说明这种技术手段的大概流程(图例参见附图2)。首先这种筛选体系要在Biorad PCR 96孔板中进行，这种体系包括一个用于精确控制温度的加热和降温装置，以及一个用于荧光图形呈现的装置CCD(电荷耦合器材)。然后向96孔板中加入20 μ 1，I μΜ BACEl ;50 μ I荧光粉；10 μ 1，10，50，或ΙΟΟμΜ浓度的化合物；20μ I BACEl缓冲液(各种物质的量和比例在不同实验中可以不同)。在25到89°C的温度变化范围内检测荧光的信号。最后对获得的数据进行处理，一般来说，ATm(转移温度)变化越大的表明化合物与蛋白结合的能力越强，抑制效果越明显。现有的技术方案主要参考文献:Me1-Chu Lo, Ann Aulabaugh, Guixian Jin, etal.Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification indrug discovery.Analytical Biochemistry 2004(332):153-159.

发明内容
本发明提供一种抗流感病毒化合物或提取物的筛选方法。本发明的另一个目的是提供一种利用酶联免疫吸附反应和高通量筛选相结合筛选具有抗流感病毒化合物或提取物的方法。本发明提供一种利用酶联免疫吸附反应和高通量筛选相结合筛选具有抗禽流感病毒化合物或提取物的方法。本发明提供一种利用禽流感病毒(A/goose/Guangdong/l/1996(H5Nl))PA亚基C端(PA。片段)-PBl亚基N端(PBIn片段)复合物筛选化合物或提取物的方法。
本发明提供一种通过酶联免疫吸附反应和高通量筛选相结合，以禽流感病毒(A/goose/Guangdong/1/1996 (H5N1)) PA 亚基 C 端(PA。片段)-PBl 亚基 N 端(PBIn 片段)复合物为底物筛选化合物或提取物的方法。本发明提供一种具有抗流感病毒，具体为禽流感病毒的中药提取物的筛选方法，其通过酶联免疫吸附反应和高通量筛选相结合，以禽流感病毒(A/goose/Guangdong/1/1996 (H5N1)) PA亚基C端(PAc片段)-PBl亚基N端(PBIn片段)复合物为底物筛选得到。本发明提供一种具有抗流感病毒，具体为禽流感病毒的中药提取物，包括丁香提取物、老鹤草提取物、血见愁提取物或余甘子提取物。本发明提供一种通过酶联免疫吸附反应和高通量筛选相结合，以禽流感病毒(A/goose/Guangdong/l/1996(H5Nl))PA 亚基 C 端(PA。片段)-PBl 亚基 N 端(PB In 片段)复合物为底物筛选得到的天然产物在制备治疗和/或预防流感病毒药物中的应用。本发明提供一种治疗和/或预防流感病毒的药物组合物，该药物组合物包括由上述筛选方法筛选得到的抗流感病毒物质，抗流感病毒物质优选中药提取物，所述中药选自丁香、老鹤草、血见愁或余甘子。本发明所述中药提取物均来自于西安小草中药库，购买于西安小草植物科技有限公司，取自茎叶，提取的主要步骤分为三步:首先，根据药材质地适当粉碎，加入95%乙醇提取两次，药渣加50%乙醇提取两次，提取溶剂参考量为8倍量。合并浓缩成浸膏。其次，将浸膏用水分散(参考量为2-3倍量的水)，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取四次(溶剂用量与水层比例为1:1)，以上四层及水层浓缩成浸膏。最后，将不同层进行硅胶柱分离，利用本筛选方法获得的丁香、老鹤草、血见愁或余甘子均是用不同比例的石油醚和二氯甲烷洗脱获得的组分(比例分别为50: 1,50: 1,20: 1,5: I)。本申请使用的缩略语和关键术语定义为:PAc:PA亚基羧基端PAn:PA亚基氨基端PBIn:PB1亚基氨基端HA:血凝素NA:神经氨酸酶ELISA:酶联免疫吸附法GST:谷胱甘肽巯基转移酶BACEl: β位点淀粉前体物蛋白剪切酶I天然产物:又称次级代谢产物(Secondary Metabolites),是指由活的生物体产生的化学结构十分复杂、不具已知功能的任何继发代谢物。作为本申请抗流感病毒物质的筛选方法，具体包括如下步骤:(I).将作为捕捉试剂的一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段结合在固相载体表面上；(2).将天然产物提取物和所述捕捉试剂接触；(3).将步骤(2)中接触后的捕捉试剂与任选地连接有标签的另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段接触，其中所述流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段能与步骤(I)中所述的流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段形成二元复合物；(4).将步骤(3)中接触后的捕捉试剂与能和上述另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段结合的可检测物质接触，或将步骤(3)中接触后的捕捉试剂与能和上述标签结合的可检测物质接触；(5).用针对所述可检测物质的检测工具测定结合于捕捉试剂的所述另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段的水平；和(6).根据所述测定的水平确定作为抗流感病毒物质的所述天然产物提取物。本申请筛选方法中，步骤(6)具体包括将所述测定的水平与阳性和阴性对照品的测定水平进行比较，选择高于或等于阳性对照水平的或者低于阴性对照水平但高于或等于阳性对照水平天然产物提取物作为抗流感病毒物质。本申请筛选方法中，所述流感病毒为甲型流感病毒。甲型流感病毒包括但不限于甲型人流感病毒、甲型禽流感病毒和甲型猪流感病毒，优选甲型禽流感病毒，更优选甲型H5N1亚型禽流感病毒。本申请筛选方法中，天然产物提取物制备自单味中药、按中药处方规定的药材种类和用量组成的混合物、未进行药用开发的动植物品种、海洋生物和微生物。优选中药材或其混合物的提取物。更优选丁香、老鹤草、血见愁或余甘子。本申请筛选方法中所述标签选自GST、MyC、HA、Flag、His6、生物素。本申请筛选方法中所述可检测物质是任选地带有标记的抗体，并且所述标记优选为酶。本申请筛选方法，步骤(5)优选包括:a.当所述抗体带有酶标记时，利用包含所述酶标记的底物的检测工具测定结合于捕捉试剂的所述另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段的水平；b.当所述抗体不带有酶标记时，利用包含与所述抗体特异性结合的带有酶标记的另一种抗体和所述酶标记的底物的检测工具测定结合于捕捉试剂的所述另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段的水平。本申请筛选方法中，酶标记的底物与相应的酶标记作用后显色、发荧光或导致化学发光。所述酶优选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶。本申请筛选方法中，优先选择阳性对照品为不含有中药提取物和ΡΒ1ν，阴性对照品为不含有中药提取物但含有ΡΒ1ν。本申请筛选方法还可以进一步优选为以下具体步骤和工艺:(I)将PA。片段溶于碳酸盐缓冲液加入PVC微量滴定板；(2)盖上盖子，4°C孵育过夜或37°C，2h孵育；(3)倒掉溶液，用洗涤液洗涤；(4)在每个孔中加入封闭液，阻抑剩余的蛋白结合位点；(5)倒空，用洗涤液洗涤；(6)在每个孔中加入用洗涤液进行不同浓度稀释后的各种天然提取物溶液孵育，阳性对照孔和阴性对照孔只加洗涤液；(7)在每个孔中加入用洗涤液稀释的PBl-GST溶液；阳性对照孔只加入等体积洗涤液孵育；(8)去除溶液，用洗涤液洗涤；
(9)加入用洗涤液稀释的兔源GST抗体溶液；(10)盖上盖子，孵育；(11) 一小时后用洗涤液洗涤；(12)加入用洗涤液稀释后的羊抗兔GST抗体-辣根过氧化物酶溶液；(13)盖上盖子，孵育；(14)用洗涤液洗涤；(15)吸取底物溶液，室温孵育直至阴性对照孔的颜色足够深，加入终止液，室温静置， 在450nm波长处检测每孔OD值；(16)对数据进行分析本申请筛选方法中，碳酸盐缓冲液优选为0.05MNaC03 0.318gNaHC03 0.586g加蒸懼水150mL调ρΗ9.6,最后定容到200mL本申请筛选方法中，洗涤缓冲液优选为:Ix PBS 0.15MKH2P04 0.2gNa2HP04.12H20 2.9gNaCl8.0gKCl 0.2g加蒸懼水900mL调ρΗ7.4最后定容到IOOOmLTween-200.05% (v/v)BSA 0.2% (w/v)本申请筛选方法，封闭液优选为:Ix PBS 0.15M pH 7.4 (配法同洗涤缓冲液)Tween-20 0.05% (v/v)BSA 1% (w/v)；本申请筛选方法，底物缓冲液优选为:200mM醋酸钠缓冲液PH5.0本申请筛选方法，底物溶液优选为:TMB (IOmg 溶于 5mL 无水乙醇)0.5mL底物缓冲液IOmL0.75% H202 32 μ L本申请筛选方法，终止液优选为:2Μ H2SO4:蒸馏水 178.3mL，逐滴加入浓硫酸(98% ) 21.7mL


图1示出禽流感病毒RNA聚合酶PA。片段与PBIn片段所形成的二元复合物的结构(Π2部分为PBIn片段)。图2 不出 Thermal shift assay 的原理图。图3示出本发明基于ELISA原理的抗流感病毒物质筛选方法的示意图。(其中I为包被蛋白PAC，2为加入要筛选的中药，3为加入蛋白GST-PB1，4为加入一抗，5为加入二抗，6为加入TMB-H2O2, 7为加入2M H2SO4终止反应)。图4示出不同稀释梯度的中药对PA。与PBIn片段相互作用的曲线图(注:阳性对照为不含有中药提取物和PB1n，阴性对照为没有含有中药提取物但含有PBIn)
具体实施例方式抗流感病毒物质筛选方法的实验如下:1、实验设计ELISA是酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay)的简称,它是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。本发明的药物筛选体系使用的是类似于ELISA的实验方法(参见图3)。首先将PAc片段通过疏水相互作用固定到96孔ELISA板的底部，并用牛血清白蛋白(BSA)封闭未结合PA。片段的位点。之后加入含有适当稀释浓度中药提取液的PBl-GST融合蛋白溶液，进行孵育。之后加入兔源GST抗体、羊抗兔GST抗体-辣根过氧化物酶偶联蛋白，每一步加入蛋白溶液并孵育后，都用缓冲液进行充分洗涤以除去未结合的蛋白。最后加入底物TMB-H2O2进行显色反应，再用稀硫酸终止显色，最后用450nm波长的分光光度计检测显色的强弱。对于含有能有效抑制PAC-PBl相互作用成分的中药提取物来说，最后的显色相对于阴性反应(不含有中药提取物的PBl对照)会比较弱。每板反应都会设置阳性与阴性对照，作为每次实验的质检标准；同时每个反应条件平行做两个重复样品，以提高实验结果的可靠性和准确性。2、实验材料a.实验用蛋白/抗体所用禽流感病毒RNA聚合酶来自A/goose/Guangdong/l/1996(HlN5)毒株，其中PA亚基的氣基酸序列如SEQ ID NO:I所不；PB1亚基的氣基酸序列如SEQ ID NO:2所不；PAC片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示〈请核实毒株来源并提供上述PA、PBl、PA。的具体
氨基酸序列>。所用牛血清白蛋白(BSA)购自BBI。所用兔源GST 抗体购自 Sino Biological Inc。羊抗兔GST抗体-辣根过氧化物酶购自Sino Biological Inc。b.实验试剂(I)碳酸盐缓冲液(0.05M):NaC03 0.318gNaHC03 0.586g加蒸懼水150mL调pH9.6最后定容到200mL(2)洗涤缓冲液(lx PBS 0.15M):KH2P04 0.2gNa2HP04.12H20 2.9gNaCl 8.0gKCl 0.2g
加蒸馏水900mL调ρΗ7.4最后定容到IOOOmLTween-20 0.05% (v/v)BSA 0.2% (w/v)⑵封闭液:Ix PBS 0.15M pH 7.4 (配法同洗涤缓冲液)Tween-20 0.05% (v/v)BSA I % (w/V)(3)底物缓冲液:200mM醋酸钠缓冲液PH5.0(4)底物溶液:TMB (IOmg 溶于 5mL 无水乙醇)0.5mL底物缓冲液IOmL0.75% H202 32 μ L(5)终止液(2Μ H2SO4):蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸(98% )21.7mL3、实验步骤(I)将I μ g/mL的PAc片段(溶于碳酸盐缓冲液ρΗ9.6)按100 μ L/孔加入PVC微
量滴定板；(2)盖上盖子，4°C孵育过夜(37°C，2h也可以达到包被的效果，但不均一也不彻底)；(3)倒掉溶液，用200 μ L洗涤液洗涤2次(除去液体时先将液体倒出，再倒扣在吸水纸上轻轻拍打，尽可能除尽液体，每次2分钟)；(4)在每个孔中加入封闭液200 μ L，阻抑剩余的蛋白结合位点，盖上盖子，37°C孵育1-2小时(这一步相当关键)；(5)倒空，用200 μ L洗涤液洗3次；(6)在每个孔中加入用洗涤液进行不同浓度稀释后的各种中药提取物溶液75yL，37°C孵育30分钟(阳性对照孔和阴性对照孔在此阶段只加洗涤液)；(7)在每个孔中加入用洗涤液稀释的8 μ g/mL PBl-GST溶液75 μ L (阳性对照孔这步只加入等体积洗涤液)，37°C孵育60分钟；(8)去除溶液，用200 μ L洗涤液洗3次；(9)加入100 μ L用洗涤液稀释后的0.1 μ g/mL的兔源GST抗体溶液；(10)盖上盖子，37°C孵育I小时；(11) 一小时后用200 μ L洗涤液洗4次；(12)加入100 μ I用洗涤液稀释后的0.1 μ g/mL羊抗兔GST抗体-辣根过氧化物酶溶液；(13)盖上盖子，37°C孵育I小时；(14)用200 μ L洗涤液洗4次；(15)用排枪吸取100 μ L底物溶液，室温孵育10分钟左右直至阴性对照孔的颜色足够深，最后加入100 U L终止液，室温静直10分钟后，在450nm波长处检测每孔OD值；
(16)对数据进行分析通过对丁香、老鹤草、血见愁和余甘子几种中药进行不同梯度的稀释，获得不同梯度下的吸光值，做出的曲线表明筛选到的丁香、老鹤草、血见愁和余甘子对PA。与PBIn蛋白相互作用确实是有较强抑制的。利用本发明筛选方法筛选中药提取物利用本发明所筛选的丁香、老鹤草、血见愁和余甘子均来自于西安小草中药库，取自茎叶提取的主要步骤分为三步:首先根据药材质地适当粉碎，加入95%乙醇提取两次，药渣加50%乙醇提取两次，提取溶剂参考量为8倍量。合并浓缩成浸膏。其次将浸膏用水分散(参考量为2-3倍量的水)，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取四次(溶剂用量与水层比例为1:1)，以上四层及水层浓缩成浸膏。最后，将不同层进行硅胶柱分离，利用本筛选方法获得的丁香、老鹤草、血见愁或余甘子均是用不同比例的石油醚和二氯甲烷洗脱获得的组分(比例分别为50: 1，50: 1，20: 1，5:1)。本发明在初次筛选西安小草中药库时首先选择抑制率(1_(药物孔-阳性孔)/(阴性孔-阳性孔)X 100% )在50%以上的中药进行复筛，复筛时设置四次平行取最接近的两个值并求得平均值，计算抑制率，最后选取活性最好的四种中药即丁香、老鹤草、血见愁和余甘子进行下一轮的数据分析。通过对丁香、老鹤草、血见愁和余甘子四种中药进行不同梯度(50X，100X，200X，400X)的稀释，获得不同梯度下的吸光值，做出曲线图(参见图4)。与阳性和阴性对照值相比丁香、老鹤草、血见愁和余甘子四种中药在稀释50X，100 X, 200 X的条件下光吸收值均在阳性对照值以上，阴性对照值以下，确实可以证明丁香、老鹤草、血见愁或余甘子具有抑制流感病毒的作用，当这四种中药被稀释到400倍的时候光吸收值在阴性对照值以上，预测是因为样品在此条件下受到了污染。表I示出所筛选出的中药提取物对PA。与PBIn片段相互作用的抑制数据。表I
权利要求
1.一种抗流感病毒物质的筛选方法，其特征在于:包括如下步骤: (1).将作为捕捉试剂的一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段结合在固相载体表面上； (2).将天然产物提取物和所述捕捉试剂接触； (3).将步骤(2)中接触后的捕捉试剂与任选地连接有标签的另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段接触，其中所述流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段能与步骤(I)中所述的流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段形成二元复合物； (4).将步骤(3)中接触后的捕捉试剂与能和上述另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段结合的可检测物质接触，或将步骤(3)中接触后的捕捉试剂与能和上述标签结合的可检测物质接触； (5).用针对所述可检测物质的检测工具测定结合于捕捉试剂的所述另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段的水平；和 (6).根据所述测定的水平确定作为抗流感病毒物质的所述天然产物提取物。
2.根据权利要求1的筛选方法，其特征在于:其中步骤(6)具体包括将所述测定的水平与阳性和阴性对照水平进行比较，选择具有低于阳性对照水平，且高于或等于阴性对照水平的所述测定的水平的天然产物提取物作为抗流感病毒物质。
3.根据权利要求1或2的筛选方法，其特征在于:其中所述流感病毒为甲型流感病毒。
4.根据权利要求 3的筛选方法，其特征在于:其中所述甲型流感病毒包括甲型人流感病毒、甲型禽流感病毒和甲型猪流感病毒。
5.根据权利要求4的筛选方法，其特征在于:其中所述甲型流感病毒为甲型禽流感病毒。
6.根据权利要求1或2的筛选方法，其特征在于:其中所述天然产物提取物制备自单味中药、按中药处方规定的药材种类和用量组成的混合物、未进行药用开发的动植物品种、海洋生物和微生物。
7.根据权利要求1或2的筛选方法，其特征在于:其中所述标签选自GST、Myc、HA、Flag、His6、生物素。
8.根据权利要求1或2的筛选方法，其特征在于:其中所述可检测物质是任选地带有标记的抗体，并且所述标记是酶。
9.根据权利要求8的筛选方法，其特征在于:所述步骤(5)具体包括: a.当所述抗体带有酶标记时，利用包含所述酶标记的底物的检测工具测定结合于捕捉试剂的所述另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段的水平； b.当所述抗体不带有酶标记时，利用包含与所述抗体特异性结合的带有酶标记的另一种抗体和所述酶标记的底物的检测工具测定结合于捕捉试剂的所述另一种流感病毒RNA聚合酶亚基或其片段的水平。
10.根据权利要求9的筛选方法，其特征在于:其中所述酶标记的底物与相应的酶标记作用后显色、发荧光或导致化学发光。
11.根据权利要求8-10任一项的筛选方法，其特征在于:其中所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶或β -D-半乳糖苷酶。
12.根据权利要求1-11任一项的筛选方法筛选得到的抗流感病毒物质在制备治疗和/或预防流感病毒药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于:其中所述抗流感病毒物质选自中药提取物，所述中药选自丁香、老鹤草、血见愁或余甘子。
14.一种治疗和/或预防流感病毒的药物组合物，其特征在于:所述药物组合物包括由权利要求1-11任一项所述筛选方法筛选得到的抗流感病毒物质。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于:所述抗流感病毒物质选自中药提取物，所述中药选自丁香、老鹤草、血见愁或余甘子。
全文摘要
本发明提供了一种抗流感病毒物质的筛选方法及其应用，更具体地说，提供了一种基于酶联免疫测定技术从天然产物提取物筛选抗流感病毒物质的方法及其应用。本发明的筛选方法能高效、便捷、准确地从大量的天然产物提取物中筛选获得有效抗流感病毒的物质，可用于制备治疗和/或预防流感病毒药物。本发明同时涉及一种以PAC-PB1N复合物为靶点的抗流感病毒抑制剂的高通量筛选方法。
文档编号A61P31/16GK103185790SQ20111045006
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者饶子和, 杨诚, 李雪梅, 陈瑜涛, 贾艳茹, 刘影影 申请人:天津市国际生物医药联合研究院