专利名称：一种高尔基蛋白gp73的夹心elisa定量检测方法及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝癌早期诊断血清标志物的一种免疫学检测方法，具体涉及一种高尔 基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法及其检测试剂盒。
背景技术：
肝脏是人体最大的器官，肝脏疾病也是发病率和死亡率最高的疾病。由于肝脏具 有很强的代偿能力，部分损伤往往无临床表现，导致肝脏疾病潜伏性强，待有临床表现时， 已经是肝病晚期，难以有效治疗。目前，能够在临床上开展的肝功能试验种类繁多，但是每 一种试验只能探查肝脏的某一方面的某一种功能，到现在为止仍然没有能反映肝脏的大部 分功能的指标，因而，往往引起漏检。目前肝癌治疗最有效的手段是手术切除，但由于缺乏 早期诊断手段，其治疗的效果并不理想，65%的肝癌患者发现并确诊时，病情已经晚期，失 去了根治手术的时机，约80%的患者在诊断后很快就死亡，因此肝癌的生存率非常低，这主 要是因为目前尚缺乏有效的早期诊断手段。目前对于肝脏疾病的诊断主要依靠肝功能检测。临床应用较为广泛的肝功能指标 有①反映肝细胞蛋白合成代谢功能的指标总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)。 ②反映肝细胞有无受损及严重程度的指标谷丙转氨酶(AIJT)、谷草转氨酶(AST)、腺苷脱 氨酶(ADA)、胆碱酯酶(ChE)、乳酸脱氢酶(LDH)等。③反映肝脏胆排泄、分泌及解毒功能的 指标总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆酸(TBA)、血氨(NH)。④对诊断胆汁淤积 指示酶(包括同工酶)有帮助的酶碱性磷酸酶(ALP)、r.谷氨酸转肽酶(GGT)、5_核苷酸 酶(5-NT)。⑤反映肝脏间质成分增生(肝纤维化和肝硬化)的指标III型前胶原氨基端 肽(PIIIP)、III型原胶原(PCIII)、IV型胶原c端原肽(CIV/PC)；层黏蛋白(LN)；透明质 酸(HA)。⑥对肝肿瘤诊断有意义的血清标志物甲胎蛋白(AFP)。然而现行的种种肝功能试验只能反映肝功能的一个侧面，并不能反映肝功能改变 的全貌，到目前为止，仍缺乏令人满意的有效诊断肝脏疾病的早期检测手段。因此，本领域 迫切需要开发一种新的有效检测肝脏异常的方法。GP73，又名Golml或Golph2，是主要定位在高尔基体上一种蛋白质，是一个II型 跨膜蛋白，具有5个糖基化位点，分子量约45KD，糖基化后约为73KD，其在GeneBank中的序 列号为51280。该蛋白基因序列保守，从两栖类到灵长类，都有其同源蛋白，功能相当保守， 在正常人肝脏组织表达量很低，而有肝脏疾患的病人肝脏中却大量表达。国外的相关研究 认为，GP73在肝癌患者体内表达量会很高，而病毒性肝炎，肝硬化、肝损伤患者与健康人的 GP73含量比较低，所以将其作为肝癌早期诊断标志物；目前只有免疫印迹检测GP73的方 法，还没有酶联免疫法检测GP73 ；免疫印迹方法操作繁琐，灵敏度和特异性都没有酶联免 疫法高。而在我们的研究中显示，病毒性肝炎，肝硬化和肝损伤患者的SGP73含量也明显高 于正常人，因此提出将GP73作为肝脏异常的标志物。根据发明人所进行的资料检索，国内外尚无其他有关检测GP73双单抗夹心ELISA方法的报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种快捷、灵敏、稳定的GP73定量检测方法，以弥补 现有技术的不足。为实现上述目的，本发明的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法采用两株 针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色 检测GP73，通过标准品制备的标准曲线确定GP73的含量。优选的，所述的针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体之一识别的蛋白质的 氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的序列。优选的，所述的针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体之一识别的蛋白质的 氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的序列。本发明获得的识别SEQ ID NO 1的单克隆抗体有三株，分别命名为1F2，1A6和 5F10 ；识别SEQ ID NO 2的单克隆抗体有两株，分别命名为5B12和9D2。通过配对实验，选 择出适合夹心 ELISA 检测 GP73 的最佳 HiAb1-HiAb2 配对有 5B12-5F10 ；5B12-1A6 ；5F10-1A6。所述的包被抗体HiAb1的浓度为1 5 μ g/mL。所述的检测抗体HiAb2的浓度为5 10 μ g/mL，所述检测抗体的稀释液为磷酸盐缓 冲液，磷酸盐缓冲液含体积百分比浓度为5%的小牛血清，质量百分比浓度为1 3%的聚 乙二醇(PEG)和体积百分比浓度为0. 1 0. 5%的吐温20 (Tween20)。所述的检测抗体为标记辣根过氧化物酶HRP的抗体。所述的底物显色剂为3，3' 5,5' _四甲基联苯胺(TMB)单组分显色液。具体来说，本发明的GP73的夹心ELISA定量检测方法采用针对GP73胞膜外区不 同表位的单克隆抗体(HiAb1)替代一株mAb与兔多抗的搭配，采用HRP-HiAb2替代兔多抗及同 HRP-羊抗兔抗体的结合反应；制备了多株可识别GP73胞膜外区不同表位的mAb，并通过交 叉配对选择出可用于夹心ELISA的最佳搭配，然后对工作条件进行了优化，通过简化的实 施步骤测得标本GP73水平。其中包被抗体为HiAb1，检测抗体是HRP标记的HiAb2株。优化的工作条件是①包被的HiAb1的工作浓度为5 μ g/mL ；②标准品为GP73融合蛋白，标准品的最高工作浓度约为0. 1 μ g/mL，倍比稀释11 个浓度梯度，空白对照用样本稀释液。③HRP-HiAb2 的稀释液为3 % PEG-0. 1 % Tween20_PBS，最佳工作浓度为 IOug/ HiL(按照mAb5F10的量计算)，PEG为质量百分比浓度，Tween20是体积百分比浓度。④底物显色TMB-H2O2单组分显色液所简化的实施步骤是①用包被液稀释包被HiAb1，加入96孔酶标板，100 μ L/孔，保湿，4度过夜；其中，包 被液为ΡΗ9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液。②用洗涤液洗板3次，加入工作浓度的封闭液，37度孵育2h ；其中，以含0. 1 %的 Tween20的PBS作为洗涤液。
③用洗涤液洗板3次，加入工作浓度标准品GP73融合蛋白和待测标本，100 μ L/ 孔，37度孵育Ih;④洗板3次，加入工作浓度的HRP-mAb2，100 μ L/孔，37度孵育Ih ；⑤洗板3次，以TMB底物显色，100 μ L/孔，室温避光显色IOmin ；⑥IM H2SO4终止；测定0D450nm的吸光值A ；⑦以标准品的A值和相应浓度制作标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比， 计算待测标本的GP73含量。本发明的第二个目的在于提供一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测试剂 盒，该试剂盒包括包被抗体和检测抗体、封闭液、显色剂、终止液、洗涤液、标准品，所述包 被抗体和所述检测抗体为两株针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体，所述标准品为 GP73蛋白。优选的，所述检测抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体，所述显色剂为3， 3' 5,5'-四甲基联苯胺(TMB)单组分显色液。所述的封闭液为含5%的小牛血清，0. 1% 吐温20 (Tween20)和0.01%防腐剂的磷酸盐缓冲液。其中，防腐剂为prOCline300。优选的，夹心ELISA 检测 GP73 的最佳 HiAb1-HiAb2 配对为 5B12-5F10 ；5B12-1A6 ； 5F10-1A6。本发明的GP73的夹心ELISA定量检测方法提高了检测GP73的灵敏度和特异性， 有良好的稳定性和再现性，缩短了操作时间，降低了成本，并且通过制备了多株针对GP73 不同位点的单克隆抗体，并进行了配对实验，提供了灵敏度和特异性都较高的双单抗夹心 ELISA检测GP73试剂盒。
图1是本发明的GP73蛋白结构模式图，单克隆抗体1F2，1A6，5F10识别IV区，5B12 和9D2识别V区；图2是本发明用5B12-5F10配对夹心ELISA检测GP73得到的标准曲线的一个优 选实施例；图3是用本发明用5B12-5F10配对方法结合本发明的试剂盒检测不同肝病、非肝 病患者和正常人血清GP73含量的一个优选实施例的检测结果。图4是根据图3的数据对不同肝病、非肝病患者和正常人血清GP73含量的柱状分 布图，同时对不同组别进行了比较。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。需要说明的 是，在本发明中所用到单抗只是发明人所列举的配对较好的抗体，只要用到GP73不同表位 的单抗配对夹心检测都在本发明的保护范围之内，而且本发明中的标记方法也不局限于所 列举的酶标法，只要起到放大显色的作用，则都在本发明的保护范围之内。实施例1本发明中涉及多个可选单抗，这些单抗的识别位点可见图1，图1是本发明的GP73 蛋白结构模式图，发明人筛选得到的单克隆抗体1F2，1A6，5F10识别IV区，5B12和9D2识别V区。本发明的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法中可以选择3组配对单抗， 分别为5B12-5F10 ；5B12-1A6 ；5F10-1A6。选择其中的一个配对实施例如下，其中，包被抗体 HiAb1 为 5B12，检测抗体 HiAb2 是 HRP 标记的 5F10，即 HRP-5F10。①用PH9. 6,0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被液，稀释包被抗体5B12，其工作 浓度为lug/mL，加入96孔酶标板，100 μ L/孔，保湿，4度过夜；②用洗涤液洗板3次，加入工作浓度的封闭液，37度孵育2h ；③用洗涤液洗板3次，加入工作浓度标准品GP73融合蛋白和待测血清标本， 100 μ L/孔，37度孵育Ih ；④洗板3次，以3 % PEG-0. 1 % Tween20_PBS作为HRP-5F10的稀释液，加入 HRP-5F10,使其工作浓度为5 μ g/mL，100 μ L/孔，37度孵育1h ；⑤洗板3次，以TMB底物显色，100 μ L/孔，室温避光显色IOmin ；⑥IM H2SO4终止；测定0D450nm的吸光值A ；⑦以标准品的A值和相应浓度制作标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比， 计算待测标本的GP73含量。标准品为GP73融合蛋白，标准品的最高工作浓度约为0. 1 μ g/mL，倍比稀释11个 浓度梯度，空白对照用样本稀释液，以标准品的吸光值A和相应浓度制作标准曲线，将待 测标本的吸光值A与标准曲线相比，计算待测标本的GP73含量。见图2，图2是本发明用 5B12-5F10配对夹心ELISA检测GP73得到的标准曲线，该标准曲线为y = 0. 1277x+0. 1137， R2 = 0. 9995 ；说明这一组单抗配对线性范围比较好，最低可检测到lng/ml。在另一个实施例中，包被抗体5B12的工作浓度为5 μ g/mL，检测抗体的工作浓度 为 10 μ g/mLo在另一个实施例中，包被抗体5B12的工作浓度为2 μ g/mL,检测抗体的工作浓度 为 8 μ g/mL。实施例2本发明的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测试剂盒的一个优选实施例包 括包被抗体和检测抗体、封闭液、包被液、稀释液、显色剂、终止液、洗涤液和标准品，包被 抗体和检测抗体为两株针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体，标准品为原核表达纯 化的GP73全长蛋白。检测抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体，所述显色剂为3， 3' 5,5'-四甲基联苯胺(TMB)单组分显色液。封闭液为含5%的小牛血清，0.1%吐温 20 (Tween20)和0. 01 %防腐剂prOCline300的磷酸盐缓冲液。包被抗体和检测抗体为两株 针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体，其识别的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO=I 和SEQ IDNO :2。以原核表达纯化的GP73融合蛋白作为标准品。包被液为PH9. 6，0. 05mol/ L的碳酸盐缓冲液、稀释液为磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液含质量百分比浓度为1 3% 的聚乙二醇(PEG)和体积百分比浓度为0. 1 0. 5%的吐温20(Tween20)，终止液为硫酸， 洗涤液为含0. 1% Tween20的磷酸盐缓冲液。选择5B12-5F10配对组装的试剂盒为一个实施例，其使用的具体步骤如下①用包被液稀释包被HiAb1 5B12，其工作浓度为2yg/mL，加入96孔酶标板， 100 μ L/孔，保湿，4度过夜；
②用洗涤液洗板3次，加入工作浓度的封闭液，37度孵育2h ；③用洗涤液洗板3次，加入工作浓度标准品GP73融合蛋白和待测标本，100 u L/ 孔，37度孵育lh;④洗板3次，以3 % PEG-0. 1 % Tween20_PBS作为HRP-5F10的稀释液，加入 HRP-5F10,使其工作浓度为8 u g/mL，100 u L/孔，37度孵育lh ；⑤洗板3次，以TMB底物显色，100 u L/孔，室温避光显色lOmin ；
⑥终止液终止；测定0D450nm的吸光值A ；⑦以标准品的A值和相应浓度制作标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比， 计算待测标本的GP73含量。标准品为GP73融合蛋白，标准品的最高工作浓度约为0. 1 u g/mL，倍比稀释11个 浓度梯度，空白对照用样本稀释液，以标准品的吸光值A和相应蛋白浓度制作标准曲线，将 待测标本的吸光值A与标准曲线相比，计算待测标本的GP73含量。实施例3利用实施例2所述的方法，对血清样本的GP73含量(SGP73)进行了测定，样本包 括健康人(70份)；非肝脏病人(131份)；肝炎病人(57份)；肝硬化病人(60份)；肝癌病 人(28份)。具体结果见图3，肝炎病人SGP73为110. 83 士60. 33ng/mL，肝硬化病人SGP73 含量为124. 22 士 51. 28ng/mL，肝癌病人SGP73含量为135. 72 士 59. 21ng/mL，所有肝病病人 的 SGP73 含量为 121. 18 士 56. 9ng/mL ；非肝病病人 SGP73 含量为 62. 80 士 34. 91ng/mL，健康 人SGP73含量为53. 45 士 17. 07ng/mL。图4是根据图3的数据对不同肝病、非肝病患者和正 常人SGP73含量的柱状分布图，同时对不同组别进行了比较。图4的数据说明了肝炎、肝硬 化、肝癌以及所有肝病病人SGP73含量明显高于健康人和非肝病病人(P < 0. 001)；肝炎， 肝硬化和肝癌病人的SGP73含量没有差异(P>0.05)；健康人和非肝病病人之间也无差异 (P > 0. 05)。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质
和范围。
序列表
<120> 一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法及其检测试剂盒
<160>2
<210>1
<211>143
<212>PRT
<213>GP-73
<400>1
Pro Gin ProArgLeuGin Ala AlaGlyLeuPro His Thr GluVal Pro
1510
Gin Gly LysGlyAsnVal Leu GlyAsnSerLys Ser Gin ThrPro Ala
202530
Pro SerSerGluValVal LeuAspSerLysArgGinValGluLysGlu
354045
Glu ThrAsnGlulieGin ValValAsnGluGluProGinArgAspArg
505560
Leu ProGinGluProGly ArgGluGinValValGluAspArgProVal
657075
Gly GlyArgGlyPheGly GlyAlaGlyGluLeuGlyGinThrProGin
859095
Val GinAlaAlaLeuSer ValSerGinGluAsnProGluMetGluGly
100105110
Pro GluArgAspGinLeu VallieProAspGlyGinGluGluGluGin
115120125
Glu AlaAlaGlyGluGly ArgAsnGinGinLysLeuArgGlyGlu
130135140
<210>1
<211>53
<212>PRT
<213>GP--73
<400>2
Asp AspTyrAsnMetAsp GluAsnGluAlaGluSerGluThrAspLys
151015
Gin AlaAlaLeuAlaGly AsnAspArg AsnlieAspValPheAsnVal
202530
Glu AspGinLysArgAsp ThrlieAsnLeuLeuAspGinArgGluLys
354045
Arg AsnHisThrLeu
50
权利要求
一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法，其特征在于，用两株针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色检测GP73，通过标准品制备的标准曲线确定GP73的含量。
2.根据权利要求1所述的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法，其特征在于， 所述的针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体识别的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法，其特征在于， 所述的针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体识别的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的序列。
4.根据权利要求1所述的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法，其特征在于， 所述的包被抗体的浓度为1 5 μ g/mL。
5.根据权利要求1所述的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法，其特征在于， 所述的检测抗体的浓度为5 10 μ g/mL，所述检测抗体的稀释液为磷酸盐缓冲液，所述磷 酸盐缓冲液含体积百分比浓度为5%的小牛血清，质量百分比浓度为1 3%的聚乙二醇 (PEG)和体积百分比浓度为0. 1 0. 5%的吐温20 (Tween20)。
6.根据权利要求1所述的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法，其特征在于， 所述的检测抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体。
7.根据权利要求1所述的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法，其特征在于， 所述的HRP标记的底物显色试剂为3，3' 5,5'-四甲基联苯胺(TMB)单组分显色液。
8.一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测试剂盒，包括包被抗体和检测抗体、包 被液、封闭液、样品稀释液、显色剂、终止液、洗涤液和标准品，其特征在于，所述包被抗体和 所述检测抗体为针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体，所述标准品为GP73蛋白。
9.根据权利要求8所述的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测试剂盒，其特征在 于，所述的封闭液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液含体积百分比浓度为5%的小牛血 清、体积百分比浓度为0. 的吐温20(Tween20)和体积百分比浓度为0.01%的防腐剂。
10.根据权利要求8所述的高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测试剂盒，其特征 在于，所述的洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液含体积百分比浓度为0. 的吐温 20(Tween20)。
全文摘要
本发明提供了一种高尔基蛋白GP73的夹心ELISA定量检测方法，用两株针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体，通过底物显色和标准曲线检测GP73的含量。本发明的GP73的夹心ELISA定量检测试剂盒包括包被抗体和检测抗体、封闭液、洗涤缓冲液、显色试剂、终止液和标准品，包被抗体和检测抗体为两株针对GP73胞膜外区不同表位的单克隆抗体，其识别的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。本发明的GP73的夹心ELISA定量检测方法和检测试剂盒提高了检测GP73的灵敏度和特异性，有良好的稳定性和再现性，缩短了操作时间，降低了成本。
文档编号G01N33/68GK101988926SQ20091004162
公开日2011年3月23日 申请日期2009年8月3日 优先权日2009年8月3日
发明者古艳丽, 彭涛 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院