专利名称：：多种兽药残留检测蛋白芯片及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及兽药检测产品，具体地说，涉及一种多种兽药残留检测蛋白芯片及其试剂盒。
背景技术：
：我国是农产品生产和消费大国，随着畜牧业的现代化、集约化和规模化生产，兽药及兽药添加剂在降低发病率与死亡率、提高饲料利用率、促生长和改善肉类品质方面起到十分显著的作用，已成为现代畜牧业不可缺少的物质基础。但是，由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使，养殖过程中滥用兽药和超标使用兽药的现象普遍存在。其后果，一方面是导致动物源性食品中的兽药残留，摄入人体后影响人类的健康；另一方面，各种养殖场大量排泄物(包括粪便、尿等)向周围环境排放，兽药又成为环境污染物，给生态环境带来不利影响。兽药残留是指给动物使用药物后蓄积和贮存在动物细胞、组织和器官内的药物原形、代谢产物和药物杂质。按兽药用途分类主要包括抗生素类、抗菌素类、抗寄生虫药、生长促进剂和杀虫剂。抗生素和化学合成抗菌素统称抗微生物药物，是最主要的兽药残留。兽药残留可造成极大的危害，例如引起急、慢性中毒；导致严重的再生障碍性贫血；破坏肠道微生物平衡，诱导耐药菌株等。近年来，兽药残留在国内外已经成为社会关注的公共卫生问题，与人类的健康息息相关。兽药残留包括兽药在生态环境中的残留和兽药在动物性食品中的残留。动物性食品是指肉(包括肝、肾等内脏)、蛋和乳及其制品的总称。随着经济的发展、动物性食品在人们食物总量中的比重越来越大，其卫生安全也倍受关注。目前，检测兽药残留的技术主要有气相色谱、ELISA等。气相色谱方法仪器要求高，专业性强；虽然定量准确，但费用高，耗时长，不易大规模推广应用。现有兽药残留分析中应用最多的是酶联免疫吸附检测技术(Enzyme-LinkedImmnosorbentAssay,ELISA)。公开号为CN1896739A(公开日2007.1.17)的专利，公开了一种兽药残留多组份酶联免疫检测试剂盒，可快速检测多组份(含多类别)残留兽药(包括克伦特罗、磺胺类、氯霉素、土霉素、乙烯雌酚及恩诺沙星)，通过并行联合检测，在同一时间内快速分析检测多种组份、多种类别的残留兽药。酶联试剂盒解决了该类试剂盒只能检测单一成分的局限，通过放置多个包被不同成分的载体槽，实现同时检测多种组份的指标。并兼有检测样本取样量少，前期处理简单，容量大，仪器化程度较低，成本低，效率高等特点。酶联试剂盒在实际应用中，还存在着一些缺陷。首先，因为其载体的材质和包被技术的局限，在其包被载体槽时，需要大剂量的抗原或抗体，才能达到良好的包被效果；由于抗原抗体的价格昂贵，使产品成本居高不下。其次，酶联免疫体系及显色方法限制了其结果判断准确性，并且参与显色反应的部分物质对环境具有相当大的污染及潜在危害。酶联试剂盒虽然可以进行多种组份联合检测，但却是通过放置多个包被不同成分的载体槽来实现的；即l个孔(载体槽)检测1个指标，联合8-12个孔对全部指标逐个进行分析。这样虽3然能实现联合检测，但对同一样本的检测需要在不同包被的载体槽中进行，多个不同指标载体槽反应条件的一致性、是否存在内源和外源物质的污染以及质量控制等，都处于非完全可控状态。
发明内容本发明要提供一种专门用于多种兽药残留检测的蛋白芯片，使兽药残留检测产品的制作成本降低；并且通过单孔反应可以检测一个样本的多种兽药残留，提高检测效率。发明人选用氯霉素、氯丙嗪、秋水仙碱、氨苯砜、己烯雌酚、二甲硝咪唑、呋喃唑酮和甲硝唑共8种最常用，危害最大的兽药作为检测对象，作为本发明所要检测的指标。主要检测指标与靶组织及MRL(最高残留限量)见下表。4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明目的是这样及国内外的限量标准，选取禁唑酮和甲硝唑共8种兽药作为抗原，并根据其结构特点，采用小鼠免疫和细胞瘤杂交技术，制备对应抗体，于一张基片上构成阵列式点样涂层，每个阵列可有多次重复。本发明提供的实现用于多种兽药残留检测蛋白芯片的技术方案如下由基片和阵列式分布于基片上的点样指标涂层组成，所述的点样指标包括抗_氯霉素、抗_氯丙嗪、抗_秋水仙碱、抗_氨苯砜、抗_己烯雌酚、抗_二甲硝咪唑、抗_呋喃唑酮和抗_甲硝唑，共8种兽药的抗体，以共价键或非共价键固定在基片表面。所述的点样指标均为单克隆抗体。所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纤维素膜或尼龙膜；优选例为带有醛基修饰的载玻片。所述的涂层上每个点样指标有2-10个重复；阵列的多少和大小与待检样品的数目，基片大小，以及点样直径有关。上述兽药检测指标与检测阵列的优选例是当检测指标点样直径为0.lmm时，点间距0.6mm，阵列大小为6mmX5mm，可在硝酸纤维素膜蛋白芯片上设置24个阵列。本发明还提供了一种包含上述多种兽药残留检测蛋白芯片试剂盒。所述的试剂盒还包括样本稀释液，酶标工作液，浓縮洗涤液、检测液、阴性对照和阳性对照；各液体为瓶装，用纸质、塑料、泡棉固定模板固定于包装盒内。不限放置方式，检测时配套使用。各部分配制方法如下所述的样本稀释液为40%甲醇；所述的酶标工作液由含有HRP标记的相应兽药的单克隆抗体，以及蛋白稳定剂组成；所述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢。所述的阴性对照由磷酸盐缓冲液组成。既可以监测整个检测系统的CV值，保证每次检测结果的有效性；也可以监测整个检测系统不受其他物质干扰，保证每次检测结果的可靠性。所述的阳性对照包括1-10个梯度浓度的8种兽药混合液；每个兽药混合液装入一个容器。所述的每个梯度浓度的兽药混合液中，每种兽药的浓度为0-100ug/L。阳性对照可以监测整个检测系统的有效性，保证每次检测结果的可靠性。上述的每个梯度浓度的兽药混合液，优选例为每种兽药的浓度依次为5ug/L、10ug/L、20ug/L。本发明涉及的检测指标恰当，全部指标集中于1个反应孔中，应用反应条件一致，大大提高了检测的效率；采用先进的点样技术和基片，仅需微量抗体原料，即可达到样本检测的要求，节约了产品成本；检测结果采用化学发光法，避免了显色反应底物的潜在危害和污染；本发明还采用了杂交瘤技术制备的单克隆抗体作为检测点样指标，避免使用多抗所产生的交叉反应，降低假阳性率。本发明可以适用于检测样本中氯霉素、氯丙嗪、秋水仙碱、氨苯砜、己烯雌酚、二甲硝咪唑、呋喃唑酮和甲硝唑共8种兽药的存在，确保肉类食品的安全卫生。图1是多种兽药残留检测蛋白芯片的外观图，l为反应区域，底部为点样涂层的基片。图2是点样阵列示意图，各行分别为兽药指标点样抗-氯霉素、抗-氯丙嗪、抗_秋水仙碱、抗_氨苯砜、抗_己烯雌酚、抗_二甲硝咪唑、抗_呋喃唑酮、抗_甲硝唑。每行两个指标，每个指标各有5个重复点样。第1行为抗_氯霉素、抗_氯丙嗪；第2行为抗_秋水仙碱、抗_氨苯砜；第3行为抗_己烯雌酚、抗_二甲硝咪唑；第4行为抗_呋喃唑酮、抗_甲硝唑。图3是多种兽药残留检测蛋白芯片试剂盒示意图。2代表浓縮洗涤液；3代表1瓶样本稀释液；4代表2瓶配套使用的检测液；5代表1瓶阴性对照；6代表3瓶阳性对照；7代表1瓶酶标工作液。图4为检测样本示意图，其中1个矩形表示所在加样区域加的是阴性对照，3个三角表示所在加样区域加的是阳性对照，其余圆形表示所在加样区域加的是样本。图5为结果检测为阴性的反应区阵列图，各指标或有微弱信号。图6为结果检测为部分兽药阳性的反应区阵列图。第2行5个亮点代表秋水仙碱阳性；第3行后5个亮点代表二甲硝咪唑阳性；第4行前后各5个亮点代表甲硝唑阳性。具体实施例方式应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或常规教科书，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例1:一种多种兽药残留检测蛋白芯片的制备其步骤主要是(1)准备基质硝酸纤维素膜；(2)设计芯片，确定点阵的排列方式和点样位置；(3)点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上；(4)装配硝酸纤维素膜，并且进行封闭、干燥、包装、保存。上述用于检测多种兽药残留检测蛋白芯片的制备方法具体包括以下步骤1.兽药检测抗原抗体的确定检测指标抗原的确定选取危害较大及较广泛的8种兽药作为抗原，用于制备点样抗体。抗原购买自市场。检测指标点样抗体的确定所采用的检测点样抗体均为小鼠杂交瘤单克隆抗体，以氯霉素、氯丙嗪、秋水仙碱、氨苯砜、己烯雌酚、二甲硝咪唑、呋喃唑酮和甲硝唑共8种兽药分别为免疫原，按照常规杂交瘤技术进行制备获得。其检测精度和准确度明显优于多克隆抗体。制备的抗体用点样液稀释成0.3mg/ml，用于点样制备蛋白芯片。点样液为含有1%BSA和0.1%防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH7.4)。抗体准备亦可购买自市场，使用前用上述点样液稀释成0.3mg/ml。2.点样制备具检测指标涂层的膜芯片用Gesim点样仪喷点，点样针从384孔板吸出抗体喷点于硝酸纤维素膜上，点阵形式为10X5矩形阵列，当点直径为0.lmm，点横向间距为0.6mm，抗体阵列的大小为6mmX5mm。3.蛋白芯片组装用具有分隔反应区域的器具将反应区域固定。组装方式见ZL032298900。组装完成后的示意图如图1。4.封闭对喷点抗体芯片的每个反应区域用3%BSA溶液进行封闭，室温2小时，封闭基片表面非特异性位点；5.IC存吸弃封闭液后，室温放置4小时，进行自然干燥；用塑料膜密封存放于4t:冰柜。实施例2:试剂盒的制备—种多种兽药残留检测蛋白芯片的试剂盒，由多种兽药残留检测蛋白芯片，样本稀释液，酶标工作液，浓縮洗涤液，检测液，阳性对照，阴性对照组成；各部分为瓶装，用纸质模板固定于包装盒内(如图2)，不限放置方式，检测时配套使用。以下是各部分的制备方法1.多种兽药残留检测蛋白芯片为6X8孔板，由硝酸纤维素膜做为片基，组装方式见ZL032298900。完成后外观图见图1。2.阴性对照5提供1瓶，0.25ml。阳性对照6提供3瓶，每瓶0.25ml。用含有3%BSA和0.05%防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH7.4)配置，其中氯霉素、氯丙嗪、秋水仙碱、氨苯砜、己烯雌酚、二甲硝咪唑、呋喃唑酮和甲硝唑的终浓度见下表单位ug/L氯霉素氯丙嗪秋水仙碱氨苯砜己烯雌酚二甲硝咪唑呋喃唑酮甲硝唑阴性对照00'000000阳性对照l55555555阳性对照21010101010101010阳性对照320202020202020203.样本稀释液3由40%甲醇配制而成。提供1瓶，50ml。用于稀释样本(比例为lg样本lml稀释液)。4.酶标工作液7由3%BSA禾口0.05%防腐剂(ProclinTM300)的磷酸盐缓冲液(pH7.4)配成溶液，含有各点样指标相对应的酶标二抗(HRP标记的8个兽药特异的单克隆抗体)。酶标二抗的浓度为0.1-0.5ug/ml。本实施例中为0.3ug/ml。提供6ml，1瓶。5.浓縮洗涤液2(10X)为磷酸盐缓冲液。由以下方法配置而成磷酸二氢钾6.8g，磷酸氢二钠7.lg，TWEEN-2010ml，溶于1000ml纯化水。各化学物质均为分析纯。提供50ml，l瓶。使用前用450ml去离子水稀释，混匀。6.检测液4使用PIERCE公司的SuperSignal恋ELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate作为配套检测液。A液、B液各l瓶，每瓶0.6ml。实施例3:蛋白芯片及试剂盒的应用及检测本发明所述的用于定量检测多种兽药的蛋白芯片的应用，主要采用抗体-抗原_酶标二抗方法检测样本中的兽药。方法是取样本lg捣碎，放入lml样本稀释液3，充分混匀，使样本与样本稀释液3充分反应半小时后，吸取部分萃取液，加于芯片表面。样本萃取液中存在的兽药会作为检测抗原，分别于固定在芯片上的相对应的特异抗体反应结合；吸弃反应液，加入酶标工作液7反应后，再洗去未结合的酶标二抗；再加入适量检测液后适当反应，扫描并收集信号，样本点的信号强度与样本中的兽药的浓度成正比。上述用于定量检测多种兽药的蛋白芯片试剂盒，其检测步骤如下(1)样本处理割取生猪肉样本lg捣碎，放入lml样本稀释液3，充分混匀，使样本与样本稀释液充分反应半小时；(2)检测反应在芯片的反应区域，加入样本萃取液，1份阴性对照、3份阳性对照(加样方式见示意图4，其中1个矩形表示所在加样区域加的是阴性对照，3个三角表示所在加样区域加的是阳性对照，其余圆形表示所在加样区域加的是样本)；每孔加100ul，置于恒温反应仪中37t:，振荡反应1小时，使抗体点阵与其特异抗体充分反应；(3)吸弃反应液，每孔加入酶标工作液100ul，置于恒温反应仪中37t:，振荡反应30分钟，并且用10倍稀释的浓縮洗涤液2在摇床上振荡洗涤三次，每次1分钟；(4)将PIERCE公司的SuperSignalELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate的配套使用的检测液A液和B液，作为检测液在使用前取适量以1:1混合，以每孔20ul的加样量，加入芯片上各反应区域上，反应30-60秒后进行化学发光检测；(5)用CCD检测仪进行化学发光的扫描并收集信号，依据扫描结果显示分析检测结果。如5为结果检测为阴性的反应区阵列图，各指标或有微弱信号。图6为结果检测为部分兽药阳性的反应区阵列图。第2行5个亮点代表秋水仙碱阳性；第3行后5个亮点代表二甲硝咪唑阳性；第4行前后各5个亮点代表甲硝唑阳性。10权利要求一种多种兽药残留检测蛋白芯片，由基片和阵列式分布于基片上的点样指标涂层组成，其特征在于，所述的点样指标包括抗-氯霉素、抗-氯丙嗪、抗-秋水仙碱、抗-氨苯砜、抗-己烯雌酚、抗-二甲硝咪唑、抗-呋喃唑酮和抗-甲硝唑，共8种兽药的抗体，以共价键或非共价键固定在基片表面。2.如权利要求1所述的多种兽药残留检测蛋白芯片，其特征在于，所述的点样指标均为单克隆抗体。3.如权利要求l所述的多种兽药残留检测蛋白芯片，其特征在于，所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纤维素膜或尼龙膜。4.如权利要求1或3所述的的多种兽药残留检测蛋白芯片，其特征在于，所述的玻璃片基是带有醛基修饰的载玻片。5.如权利要求1所述的多种兽药残留检测蛋白芯片，其特征在于，所述的涂层上每个点样指标有2-10个重复。6.—种包含权利要求1所述的多种兽药残留检测蛋白芯片试剂盒，还包括样本稀释液，酶标工作液，浓縮洗涤液、检测液、阴性对照和阳性对照；各液体为瓶装，用纸质、塑料、泡棉固定模板固定于包装盒内。7.如权利要求6所述的多种兽药残留检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，各部分配制方法如下所述的样本稀释液为40%甲醇；所述的酶标工作液由含有HRP标记的相应兽药的单克隆抗体，以及蛋白稳定剂组成；所述的检测液指配套使用的两种试剂，一种含有鲁米诺和化学发光增强剂，另一种含有过氧化氢。8.如权利要求6所述的多种兽药残留检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照包括1-10个梯度浓度的8种兽药混合液。9.如权利要求8所述的多种兽药残留检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，每个梯度浓度的兽药混合液中，每种兽药的浓度为0-100ug/L。全文摘要本发明公开了一种用于多种兽药残留检测蛋白芯片及其试剂盒，该芯片包括基片和阵列式分布的兽药抗体的点涂层，所述的基片是玻璃基片或膜基片；所述的兽药抗体点涂层是指在基片上均匀分布的，点阵于基片上的抗-氯霉素、抗-氯丙嗪、抗-秋水仙碱、抗-氨苯砜、抗-己烯雌酚、抗-二甲硝咪唑、抗-呋喃唑酮和抗-甲硝唑共8种兽药抗体。利用本发明的蛋白芯片仅通过一次反应就可得到多种指标的反应结果，可以适用于同时检测样本中氯霉素、氯丙嗪、秋水仙碱、氨苯砜、己烯雌酚、二甲硝咪唑、呋喃唑酮和甲硝唑共8种兽药，确保大宗肉类产品的安全卫生。文档编号G01N33/577GK101782580SQ20091004543公开日2010年7月21日申请日期2009年1月16日优先权日2009年1月16日发明者刘纲,奚鹰,汪宁梅,穆宇豪,穆海东申请人:上海裕隆生物科技有限公司