专利名称：检测人血清补体3的免疫金同步散射光谱试剂盒及使用方法
技术领域：
本发明涉及生化分析技术，具体是一种检测人血清补体3的免疫金同步散射光谱 试剂盒及使用方法。
背景技术：
人类补体3 (complement component 3，简称C3)成分是补体激活的经典途径、替 代途径以及甘露聚糖结合凝聚素途径三者的交汇点，也是补体系统的核心。急、慢性肾小球 肾炎、系统性红斑狼疮、风湿关节炎等疾病常引起人血清补体减少。补体C3含量过低常导 致严重的化脓性感染、肺炎、脑膜炎和败血症等，这可能与机体抗感染能力大大降低，C3介 导的循环免疫复合物(CIC)溶解和清除功能丧失有关；而C3含量过高也会引起急性炎症和 恶性肿瘤等病症。因此，人体血清中C3含量的检测，对阐明一些自身免疫性和变态性疾病 的发病机理以及临床诊断与病情变化观察具有重要意义。 补体3的测定过去多采用溶血试验，但灵敏度较低。近来，免疫比浊法 (immunon印helometry)、免疫扩散法(RID)、电泳免疫扩散法(EID)、时间分辨荧光测定法 (TrFIA)、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)、火箭免疫电泳法(RIE)、 电化学免疫传感器技术、固体基质室温磷光免疫分析法(SS-RTP-IA)、高效液相色谱分析 法(HPLC)等也用于补体C3的测定。在这些方法中，免疫比浊法简便但灵敏度较低。RID 法简单，但灵敏度低、重复性较差且操作流程长。EID法的影响因素较多，每块板检测样品 较少。RIA法灵敏度较高，需要的抗血清量少，但操作过程复杂且以放射性元素做为示踪 物，应用受到限制。TrFIA法以镧系元素位标记物，灵敏度高、线性范围宽，由于在近紫外 激发光谱，对生物分子的活性有影响。其检测补体C3的线性范围为0. 7-3650 ii g L—、 检出限达O. liig*L—、 ELISA法需抗血清量少，检出限1.2iig*mL—、 RIE法比RID法 縮短了检测时间，但需经醛化处理，在应用过程醛化影响因素较多。电化学免疫传感器 技术也可直接快速检测抗原或抗体，但固定抗体的方法效果欠佳，传感器再生性能受到 限制[16]。其中电位法的线性范围为0. 12-117. 3ng mL-1 ，检出限达0. 02ng mL-1 ;阳极 溶出免疫法的线性范围为7. 2-7330ng mL—\检测限达7. 0ng mL—1 ;电容型免疫传感器 的线性范围在18. 2-292. 5ng mL—1 ，检出限9. lng mL—1 ;压电免疫传感器的线性范围 在0. 078-24. 81 ii g mL—、检测限为0. 078 y g mL—1 。 SS-RTP-IA法有标记法和夹心法 两种方式，其中有标记法用异硫氰酸曙红(Eosin-ITC)做标记物，CaCl2做增强剂检测 补体C3的线性范围为0. 391-12. 5ng mL—\检测限达0. 3ng mL—1 ;夹心法的线性范围为 6. 25-100ng *mL—、检出限1. 37ng *mL—、 HPLC法检测补体C3浓度范围在12. 5_400ng *mL—1 但操作时间长。目前，在众多检测补体C3的方法中，只有免疫透射比浊法有商品化的试剂 盒，该试剂盒使用简便，但是线性范围窄，而且灵敏度不高，限制了其在检测低浓度样品中 的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、快速、灵敏、检出限低、检测浓度范围宽，不需 繁琐步骤的检测人血清补体3的免疫金同步散射光谱试剂盒及使用方法。
实现本发明目的的技术方案是 本发明利用C3和金标羊抗人C3抗体发生特异性反应后，胶体金发生聚集，使得体 系同步散射峰急剧增强，且增强的同步散射强度增强值与C3浓度成正比，通过测定同步散 射强度增强值，可对照标准工作曲线确定样品中C3的含量。 本发明试剂盒由下述三种试剂组成，其中试剂1为为校准品，含补体3冻干血浆蛋
白参考血清，试剂2含111. 5 164. 5mM Na2HP04、17. 5 45. 0mM拧檬酸溶液禾口 50 70g/
mL PEG6000，试剂3含金标记羊抗人C3抗体和0. 03-0. 06g/L PEG20000。试剂3是取200. OmL浓度为58. 0 y g mL—1胶体金溶液，加入0. 2-0. 4mL 30g/L
PEG20000作稳定剂，然后用0. 20mol L-%〇03调pH值至6. 5-8. 0。在磁力搅拌下，逐滴滴
加2. Omg的羊抗人C3抗体溶液，继续搅拌15min制成，然后放置4t:冰箱保存。 本发明免疫金同步散射光谱试剂盒检测人血清补体3的使用方法，包括如下步
骤 1、制备标准曲线 (1)准备6支试管，各试管依次加入不同体积的试剂l，一管不加参考血清作为空 白对照管； (2)每支试管加入800 ii L试剂2，混匀;
(3)每支试管加入500 ii L试剂3，混匀; (4)每支试管加入蒸馏水定容，使每根试管溶液最终体积为3.0mL，混匀后，在超 声波反应器中温育15min后，取适量于石英池中，置于荧光分光光度计上，在激发波长等于 发射波长的条件下同步扫描，得到体系的同步散射光谱，测定同步散射峰处的同步散射光 强度I，不加补体3作空白，测其同步散射光强度Ib ;最终同步散射值按下式计算最终同步 散射值A I = I_Ib ; (5)以浓度c与最终同步散射值A I绘制标准曲线；
2、制备样品测定体系 用步骤1的(1) (4)的方法制备样品测定体系，并求出其AI# ;
3、样品的最终同步散射值参照标准曲线，得到浓度值。 本试剂盒测定的线性范围为6. 0ng/mL-200ng/mL ;相关系数》0. 9909 ;检测限为 2. Ong mL—、 在相对误差在±5%之间时，1530倍L-酪氨酸、3846倍甘氨酸、2423倍尿素、2500 倍组氨酸、1277倍叶酸、16倍VB2、254倍IgA、8倍BSA、 154倍HSA、2307倍天冬氨酸、169倍 L-精氨酸、2077倍色氨酸、6410倍蔗糖、2154倍L_胱氨酸、354倍IgG、923倍抗坏血酸、461 倍MnS(V923倍ZnS04、138倍IgM、923倍DL-甲硫氨酸、615倍DL-色氨酸、60倍a -酸性 糖蛋白不干扰C3测定。 储存与有效期试剂避光储存于4t:冰箱中，可稳定半年。 本发明试剂盒操作简便、快速、灵敏、检出限低、检测浓度范围宽，不需繁琐的相分 离步骤，样品消耗量少，仅需几微升，适用于大多数生物样品分析。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例 主要仪器和试剂5mL刻度试管若干，可加0 1000 y L的加样枪一支，RF-540型 荧光分光光度计(日本岛津)，SY SK8200LH型超声波反应器(上海科导超声仪器有限公 司，工作频率为59KHz)。 试剂1为为校准品，含3. 0mg L—1补体3冻干血浆蛋白参考血清，试剂2含 145. 5mMNa2HP04和27. 25mM拧檬酸溶液和60g/mL PEG6000，试剂3含金标记羊抗人C3抗体 和0. 04g/LPEG20000。冻干血浆蛋白参考血清(补体C3含量为3. 0mg L—0 。样品人血清 由桂林市第五医院提供，所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
测定方法包括如下步骤
1、制备标准曲线 (1)用7支试管，各试管依次加入6. 0ii L、25. 0ii L、50. 0ii L、100. 0ii L、150. 0ii L、
200. 0 ii L补体C3含量为3. Omg L—1的冻干血浆蛋白参考血清，其中第一管不加参考血清 作为空白对照管； (2)每支试管加入800 ii L试剂2，混匀；
(3)每支试管加入500 ii L试剂3，混匀; (4)每支试管加入蒸馏水定容，使每根试管溶液最终体积为3.0mL，混匀后，在超 声波反应器中温育15min后，取适量于石英池中，置于荧光分光光度计上，用灵敏度为2，纵 坐标为6，在激发波长等于发射波长的条件下同步扫描，得到体系的同步散射光谱，确定同 步散射测量波长为560nm。测定560nm同步散射峰的同步散射光强度I，不加补体C3作空 白，测其同步散射光强度Ib ;最终同步散射值按下式计算最终同步散射值AI = I-Ib。
(5)以浓度c与最终同步散射值A I绘制标准曲线。
2、制备样品测定体系 以步骤1的(1) (4)的方法制备样品测定体系，加入的是从医院取到的正常人 的血清，用蒸馏水将人血清稀释100倍，取稀释后的样品30. Oii L，按实验方法测定，并求出 其AI样； 3、样品的最终同步散射值参照标准曲线，得到浓度值。 本试剂盒测定的线性范围为6. 0ng/mL-200ng/mL ;相关系数^ 0. 9909 ;检测限为 2. Ong mL—、 对比试验，用本检测方法检测正常人血清10份，检测的结果人血清补体C3含量为 0. 80-1. 90g L—1与正常人的血清补体含量一致，在置信水平为95%时，与用透射比浊法所 得的结果基本一致，证明了本发明测定方法的可靠性。
权利要求
一种检测人血清补体3的免疫金同步散射光谱试剂盒，其特征是它由下述三种试剂组成，其中试剂1为为校准品，含补体3冻干血浆蛋白参考血清，试剂2含111.5～164.5mMNa2HPO4和17.5～45.0mM柠檬酸溶液和50～70g/mL PEG6000，试剂3含金标记羊抗人C3抗体和0.03-0.06g/L PEG20000。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是试剂盒的标准曲线线性范围为6. 0ng/ mL-200ng/mL，相关系数^ 0. 9909，检测限为2. 0ng mL—、
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是试剂3是取200. 0mL浓度为58. 0 y g *mL—1 胶体金溶液，加入0. 2-0. 4mL 30g/L PEG20000作稳定剂，然后用0. 20mol *L—、C03调pH值 至6. 5-8. 0，在磁力搅拌下，逐滴滴加2. 0mg的羊抗人C3抗体溶液，继续搅拌15min制成，然后放置4t:冰箱保存。
4. 权利要求1所述的使用方法，其特征是包括如下步骤(1) 、制备标准曲线1) 准备6支试管，各试管依次加入不同体积的试剂l，一管不加参考血清作为空白对照管；2) 每支试管加入800 ii L试剂2，混匀；3) 每支试管加入500 ii L试剂3，混匀；4) 每支试管加入蒸馏水定容，使每根试管溶液最终体积为3. 0mL，混匀后，在超声波反 应器中温育15min后，取适量于石英池中，置于荧光分光光度计上，在激发波长等于发射波 长的条件下同步扫描，得到体系的同步散射光谱，测定同步散射峰处的同步散射光强度I， 不加补体3作空白，测其同步散射光强度Ib ;最终同步散射值按下式计算最终同步散射值△I = H"5) 以浓度c与最终同步散射值A I绘制标准曲线；(2) 、制备样品测定体系用步骤(1)的l) 4)的方法制备样品测定体系，并求出其AI#;(3) 、样品的最终同步散射值参照标准曲线，得到浓度值。
全文摘要
本发明公开了一种检测人血清补体3的免疫金同步散射光谱试剂盒及使用方法，本试剂盒由下述三种试剂组成，其中试剂1为为校准品，含补体3冻干血浆蛋白参考血清，试剂2含111.5～164.5mM Na2HPO4和17.5～45.0mM柠檬酸溶液和50～70g/mL PEG6000，试剂3含金标记羊抗人C3抗体和0.03-0.06g/L PEG20000。使用时，先制备C3标准系列，按一定比例加入试剂1、试剂2及试剂3定容后，在超声波反应器中温育15min后，用荧光分光光度计扫描同步散射光谱，测定其同步散射值，根据标准曲线求出C3含量。本发明试剂盒可以精确定量检测补体3，适用于临床和科研血清、血浆等样品中的补体3分析，具有操作简便、快速、灵敏、检出限低、线性范围宽，不需繁琐的相分离步骤，样品消耗量少的优点。
文档编号G01N21/64GK101718780SQ20091011450
公开日2010年6月2日 申请日期2009年10月29日 优先权日2009年10月29日
发明者李纪顺, 蒋治良, 黄文鑫 申请人:广西师范大学