专利名称：一种液体稳定的血清胆碱酯酶试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及血清中胆碱酯酶的测定试剂，具体为一种液体稳定的血清 胆碱酯酶试剂。
背景技术：
胆碱脂酶是酶活性的通用名称，根据作用的不同，胆碱酯酶还可细分 为乙酰胆碱脂酶和酰基胆碱脂酶。酰基胆碱脂酶(CHE)主要存在于胰脏、 心脏、肝脏、血清中。临床医学研究发现，有机磷杀虫剂中毒和慢性肝病 的患者中体内的酰基胆碱脂酶活性有明显下降，有研究表明，五分之四的
严重肝炎患者病人CHE降至正常的60%，危重病人可降至正常的10%，甚 至完全缺失。另外，慢性活动性肝炎等均可导致CHE活力下降，因此测定 CHE对肝脏功能估计和肝病的预测有着重要的参考价值。
酰基胆碱脂酶底物中以丁酰基硫代胆碱(BTC)或丙酰基硫代胆碱最为 通用，其中BTC被认为是CHE最为特异底物之一，所以对于人血清和体液 中的胆碱酯酶的测定，检验医学界主要采用BTC作底物，酶促反应后释放 出的硫代胆碱与5 ，5' - 二硫双(2 -硝基苯甲酸)(DTNB)反应生成黄色 的化合物5-硫代-2 -硝基苯甲酸(最大吸收在410nm)，采用速率法或 终点法测定(Gary, P. G. ， Choiinesterase determination. CLIN. CHEM. 1971; 17， 1145 1148)。然而，由于上述胆碱脂酶底物在水溶液中稳定 性很低，在水溶液中即使没有胆碱酯酶催化，也极易水解成有机酸和硫代 胆碱，从而干扰试剂检测的准确性。因此，如何使胆碱脂酶底物溶液稳定 化是维持胆碱脂酶测定试剂稳定性、保证测定结果真实可靠的关键。
针对此类胆碱脂酶底物溶液稳定化问题，国家知识产权局2006年8 月2日公开的公开号为CN1811393A，名称为《液体稳定的血清胆碱酯酶试 剂》的发明专利，公开了用0.1mmol/L至饱和浓度的苯酚溶液作为溶液的 BTC稳定技术以及相关的胆碱酯酶液体检测试剂。但该方法存在以下的不 足苯酚在水中溶解度低，且易受温度影响，低温储存过程中容易造成沉 淀释出；而且苯酚暴露在空气中容易被氧化成醛酮，造成在溶液变色；从 而导致该类试剂在使用过程中易出现试剂空白不稳定、测定结果波动大等 现象，加大了检测结果的不确定性。另外，公开号为CN1978660A，名称为 《稳定化胆碱酯酶底物溶液》的发明专利公开了一种利用极性有机溶剂作 为稳定介质的BTC稳定技术以及相关的胆碱酯酶液体检测试剂，具体阐述 了一定浓度的极性有机溶剂如乙醇、丙酮、二甲基亚砜、丙酮、乙酰丙酮、 四氢呋喃等对BTC有很好的稳定作用。该方法虽然在很大程度上提高了BTC溶液的稳定性，但是由于该方法使用了较大用量的极性有机溶剂，而 该类有机溶剂存在要么挥发性大、要么生物毒性强等缺点，因此该类方法 试剂在使用时均会对操作者健康造成不同程度的危害，而且试剂在报废处 理时也易造成环境污染。同时采较高浓度的极性有机溶剂溶液不适合在有 机材质容器(如聚乙烯类塑料瓶等)中存放和使用，这与目前绝大部分全 自动生化分析仪配套试剂瓶均采用有机材质的实际情况相矛盾。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术中胆碱脂酶试剂不够稳 定、毒性较大的不足，提供一种低毒、稳定性好、检测结果准确且易于存 放的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂。
本发明的技术方案 一种液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，由试剂一和 试剂二组成，其中，试剂一包括
pH值为6. 5 7. 8的缓冲溶液 20 200腿ol/L ;
巯基显色剂 0. 5 5mmol/L ;
所述试剂二包括
pH值为3. 5 5. 0的酸性缓冲液 20 200mmol/L ;
环氧乙烷縮合物 5 100g/L ;
硫酸盐 5 100g/L ;
胆碱酯酶底物 10 50g/L 。
本发明中，试剂一的作用是调节工作试剂的反应PH值，试剂二则是 稳定化的胆碱酯酶底物溶液，两者在检测时组成完整的检测试剂。试剂一 与试剂二的比例关系是试剂二与试剂一混合形成工作试剂，并使该工作 试剂的pH值为7. 4 7. 8， 一般二者的混合比例(体积)为试剂一:试剂二 = 30: 1。
为了提高样本血清、血浆在试剂中的溶解性及检测反应体系的通透 性，可在试剂一和/或试剂二中分别添加一定量的非离子型表面活性剂， 其用量一般在0.5 lg/L;具体可以是浓度在该范围内的曲拉通X—100、 吐温一20、吐温一80或月桂醚35等；同时为了防止试剂在贮存期内长菌， 还可在试剂一和/或试剂二中分别添加少量的防腐剂，如二氯乙酰氨、乙 酸乙酯钠或苯甲酸乙酯钠等常用防腐剂，所述防腐剂的用量控制在0. l 0.5g/L。
上述技术方案中，其中试剂一中
所述的缓冲溶液可为pH值在6. 5 7. 8范围内磷酸盐缓冲液、硼酸盐 缓冲液或GOOD'S生物缓冲液；其中，GOOD'S生物缓冲液可为PIPES、M0PS0、 M0PS、 BES或HEPES缓冲液等；
所述的巯基显色剂可为5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、二己基二硫
5代氨基甲酸钠或二氮杂菲。 在试剂二中
所述的酸性缓冲液可为pH值在3. 5 5. 0范围内的磷酸缓冲液、醋酸 缓冲液和GOOD'S生物缓冲液中的至少一种；其中，GOOD'S生物缓冲液可 为M0PS0、 MOPS或HEPES缓冲液等；
所述的环氧乙垸縮合物为化学通式为H0(CH2CH20)nH，分子量在190 8500 Dal ton之间的乙二醇聚氧乙烯醚(PEG );具体可选自PEG200 、 PEG400 、 PEG600、 PEG800、 PEGIOOO、 PEG1500、 PEG2000、 PEG3000、 PEG4000、 PEG6000 和PEG8000中的任意一种或两种以上的组合；
所述的硫酸盐为选自硫酸钠、硫酸钾、硫酸氢钠、硫酸氢钾和硫酸氨 中的至少一种；
所述的胆碱酯酶底物为丁酰基硫代胆碱或丙酰基硫代胆碱。
本发明试剂检测反应原理如下
酰基硫代胆碱+ H20 胆石咸酉旨酶,硫代胆碱+酸根
硫代胆碱+5，5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)- 5-硫代-2-石肖
基苯甲酸(在410nm有最大吸收)
通过检测在410nm波长下的吸光度上升速度测算出样品中胆碱酯酶的 酶活力。
从上述试剂盒检测反应原理可知胆碱酯酶底物水解产物之一的硫代 胆碱可与5-硫代-2-硝基苯甲酸反应显色。因此可通过检测不同时期和不 同贮藏条件下的试剂二 (胆碱酯酶底物溶液)与试剂一混合后的吸光度变 化，即试剂空白吸光度变化来验证胆碱酯酶底物溶液的稳定性。
申请人在将试剂一和试剂二在37'C放置15天的稳定性负荷试验以及 4至8'C贮存温度下保存15个月的贮存期稳定性实验中，试剂空白吸光度 及试剂检测因子均无明显变化，试剂在准确度、精密度、线性范围等性能 指标上均无任何影响，完全负荷临床检测要求。
本发明试剂可采用常规的手工测定方法，也可通过全自动生化分析仪 等分析仪器对样品进行检测，具体可采用以下方法
方法l:
加入物空白管测定管
去离子水20ul—
样品—20 uL
试剂一3000 u L3000 u L
混匀，37匸恒温1-5分钟试剂二100 uL100 uL
混匀，37'C延迟时间60秒，测定时间120秒，测定AA/分。 计算方法CHE (U/L) ^AA/分XF其中F为试剂测定的计算因子，为了保证测试结果的可靠性，要求在 样本检测前需通过胆碱脂酶标准品或标准血清对F因子进行校证。
方法2:
在测定前将试剂一与试剂二按体积比为30:1的比例混合成单试剂， 按以下方法进行检测，计算方法同上。
加入物空白管观淀管
去离子水一
样品_20 u L
工作试剂3100 uL3100 uL
混匀，37。C延迟时间60秒，测定时间120秒，在405nm测定AA/分。 上述测定方法中所述的样品可为血清或血浆。
与现有技术相比，本发明以环氧乙烷縮合物和硫酸盐作为胆碱酯酶底 物溶液的稳定剂，不仅使血清胆碱酯酶试剂的稳定性能好，试剂在4 8 "C温度下贮存有效期可达15个月以上，与现有的采用有机材质制成的全 自动生化分析仪配套试剂瓶不相抵触；而且由于试剂毒性低，因此在使用 及报废处理的过程中对环境几乎无污染、操作者使用风险性大大降低；同 时本发明试剂还具有操作简便、快速、易于存放等优点。
具体实施例方式
下面以实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1 试剂一
试剂组分
pH=7. 8的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液 5， 5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 曲拉通X—IOO 二氯乙酰氨
lmmol几 0. 5g/L 0. 2g/L
浓度 100腸1/L
试剂二:
试剂组分
pH二4. 5的HEPES缓冲液
浓度 50mmol/L
PEG200 PEG6000 硫酸钠 硫酸氢钠
丁酰硫代胆碱
20g/L
10g/L
5g/L
10g/L
16g/L
7试剂一和试剂二在37"C放置15天后，底物浓度、巯基显色剂和试剂 性能无明显跌落，当按照本发明所述的测定方法进行检测时，试剂的计算 因子在17000 18000之间，酶活力测定上限可达12000 13000U/L。
实施例2 试剂一
试剂组分 浓度
pH=7. 5的M0P0S缓冲液 50mmol/L
二己基二硫代氨基甲酸钠 lmmol/L
月桂醚35 lg/L 二氯乙酰氨 0.2g/L 试剂二
试剂组分 浓度
pH二4. 5的磷酸二氢钾缓冲液 200mmol/L
PEG400 20g/L
PEG6000 50g/L
硫酸氨 80g/L
硫酸氢钠 20g/L
丁酰硫代胆碱 10g/L
试剂一和试剂二在37'C放置15天后，底物浓度、巯基显色剂和试剂 性能无明显跌落，当按照本发明公开的测定方法进行检测时，试剂的计算 因子在15000 17000之间，酶活力测定上限可达12000 13000U/L。
实施例3 试剂一
试剂组分
pH=6. 5的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液 5， 5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 试剂二
试剂组分 pH=5. 0的磷酸二氢钾缓冲液 PEG6000 硫酸钠 硫酸氢钾
50mmol/L 3mmol/L
浓度
100腿ol/L 5g/L 10g/L 20g/L
8丙酰硫代胆碱 25g/L
试剂一和试剂二在37"C放置15天后，底物浓度、巯基显色剂和试剂
性能无明显跌落，当按照本发明公开的测定方法进行检测时，试剂的计算
因子在21000 22000之间，酶活力测定上限可达11000 12000U/L。
实施例4 试剂一
试剂组分 浓度 pH=7. 5磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液 50mmol/L 5， 5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 5mmol/L 吐温一80 lg/L 试剂二
试剂组分 浓度
pH=3. 5醋酸一醋酸钠缓冲液 100mmol/L
PEG6000 30g/L
PEG8000 10g/L
硫酸钠 20g/L
硫酸氢钾 15g/L
丁酰硫代胆碱 50g/L
试剂一和试剂二在37。C放置15天后，底物浓度、巯基显色剂和试剂 性能无明显跌落，当按照本发明公开的测定方法进行检测时，试剂的计算 因子在15000 18000之间，酶活力测定上限可达12000 13000U/L。
实施例5 试剂一
试剂组分 浓度
pH=7. 5的磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液 50mmol/L
二氮杂菲 lmmol/L
月桂醚35 lg/L
乙酸乙酯钠 0.2g/L 试剂二
试剂组分 浓度
pH=4. 0的醋酸一醋酸钠缓冲液 100mmol/L
PEG6000 30g/LPEG8000 70g/L
硫酸钾 20g/L
硫酸氢钠 40g/L
丁酰硫代胆碱 30g/L
吐温-20 0. 8g/L
苯甲醚乙酯钠 lg/L
试剂一和试剂二在37。C放置15天后，底物浓度、巯基显色剂和试剂 性能无明显跌落，当按照本发明公开的测定方法进行检测时，试剂的计算 因子在15000 18000之间，酶活力测定上限可达12000 13000U/L。
实施例6 试剂一
试剂组分 浓度
pH=7. 8的M0P0S缓冲液 50mmol/L
二己基二硫代氨基甲酸钠 0.5mmol/L 吐温_80 0.5g/L
苯甲酸乙酯钠 lg/L 试剂二
试剂组分 浓度
pH=5. 0磷酸缓冲液 25mmol/L
pH=5. 0M0PS缓冲液液 25mmol/L
PEG200 lOg/L
PEG6000 25g/L
硫酸钠 20g/L
硫酸氢钾 15g/L
丁酰硫代胆碱 16g/L
试剂一和试剂二在37C放置15天后，底物浓度、巯基显色剂和试剂 性能无明显跌落，当按照本发明公开的测定方法进行检测时，试剂的计算 因子在18000 20000之间，酶活力测定上限可达12000 13000U/L。
实施例7 试剂一
试剂组分 浓度 pH=7. 0的HEPES缓冲液 50mmol/L5， 5-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 2. 5mmol/L
曲拉通X—100 0.5g/L试剂二
试剂组分 浓度
pH=4. 0的HEPES缓冲液 25,ol/L
PEG200 20g/L
PEG6000 10g/L
硫酸钠 5g/L
丙酰硫代胆碱 30g/L
曲拉通X—100 0.5g/L
试剂一和试剂二在37'C放置15天后，底物浓度、巯基显色剂和试剂性能无明显跌落，当按照本发明公开的测定方法进行检测时，试剂的计算因子在19000 21000之间，酶活力测定上限可达11000 12000U/L。
权利要求
1、一种液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，由试剂一和试剂二组成，其特征在于所述试剂一包括pH值为6. 5～7.8的缓冲溶液 20～200mmol/L；巯基显色剂 0.5～5mmol/L；所述试剂二包括pH值为3. 5～5.0的酸性缓冲液 20～200mmol/L；环氧乙烷缩合物 5～100g/L；硫酸盐 5～100g/L；胆碱酯酶底物 10～50g/L。
2、根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在 于所述试剂一中的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或GOOD'S 生物缓冲液。
3、根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在 于所述试剂一中的巯基显色剂为5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、二己 基二硫代氨基甲酸钠或二氮杂菲。
4、根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在 于所述试剂二中的酸性缓冲液为磷酸缓冲液、醋酸缓冲液和GOOD'S生 物缓冲液中的至少一种。
5、 根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在 于所述试剂二中的环氧乙垸縮合物为化学通式为H0(CH2CH20)nH，分子量 在190 8500 Dalton之间的乙二醇聚氧乙烯醚(PEG)。
6、 根据权利要求5所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在 于所述环氧乙烷縮合物为选自PEG200、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、 PEG1500、 PEG2000、 PEG3000、 PEG4000、 PEG6000和PEG8000中的至少一 种。
7、 根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在pH值为6. 5 7. 8的缓冲溶液 巯基显色剂20 200mmol/L ; 0. 5 5mmol/L ;环氧乙垸縮合物 硫酸盐胆碱酯酶底物5 100g/L ; 5 100g/L ; 10 50g/L 。于所述试剂二中的硫酸盐为选自硫酸钠、硫酸钾、硫酸氢钠、硫酸氢钾 和硫酸氨中的至少一种。
8、根据权利要求1所述的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂，其特征在 于所述试剂二中的胆碱酯酶底物为丁酰基硫代胆碱或丙酰基硫代胆碱。
全文摘要
本发明将公开一种低毒、稳定性好、检测结果准确且易于存放的液体稳定的血清胆碱酯酶试剂。它由试剂一和试剂二组成，试剂一的作用是调节工作试剂的反应pH值，试剂二则是稳定化的胆碱酯酶底物溶液，两者在检测时组成完整的检测试剂。与现有技术相比，本发明以环氧乙烷缩合物和硫酸盐作为胆碱酯酶底物溶液的稳定剂，不仅使血清胆碱酯酶试剂的稳定性能好，试剂在4～8℃温度下贮存有效期可达15个月以上，与现有的采用有机材质制成的全自动生化分析仪配套试剂瓶不相抵触；而且由于试剂毒性低，因此在使用及报废处理的过程中对环境几乎无污染、操作者使用风险性大大降低；同时本发明试剂还具有操作简便、快速、易于存放等优点。
文档编号G01N21/77GK101504373SQ200910113889
公开日2009年8月12日 申请日期2009年2月23日 优先权日2009年2月23日
发明者叶志杰, 陈彦华 申请人:桂林市朗道诊断用品有限公司