专利名称：测定辣根过氧化酶的酶催化氧化纳米银-石墨炉原子吸收光谱法的制作方法
技术领域：
本发明涉及辣根过氧化酶的测定方法，特别是一种能较好测定辣根过氧化酶的酶催化氧 化纳米银-石墨炉原子吸收光谱法。
背景技术：
纳米银是一种新兴的最价廉的贵金属功能材料，具有很高的比表面积和表面活性，广泛 用作催化剂材料、生物传感器材料、抗菌、除臭及吸收部分紫外线等。它具有新奇的光谱特 性，已用于生化分析。辣根过氧化物酶(horsemdish peroxidase, HRP)是一种重要的蛋白酶，可 以催化氧化某些无机物和有机物，广泛用于环境科学、临床化学、食品工业，及分析化学等 领域。目前，HRP的测定方法主要有伏安法、分光光度法、荧光法、化学发光法和流动注射 法等。但未见纳米银催化反应与原子吸收光谱法结合间接测定HRP的报道。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足，提供一种简便可行，选择性好，灵敏度高的测 定辣根过氧化酶的酶催化氧化纳米银-石墨炉原子吸收光谱法。 实现本发明的目的技术方案是
在弱酸性条件下，H202很难氧化纳米银微粒；当有HRP存在时，HRP催化H202生成羟
基自由基，羟基自由基具有较强的氧化性，可将纳米银微粒氧化为银离子。据参考文献可知， HRP浓度愈大，羟基自由基浓度愈大，被氧化的纳米银微粒愈多，离心液中银离子增多,吸光 度值线性增大。采用石墨炉原子吸收光谱法可测定吸光度值，依照AA值与HRP浓度关系曲 线，就可测出被测物中的HRP含量。
测定辣根过氧化酶的酶催化氧化纳米银-石墨炉原子吸收光谱法，包括如下步骤
(1) 制备HRP的标准体系在5 mL的具塞刻度试管中，依次加入0.1 mL pH 4.2 HAc-NaAc缓冲溶液，0.2 mL 3.96 x l(T4 mol/L的H202溶液，0.5 mL 2.4xl(T4 mol/L的银胶， 再加入一定量的HRP，用水定容至3.0mL,混匀，室温反应6min后，倒入10mL离心管中， 以24000 rpm，离心20min;
(2) 用步骤(1)的方法制备不加HRP为空白对照体系；
(3)分别吸取离心液100.0 ^tL于2个5 mL刻度试管中，稀释到2.0 mL，用石墨炉原 子吸收分光光度计测定标准体系的吸光度为Ab，不加HRP做空白，测其吸光度Ao，计算AA
=Ab-A。；
(4) 以AA值与HRP浓度作关系曲线；
(5) 依照上述步骤(1)制备检测体系，本实验选择测定废水中的HRP含量，但不知浓 度，求出被测体系的AA;
(6) 依据(4)的工作曲线，根据回归方程为AA = 0.011 c +0.12，相关系数0.9951，即可求得HRP浓度在0.84 50 ng/mL范围内的浓度。
本发明的优点是与已有的方法相比，本测定方法操作简便，灵敏度高，选择性较好， 反应条件容易达到。
具体实施例方式
(1)制备服P的标准体系在5 mL的具塞刻度试管中，依次加入0.1 mL pH 4.2 HAc-NaAc缓冲溶液，0.2 mL 3.96 x 10" mol/L的H202溶液，0.5 mL 2.4xl(T4 mol/L的银胶， 再加入一定量的HRP，用水定容至3.0mL，混匀，室温反应6min后，倒入10mL离心管中， 以24000 rpm，离心20 min;
(2)用步骤(1)的方法制备不加HRP为空白对照体系；
(3)分别吸取离心液100.0 nL于2个5 mL刻度试管中，稀释到2.0 mL，用石墨炉原 子吸收分光光度计测定其吸光度Ab。不加HRP做空白，测其吸光度Ao，计算AA-Ab-Ao;
(4) 以AA值与HRP浓度作工作关系曲线；
(5) 依照上述步骤(1)制备检测体系；
(6) 依照上述歩骤(3)的方法，测得检测体系的吸光度AA，根据工作曲线方程可求出
未知试样中HRP含量。
表1不同制备方法所得的银胶用于HRP分析的结果:
银胶制备方法回归方程浓度范围 (ng/mL)相关系数检出限 (ng/mL)
硼氢化钠还原法:0.011 c + 0. 120.84 50.00.99510.41
微波反应柠檬酸三 还原法钠=0扁2 c + 0.232.08 33.30.99881.27
水热反应柠檬酸三 还原法.纳=0.0052 c+ 0.0150.84 33.30.98630.60
表2本发明实施例酶催化氧化纳米银-石墨炉原子吸收光谱法测定废水中辣根过氧化 酶含量的结果
平均值相对标准偏差力口标量回收量回收率
样品(吗 mL")(%)Oig . mL-1)"g . mL")(o/o)
18.59 ±0.121.41.671.78106.6
22.75 ± 0.0833.01.671.5190.4
315.24 ±0.644.21.671.5693.4
权利要求
1、测定辣根过氧化酶的酶催化氧化纳米银-石墨炉原子吸收光谱法，其特征是含有如下步骤(1)制备HRP的标准体系在5mL的具塞刻度试管中，依次加入0.1mL pH 4.2HAc-NaAc缓冲溶液，0.2mL 3.96×10-4mol/L的H2O2溶液，0.5mL 2.4×10-4mol/L的银胶，再加入一定量的HRP，用水定容至3.0mL，混匀，室温反应6min后，倒入10mL离心管中，以24000rpm，离心20min；(2)用步骤(1)的方法制备不加HRP的空白对照体系；(3)分别吸取离心液100.0μL于2个5mL刻度试管中，稀释到2.0mL，用石墨炉原子吸收分光光度计测定其吸光度Ab，不加HRP做空白，测其吸光度A0，计算ΔA＝Ab-A0；(4)以ΔA值与HRP浓度作关系曲线；(5)依照上述步骤(1)制备检测体系，加入的为含有HRP但未知浓度的被测物，求出被测体系的ΔA；(6)依据(4)的工作曲线，根据回归方程为ΔA＝0.011c+0.12，相关系数0.9951，即可求得HRP浓度在0.84～50ng/mL范围内的浓度。
2、 如权利要求1所述的测定辣根过氧化酶的酶催化氧化纳米银-石墨炉原子吸收光谱法，其特征是上述方法测定水样中HRP的检出限为0.41 ng/mL。
全文摘要
本发明公开了一种测定辣根过氧化酶的酶催化氧化钠米银-石墨炉原子吸收光谱法，测定步骤为1.先制备HRP的标准体系，用石墨炉原子吸收分光光度计测定其吸光度为A<sub>b</sub>；2.制备不加HRP的空白对照体系，测定其吸光度为A<sub>0</sub>；3.计算ΔA＝A<sub>b</sub>-A<sub>0</sub>；4.以ΔA与HRP的浓度关系作工作曲线；5.制备检测体系，加入的为含有HRP但不知浓度的被测物，并测定其吸光度为ΔA；6.根据工作曲线，求出被测物的HRP的浓度。本发明的优点是具有较好的选择性，灵敏度高，反应条件容易达到，填补了原子吸收光谱法不能测定HRP这一空白。
文档编号G01N21/31GK101551325SQ20091011409
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月23日 优先权日2009年5月23日
发明者轶 张, 静 张, 李建福, 梁爱惠, 汤亚芳, 范燕燕, 蒋治良 申请人:广西师范大学