专利名称：：一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法，用于检测谷胱甘肽硫转移酶类家族MU类(GSTM1基因)缺失、THETA类(GSTT1基因)缺失和PI类(GSTP1)的变异，属于分子生物学
技术领域：
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背景技术：
：外源性化学物质包括治疗性药物、环境或职业密切接触的物质等。机体对外来化合物的代谢过程包括I相反应和II相反应，I相反应主要对外来化合物进行生物转化，如氧化、还原、水解反应。II相反应则对I相反应代谢活化后所产生的中间代谢产物与体内的化合物进行结合反应，如谷胱甘肽结合、葡糖醛酸化等反应。一般讲外来化合物经机体代谢后毒性降低或丧失，但亦有少数外来化合物经机体代谢后毒性增高，对人体产生危害。谷胱甘肽硫转移酶类家族GST在机体内行使功能和参与反应的途径是参与谷胱甘肽代谢通路。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽物质，并带有活性的巯基，主要存在于细胞液内，在机体和细胞内行使多种生化作用，具有重要的意义。谷胱甘肽的一个主要作用，是通过谷胱甘肽硫转移酶类家族的作用，使谷胱甘肽的半胱氨酸残基上具有很强亲核力的巯基基团，去与亲电子的靶物质结合。通过谷胱甘肽和化学物质或其代谢反应产物结合，可以降低这些物质的毒性，从而使细胞免受损害。谷胱甘肽所结合的亲电子物质包括很多种，如致癌物质、药物、环境毒素、氧化链产物等等。常见的药物结合底物包括水杨酸盐、扑热息痛、抗痨药、利尿酸、苯巴比妥、有机磷农药、抗肿瘤药物等。当谷胱甘肽与多种氧化链代谢产物反应后，产生的减毒结合物可使其易于进入下一步代谢，并最后以硫醇尿酸的形式排泄出体外。大样本量中国人群研究证实，谷胱甘肽硫转移酶类家族MU类(GSTM1基因)缺失、THETA类(GSTT1基因)缺失和PI类(GSTP1)变异在中国人群众普遍存在(GSTM1缺失64X、GSTT1缺失55%、GSTP111el05Val变异29%)与谷胱甘肽硫转移酶活性以及多种毒物、药物的代谢显著相关。以往的检测方法在对GSTM1和GSTT1的大片段缺失进行检测时出现的假阳性现象无法很好的排查和解释，本发明中增加了一对内参因物的设计避免了这一现象，同时适用于大样本量的谷胱甘肽硫转移酶基因分型检测。
发明内容本发明的目的是提供一种准确率高的谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法。为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为步骤1.检测的样品类型与采样方法用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时一2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；步骤3.基因分型采用PCR技术、凝胶电泳技术以及荧光定量PCR技术对谷胱甘肽硫转移酶类家族MU类GSTM1基因、THETA类GSTT1基因和PI类GSTPl基因位点进行分型步骤3-1，PCR反应体系将每一个被测者样本放入1个反应孔，加入PCR标准反应体系，同时检测GSTM1和GSTT1基因，Albumin基因作为阳性对照，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，由PCR试剂5ul，GSTMl基因、GSTTl基因和Albumin基因的正反向引物各0.4ul，20ng/ii1的步骤2得到的DNA模板3y1和去离子水9.6ul组成；GSTM1基因正向和反向引物正向引物GAACTCCCTGAAAAGCTAAGC反向引物GTTGGGCTCAAATATACGGTGGGSTT1基因正向和反向引物正向引物TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC反向引物TCACCGGATCATGGCCAGCAAlbumin基因正向和反向引物正向引物GCCCTCTGCTAACAAGTCCTAC反向引物GCCCTAAAAAGAAAATCCCCAATC步骤3-2，PCR反应条件将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95。C预热15分钟；再进行35个循环的95°C、45秒；60。C、45秒；72。C、60秒；72。C、7分钟后，降温至4°C;步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测a.1%琼脂糖凝胶插小号孔梳子；b.2000bpDNA标记物6ul;c.步骤3-2的PCR产物10ul加入电泳缓冲液lul;d.电泳电压:120v;e.电泳时间20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；GSTM1基因目的条带为219bp;GSTT1基因目的条带为480bp;Alb咖in基因目的条带为350bp;步骤3-4，荧光定量PCR反应将每一个被测者样本放入1个反应孔，检测GSTPlrsl695位点基因多态性，并增设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10iU，即浓度为20ng/iil的DNA模板2iU、10X荧光定量PCR反应缓冲液1iil、25mM合成DNA的四种脱氧核苷酸底物dNTP0.liil、25mM氯化镁溶液0.5iU、TaqDNA聚合酶0.02iU、20yM的正向引物和反向引物各0.5ill、10iiM的带VIC荧光A型探针和带FAM荧光G型探针各0.25和去离子水4.88ill;其中，带FAM荧光G型探针序列为TGCAAATACaTCTCCC，带FAM荧光G型探针序列为TGCAAATACgTCTCCC,GSTPl基因正向引物为CCTGGTGGACATGGTGAATGAC,反向引物为CCGCCTCATAGTTGGTGTAGATG;将反应孔和空白对照孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热5(TC、2分钟，95°C、10分钟，然后再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟，反应结束，取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到在谷胱甘肽硫转移酶Plrsl695图；步骤4:数据读取在步骤3-3中得到的电泳图中，观察GSTM1基因以及GSTM1基因是否缺失；将步骤3-4得到的谷胱甘肽硫转移酶Plrs1695图与NTC空白对照进行比较，存在纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型，即AA基因型、AG基因型和GG基因型；若检测结果点位于坐标轴左上区域，则为GG基因型，若检测结果点位于坐标轴右上区域，则为AG基因型，若检测结果点位于坐标轴右下区域，则为AA基因型；若为GG基因型，谷胱甘肽硫转移酶活性低。本发明所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本发明3个位点的基因分型分别采用PCR技术、凝胶电泳技术以及TaqMan^MGB技术进行分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了99%以上，重复性达到了100%。本发明的优点是检测准确率高，可重复性强。图1为谷胱甘肽硫转移酶Ml(GSTM1)和谷胱甘肽硫转移酶Tl(GSTT1)示意图；图2为谷胱甘肽硫转移酶Pl(GSTPl)rs1695示意图。具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例—种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法步骤1.检测的样品类型与采样方法用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时-2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；步骤3.基因分型采用PCR技术、凝胶电泳技术以及荧光定量PCR技术(TaqManlMGB技术)对谷胱甘肽硫转移酶类家族MU类(GSTM1基因)、THETA类(GSTT1基因)和PI类(GSTP1基因)位点进行分型；步骤3-1，PCR反应体系将每一个被测者样本放入1个反应孔，加入PCR标准反应体系，同时检测GSTM1和GSTT1基因，Albumin基因作为阳性对照，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，由PCR试齐U(天根生化KT202-12)5ul，GSTM1基因、GSTT1基因和Albumin基因的正反向引物各0.4ul，20ng/ii1的步骤2得到的DNA模板3y1和去离子水9.6ul组成；GSTM1基因正向和反向引物正向引物GAACTCCCTGAAAAGCTAAGC反向引物GTTGGGCTCAAATATACGGTGGGSTT1基因正向和反向引物正向引物TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC反向引物TCACCGGATCATGGCCAGCAAlbumin基因正向和反向引物正向引物GCCCTCTGCTAACAAGTCCTAC反向引物GCCCTAAAAAGAAAATCCCCAATC步骤3-2，PCR反应条件将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95。C预热15分钟；再进行35个循环的95°C、45秒；60。C、45秒；72。C、60秒；72。C、7分钟后，降温至4°C;步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测a.1%琼脂糖凝胶插小号孔梳子；b.2000bpDNA标记物(天根生化MD114-02)6ul;c.步骤3-2的PCR产物10ul加入电泳缓冲液(天根生化RT201-01)lul;d.电泳电压:120v;e.电泳时间20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；GSTM1基因目的条带为219bp;GSTT1基因目的条带为480bp;Albumin基因目的条带为350bp。如图1所示，为谷胱甘肽硫转移酶M1(GSTM1)和谷胱甘肽硫转移酶T1(GSTT1)示意图。步骤3-4，荧光定量PCR反应将每一个被测者样本放入1个反应孔，检测GSTP1rsl695位点基因多态性，30个被测者样本就有30个反应孔，并增设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为lOiU，即浓度为20ng/ii1的DNA模板2、110X荧光定量PCR反应缓冲液(ABITaqmant>MGB)、0.liil25mMdNTP合成DNA的四种脱氧核苷酸底物、0.5ii125mMMgC12溶液、0.02ii1TaqDNA聚合酶、20yM的正向引物和反向弓|物各0.5、10iiM的VIC和FAM荧光探针各0.25iU，去离子水4.88iU;本发明位点的基因分型可以根据下表的引物和探针设计。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>将反应孔和空白对照孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50°C、2分钟，95°C、10分钟，然后再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟，反应结束，取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，并将被测者样本谷胱甘肽硫转移酶PI(GSTPl)rs1695位点的数据对号入座到图2中；图2为谷胱甘肽硫转移酶PI(GSTP1)rsl695示意图;步骤4:数据读取ABI7900型荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的图和NTC空白对照进行比较，理论上存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型，即AA基因型、AG基因型和GG基因型。在谷胱甘肽硫转移酶Pl(GSTPl)rs1695图中，若检测结果点位于坐标轴左上区域，则为GG基因型，若检测结果点位于坐标轴右上区域，则为AG基因型，若检测结果点位于坐标轴右下区域，则为AA基因型；对于谷胱甘肽硫转移酶Pl(GSTPl)rsl695，GG为风险基因型，携带风险基因型时第105位氨基酸由Ile变为Val，目前研究表明这种氨基酸的变化，影响到了GSTP1多肽晶体结构，使亲电子结合位点处氨基酸的空间距离和结构发生了改变，影响了基因的功能。步骤5:被测者检测报告如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>WH矚聚霄銜豕1,您鹼检漏籍果,未黧現Gsnn基國ffft缺失，2,鹩的纖鑌暴中未纖隨i基园被敏失，3,您的GSTPlKl隨S基國缰为GG,为风险基园璽，与携带M鄴A6基园a翁人群賴比，魯饞甘黢硫转移酶潘性Wi,位点序列的确定根据文献提供的位点序列信息和rs号，在NCBISNP数据库中进行检索比对，获得以上3个位点的参考序列如下1.GSTM1null皿ll基因型是一种整个基因丢失的多态。所丢失的是包括整个基因在内的15kb的片段。2.GSTP111el05Valrsl695CTCATCCTTCCACGCACATCCTCTTCCCCTCCTCCCAGGCTGGGGCTCAC50AGACAGCCCCCTGGTTGGCCCATCCCCAGTGACTGTGTGTTGATCAGGCG100CCCAGTCACGCGGCCTGCTCCCCTCCACCCAACCCCAGGGCTCTATGGGA150AGGACCAGCAGGAGGCAGCCCTGGTGGACATGGTGAATGACGGCGTGGAG200GACCTCCGCTGCAAATAC218A/GSNPTCTCCCTCATCTACACCAACTATGTGAGCATCTGCACCAGGGTTGGGCAC268TGGGGGCTGAACAAAGAAAGGGGCTTCTTGTGCCCTCACCCCCCTTACCC318CTCAGGTGGCTTGGGCTGACCCCTTCTTGGGTCAGGGTGCAGGGGCTGGG368TCAGCTCTGGGCCAGGGGCCCAGGGGCCTGGGACMGACACAACCTGCAC4183.GSTT1nullGSTT1皿ll基因型是一种整个基因丢失的多态。所丢失的是包括整个GSTT1基因在内的碱基片段。序列表〈110〉上海中优医药高科技有限公司〈120〉一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法〈160>9〈210>1〈211>410〈212>DNA〈213〉人(Homosapiens)〈220〉〈221〉mutation〈222〉(219)〈223〉n二a或g〈400>1ctcatccttccacgcacatcctcttcccctctggttggcccatccccagtgactgtgtgtccctccacccaaccccagggctctatgggatggtgaatgacggcgtggaggacctccgctatgtgagcatctgcaccagggttgggcactgccctcaccccccttacccctcaggtggctggggctgggtcagctctgggccaggggccc〈210>2〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉用于GSTM1null序列扩增的正向引物。〈400>2gaactccctgaaaagctaagc22〈210>3〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉cctcccaggctgatcaggcg3gg3CC3gC3gggggctg朋tgggctgacc鄉ggcctggtggggctcaccccagtcacgggaggcagccctccctcatcccttcttgggagacagcccccggcctgctcctggtggacatacaccaactggcttcttgttcagggtgca60120180240300360410:0133]:0134]〈223〉用于GSTM1null序列扩增的反向引物。〈400>3:0135]gttgggctcaaatatacggtgg:0136]〈210>4:0137]〈211>16:0138]<212>DNA:0139]〈213>人工序列:0140]〈220〉:0141]〈223〉带VIC荧光G型探针，与GSTPlrsl695SNP位点结合。:0142]〈400>4:0143]tgcaaatacatctccc16:0144]<210>5:0145]〈211>16:0146]〈212>DNA:0147]〈213>人工序列:0148]〈220〉:0149]〈223〉带FAM荧光A型探针，与GSTP1rsl695SNP位点结合。:0150]<400>5:0151]tgcaaatacgtctccc16:0152]〈210>6:0153]〈211>22:0154]〈212>DNA:0155]〈213>人工序列:0156]<220>:0157]〈223〉用于GSTPlrsl695SNP序列扩增的正向引物。:0158]〈400>6:0159]cctggtggacatggtgaatgac22:0160]〈210>7:0161]〈211>23:0162]<212>DNA:0163]〈213>人工序列:0164]〈220〉:0165]〈223〉用于GSTPlrsl695SNP序列扩增的反向引物。:0166]〈400>7:0167]ccgcctcatagttggtgtagatg23<210>8〈211>23〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223>用于GSTTlnull序列扩增的正向引物。〈400〉8ttccttactggtcctcacatetc〈210>9〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉用于GSTTlnull序列扩增的反向引物。〈400>9tcaccgg'atcatggccagca20权利要求一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为步骤1.检测的样品类型与采样方法用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；步骤2.基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时-2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；步骤3.基因分型采用PCR技术、凝胶电泳技术以及荧光定量PCR技术对谷胱甘肽硫转移酶类家族MU类GSTM1基因、THETA类GSTT1基因和PI类GSTP1基因位点进行分型步骤3-1，PCR反应体系将每一个被测者样本放入1个反应孔，加入PCR标准反应体系，同时检测GSTM1和GSTT1基因，Albumin基因作为阳性对照，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，由PCR试剂5ul，GSTM1基因、GSTT1基因和Albumin基因的正反向引物各0.4ul，20ng/μl的步骤2得到的DNA模板3μl和去离子水9.6ul组成；GSTM1基因正向和反向引物正向引物GAACTCCCTGAAAAGCTAAGC反向引物GTTGGGCTCAAATATACGGTGGGSTT1基因正向和反向引物正向引物TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC反向引物TCACCGGATCATGGCCAGCAAlbumin基因正向和反向引物正向引物GCCCTCTGCTAACAAGTCCTAC反向引物GCCCTAAAAAGAAAATCCCCAATC步骤3-2，PCR反应条件将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃预热15分钟；再进行35个循环的95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、60秒；72℃、7分钟后，降温至4℃；步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测a.1％琼脂糖凝胶插小号孔梳子；b.2000bpDNA标记物6ul；c.步骤3-2的PCR产物10ul加入电泳缓冲液1ul；d.电泳电压120v；e.电泳时间20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；GSTM1基因目的条带为219bp；GSTT1基因目的条带为480bp；Albumin基因目的条带为350bp；步骤3-4，荧光定量PCR反应将每一个被测者样本放入1个反应孔，检测GSTP1rs1695位点基因多态性，并增设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔；在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10μl，即浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、10×荧光定量PCR反应缓冲液1μl、25mM合成DNA的四种脱氧核苷酸底物dNTP0.1μl、25mM氯化镁溶液0.5μl、TaqDNA聚合酶0.02μl、20μM的正向引物和反向引物各0.5μl、10μM的带VIC荧光A型探针和带FAM荧光G型探针各0.25μl和去离子水4.88μl；其中，带FAM荧光G型探针序列为TGCAAATACaTCTCCC，带FAM荧光G型探针序列为TGCAAATACgTCTCCC，GSTP1基因正向引物为CCTGGTGGACATGGTGAATGAC，反向引物为CCGCCTCATAGTTGGTGTAGATG；将反应孔和空白对照孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟，反应结束，取出后再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到在谷胱甘肽硫转移酶P1rs1695图；步骤4数据读取在步骤3-3中得到的电泳图中，观察GSTM1基因以及GSTM1基因是否缺失；若存在GSTM1基因缺失或GSTM1基因缺失，谷胱甘肽硫转移酶活性低；将步骤3-4得到的谷胱甘肽硫转移酶P1rs1695图与NTC空白对照进行比较，存在纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型，即AA基因型、AG基因型和GG基因型；若检测结果点位于坐标轴左上区域，则为GG基因型，若检测结果点位于坐标轴右上区域，则为AG基因型，若检测结果点位于坐标轴右下区域，则为AA基因型；若为GG基因型，谷胱甘肽硫转移酶活性低。全文摘要本发明提供了一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为采集被测者口腔粘膜样本，抽提基因组DNA，基因分型和结果分析。本发明所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本发明3个位点的基因分型分别采用PCR技术、凝胶电泳技术以及TaqMan-MGB技术进行分型。经实验验证，基因分型的准确率达到了99％以上，重复性达到了100％。文档编号G01N27/447GK101693920SQ20091019695公开日2010年4月14日申请日期2009年10月10日优先权日2009年10月10日发明者傅咏南,毛丹丹申请人:上海中优医药高科技有限公司;