专利名称：：基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法
技术领域：
：本发明属于食品安全检测
技术领域：
，具体涉及一种基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法。
背景技术：
：农药残留色谱检测是复杂混合物中痕量组分的分析，基质效应问题的影响异常显著。农药残留分析过程中的基质效应，即样品中除分析物以外的其它基质成分导致待测物测定值偏离真值，影响待测物的定量准确度和精密度，且影响因素多变，很难被完全消除，严重影响检测结果的准确性。在气相色谱分析中大多数农药，表现出不同程度的基质增强效应，尤其是有机磷类农药的基质效应非常明显，如高脂肪含量样品中有机磷农药的检测，多数含P=0基团的农药回收率会超过130%，这种现象称为基质引起的响应值增强效应。茶叶因其作为多年生木本植物及后续加工过程的繁复，样品基质背景异常丰富，样品基质的影响本就比一般水果蔬菜要复杂得多，基质效应的影响更是相当复杂。基质效应增大随机误差及系统误差，影响分析的准确度和灵敏度，严重影响农残测定准确定量和正确定性。现在，国外用来弥补基质效应的较常见有基质匹配标准校正法。如1993年ErneyDR等对有机磷农药的气相色谱基质增强效应研究；1998年KocourekV等对农药在植物提取基质中的稳定性研究；2004年Martinez.VidalJL等对在6种食品中气质联用测定农残品评价的研究。目前国外许多农残方法开发都使用基质匹配标准来进行校准，以使标样中的基质环境与样品中的相同，但是要取得与每一种样品严格匹配的基质，这对于常规实验室的大量的日常工作来说是不现实的。弥补基质效应另外还有标准添加法、多重净化法、校正因子校准法等多种方法。如2001年PodhomiakLV等气谱pfpd测定典型果蔬基质中有机磷农残的研究；2001年SchenckFJ等深度净化减少气谱对食品中农残测定的基质效应的研究；2002年Gonz-lez等气谱ecd测定典型蔬菜中农药多残留的基质效应研究、2003年Martinez-GaleraM等用标准曲线相对校正蔬菜中pyrethroids的定量测定的系统误差；2003年FerndndezGonzdlezC等气质联用测定白葡萄中的杀真菌剂的研究；2004年AlberoB等spe、气质联用测定蜂蜜中农残测定研究；2005年ConsueloS等用基质保护剂抵消基质效应法对农残气质联用的测定研究。目前国内对此问题的研究较少，目前国内许多的农药残留分析方法的开发大多还没有对基质效应所产生的影响给予足够重视，也没有采取相应的补偿措施。仅有2006年赵海峰用气质联用测定蔬菜中的农残研究，以基质匹配标准进行校正基质增强效应；2006年黄宝勇用气质联用测定果蔬中农药多残留研究，进行了农药单浓度的基质效应研究和基质保护剂探索等几篇研究报道。由于基质效应的产生对于化合物的准确定性与定量具有较大影响，所以对基质效应进行考察评估并采取有效措施进行消除或补偿是进行农药残留分析方法开发或方法验证过程中不可缺少的一个重要环节，是要获得更为精确和准确的结果必须考虑到的一个基4本的前提。
发明内容针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速、简单、经济、灵敏度高，且能够有效地减小或消除了来自茶叶的复杂基质给有机磷农药残留测定的干扰的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法。所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于包括以下步骤1)农药标准溶液配制a.农药混合标准储备溶液配制称取各种有机磷类农药标准品，用丙酮稀释，逐一配制成1000mg/L的单一农药标准储备液，根据各农药的仪器响应，用丙酮配制成混合标准储备溶液；b.基质保护剂溶液配制将果糖在水中溶解后，用丙酮定容，配制成浓度为35-45mg/mL的基质保护剂A，将L_古洛糖酸-y-内酯在水中溶解后，用丙酮定容，配制成浓度为15-25mg/mL的基质保护剂B;c.农药混合标准工作液配制取1.OmL农药混合标准储备溶液，加入基质保护剂A0.05-0.15mL和B0.05_0.15mL配制成农药混合标准工作液，备用；2)样品溶液制备a.试料制备取茶叶样品，经粉碎机粉碎后，制成待测样，备用；b.待测样品提取取待测样4g，加入10-15ml丙酮，在振荡器中快速振荡5_15分钟，然后在离心机转速3500-5000rpm条件下离心10_15min，取上清液；c.净化取5ml上清液，旋转真空浓縮直至上清液近干后，用丙酮溶解定容至2.0ml，再转移至离心管中，并在离心管中加入(C18)80-120mg，在旋涡混合器上混匀2-4min，然后在离心机转速3500-5000rpm条件下离心5-10min，离心后取上清液1ml，最后加入基质保护剂A0.05-0.15mL和B0.05_0.15mL，供色谱测定；3)由气相色谱测定待测样和混合标准溶液a.测定由自动进样器吸取1.0L农药混合标准工作液和经净化后的待测样注入色谱仪中，以双柱保留时间定性，以分析柱A获得的样品溶液峰面积与标准溶液峰面积定量；b.结果分析双柱测得的样品中未知组分的保留时间分别与标样在同一色谱柱上的保留时间相比较，如果样品中某组分的两组保留时间与标准中某一农药的两组保留时间相差都在±0.05min内的可认定为该农药；样品中被测农药残留量以质量分数"计，计算公式如下0>=丄av』Xy式中标准溶液中农药的含量，单位为毫克/升(mg/L);A-样品中被测农药的峰面积；As_农药标准溶液中被测农药的峰面积；5V「提取溶剂总体积；V2_吸取出用于检测的提取溶液的体积；Vf样品定容体积；m-样品的质量。所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤l)中称取敌百虫、敌敌畏、甲胺磷、速灭磷、乙酰甲胺磷、丙线磷、甲拌磷、氧乐果、百治磷、乙拌磷、胺丙畏、异稻瘟净、除线磷、久效磷、乐果、磷胺、皮蝇磷、甲基嘧啶硫磷、毒死蜱、甲基对硫磷、嘧啶磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、乙基溴硫磷、水胺硫磷、稻丰散、杀虫畏、灭菌磷、甲基硫环磷、乙硫磷、三唑磷、伐灭磷、苯硫磷、亚胺硫磷、伏杀硫磷、谷硫磷、吡菌磷、益棉磷、蝇毒磷、二溴磷、治螟磷、二嗪农、地虫硫磷、地毒磷、倍硫磷、溴硫磷、对氧磷、异柳磷、丙溴磷和硫环磷农药标准品，逐一用丙酮稀释，配制成51种农药1000mg/L的单一农药标准储备液，并用丙酮配制成混合标准储备溶液；待色谱测定时，取1.OmL农药混合标准储备溶液，加入基质保护剂A0.lmL和B0.lmL配制成农药混合标准工作液。所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤1)中步骤b在果糖1.75-2.25g中加水8.5mL溶解，再用丙酮定容至50mL，制得浓度为35-45mg/mL的基质保护剂A;在L-古洛糖酸_Y_内酉旨0.75-1.25g中加水10mL溶解，再用丙酮定容至50mL，制得浓度为15-25mg/mL的基质保护剂B。所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤2)中步骤b离心采用4000rpm条件下离心10min。所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤2)中步骤c离心采用4000rpm条件下离心5min。所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤2)中步骤c离心后取上清液lml，最后加入基质保护剂A0.lmL和B0.lmL，供色谱测定；净化后的待测样过于混浊，用0.2ym滤膜过滤后再进行色谱测定。所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤3)中气相色谱条件为色谱柱预柱，1.Om，O.32mm内径，脱活石英毛细管柱，采用两根色谱柱，分别为A柱50X聚苯基甲基硅氧烷柱，30mX0.32mmX0.25iim，B柱100X聚甲基硅氧烷柱，30mX0.32mmX0.25iim;温度进样口温度为22(TC，检测器温度为250°C;升温程序初始为8(TC，保持lmin后，以15°C/min升温速度升到220。C，保持lmin;然后以20°C/min升温速度升到250。C，保持7min;气体及流量载气氮气，纯度^99.999%，流速为10mL/min，燃气氢气，纯度^99.999%，流速为75mL/min，助燃气空气，流速为100mL/min;进样方式不分流进样。所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的各种农药的纯度大于等于96%。本发明的原理样品中有机磷类农药经丙酮提取，提取溶液经基质分散萃取净化、浓縮后，加入基质保护剂，用双塔自动进样器同时注入气相色谱的两个进样口，样品中组分经不同极性的两根毛细管柱分离，火焰光度检测器(FPD)检测。外标法定性、定量。本发明用丙酮试剂提取茶叶中有机磷农药残留后，用C18进行分散固相萃取净化；在前提取净化溶液中加入基质保护剂-果糖和古洛糖酸内酯的混和物以补偿基质效应；用气相色谱-火焰光度检测器进行测定，提高了51种有机磷农残检测正确度，最低检出限降低至0.005mg/L-0.02mg/L;并且在一定程度上延长了仪器维护周期，减少仪器维护成本。该方法快速、简单、经济、灵敏度高，有效地减小或消除了来自茶叶的复杂基质给有机磷农药残留测定的干扰，为进一步完善茶叶质量安全的评价体系提供了科学依据。本发明与现有技术相比存在的优点为(1)本发明提出了可代替基质匹配标准校正的基质保护剂1种(果糖和古洛糖酸内酯)，以替代繁琐的基质匹配标准校正的补偿基质效应的方法，操作简便快速经济，容易掌握，方法加标回收率80-110%，RSD0.986.6%，足以满足日常农药残留检测要求。(2)本发明加入基质保护剂提高了茶园中常用和茶叶出口常检的有机磷农药_甲胺磷、乙酰甲胺磷、毒死蜱、乐果、水胺硫磷、马拉硫磷、异稻瘟净等51种有机磷农残检测正确度，如(同浓度样品/标样)甲胺磷8.31倍增强，乙酰甲胺磷4.90倍增强等有机磷农药都校正至1左右，有效地减小或消除了来自茶叶的复杂基质给有机磷农药残留测定的干扰。(3)本发明加入基质保护剂还能改善目标有机磷农药的峰形，使其信噪比得到显著改善，降低51种有机磷农残的检测限至0.005-0.02mg/kg，提高了茶叶中有机磷农药残留检测的灵敏度。(4)本发明一定程度上延长了仪器维护周期，使气相色谱仪日常每100个样品必须进行1次日常保养维护增加至每150-200个样品进行1次日常保养维护，减少仪器维护成本，提高了检测效率。图1为应用本发明的方法对添加了13种有机磷农药的空白茶叶样品进行有机磷农药残留检测得到的色谱图。图中1-甲胺磷，2_乙酰甲胺磷，3_甲拌磷，4-氧乐果，5-乐果，6_甲基对硫磷，7-杀螟硫磷，8-对硫磷，9-水胺硫磷，10-杀扑磷，11-乙硫磷，12-三硫磷，13-三唑磷。具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步说明本发明。实施例1.农药标准溶液配制单一农药标准储备液准确称取一定量某农药标准品，用丙酮稀释，逐一配制成51种农药1000mg/L的单一农药标准储备液，贮存在_18°C以下冰箱中。农药混合标准储备溶液及农药混合标准工作液将51种农药分为2组，按照表1中组别，根据分离效率把51种有机磷农药分成2组，根据各农药的仪器响应，逐一吸取一定体积的同组别的单个农药储备液分别注入同一容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，采用同样方法配制成2组农药混合标准储备溶液。待色谱测定时，取l.OmL农药混合标准储备溶液，加入基质保护剂A0.ImL和B0.ImL配置成农药混合标准工作液，或加入基质保护剂A0.05mL和B0.lmL，或基质保护剂A0.ImL和B0.15mL，或基质保护剂A0.15mL和B0.15mL。表l51种有机磷农药列表及分组<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.基质保护剂溶液配制称取果糖2g加水8.5mL溶解，用丙酮定容至50mL，记为基质保护剂A;称取L_古洛糖酸_Y_内酯lg加水10mL溶解，用丙酮定容至50mL，记为基质保护剂B。贮存在4"C左右冰箱中待用。也可配制成35、40或45mg/mL的基质保护剂A和15、20或25mg/mL的基质保护剂B3.分析步骤3.1试料制备取不少于100g茶叶样品，放入粉碎机中粉碎，制成待测样，放入分装容器中备用。3.2提取准确称取4.0g试料放人15mL离心管中，加入10mL或12ml丙酮，在振荡器中上快速振荡10或15min，后用离心机4000或5000rpm离心10或15min，取上清液待净化。3.3净化取5.OmL上清液旋转真空浓縮近干，用丙酮溶解准确定容至2.OmL，并转移至5mL离心管中，加入C1880、100或120mg，旋涡混合器上混匀2min后，在离心机上4000或5000rpm离心5或10min，取上清液1.OmL，加入基质保护剂A0.lmL和B0.lmL，或加入基质保护剂A0.05mL和B0.lmL，或基质保护剂A0.ImL和B0.15mL，或基质保护剂A0.15mL禾口B0.15mL。供色谱测定。如样品过于混浊，应用0.2iim滤膜过滤后再进行测定。3.4测定3.4.1色谱参考条件3.4.1.1色谱柱预柱，1.Om，0.32mm内径，脱活石英毛细管柱。采用两根色谱柱，分别为A柱50%聚苯基甲基硅氧烷(DB-1701)柱，30mX0.32mmX0.25iim;B柱100%聚甲基硅氧烷(DB-1)柱，30mX0.32mmX0.25iim。3.4.1.2温度进样口温度，220。C。检测器温度，25(TC;升温程序初始为80°C(保持lmin)以15°C/min升温速度升到220°C(保持lmin);然后以20°C/min升温速度升到250°C(保持7min)。3.4.1.3气体及流量载气氮气，纯度^99.999%，流速为10mL/min。燃气氢气，纯度^99.999%，流速为75mL/min。助燃气空气，流速为100mL/min。3.4.1.4进样方式不分流进样。样品一式两份，由双塔自动进样器同时进样。3.4.2色谱分析由自动进样器吸取1.0iiL标准混合溶液(或净化后的样品)注入色谱仪中，以双柱保留时间定性，以分析柱A获得的样品溶液峰面积与标准溶液峰面积比较定量。4.结果表述4.l定性双柱测得的样品中未知组分的保留时间(RT)分别与标样在同一色谱柱上的保留时间(RT)相比较，如果样品中某组分的两组保留时间与标准中某一农药的两组保留时间相差都在±0.05min内的可认定为该农药。4.2计算样品中被测农药残留量以质量分数"计，数值以毫克每千克(mg/kg)表示，按公式(1)计算。V、XAXV、出=.人4v.」Xy…-………-'…......'，.............11式中标准溶液中农药的含量，单位为毫克/升(mg/L);A-样品中被测农药的峰面积；As_农药标准溶液中被测农药的峰面积；V「提取溶剂总体积；V2_吸取出用于检测的提取溶液的体积；Vf样品定容体积；m-样品的质量。计算结果保留三位有效数。(1)应用上述的方法对添加了13种有机磷农药的空白茶叶样品进行有机磷农药残留检测，色谱图见图1，检测结果见表2。表2添加样品检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2)应用上述的方法对市场上的53个不同的茶叶样品(范围覆盖绿茶、红茶、乌龙、普洱等)进行了有机磷农药残留检测，结果在15个样品中检测到ll种有机磷农药残留，具体结果见表3。表3实际样品中有机磷农药残留检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于包括以下步骤1)农药标准溶液配制a.农药混合标准储备溶液配制称取各种有机磷类农药标准品，用丙酮稀释，逐一配制成1000mg/L的单一农药标准储备液，根据各农药的仪器响应，用丙酮配制成混合标准储备溶液；b.基质保护剂溶液配制将果糖在水中溶解后，用丙酮定容，配制成浓度为35-45mg/mL的基质保护剂A，将L-古洛糖酸-γ-内酯在水中溶解后，用丙酮定容，配制成浓度为15-25mg/mL的基质保护剂B；c.农药混合标准工作液配制取1.0mL农药混合标准储备溶液，加入基质保护剂A0.05-0.15mL和B0.05-0.15mL配制成农药混合标准工作液，备用；2)样品溶液制备a.试料制备取茶叶样品，经粉碎机粉碎后，制成待测样，备用；b.待测样品提取取待测样4g，加入10-15ml丙酮，在振荡器中快速振荡10-15分钟，然后在离心机转速3500-5000rpm条件下离心10-15min，取上清液；c.净化取5ml上清液，旋转真空浓缩直至上清液近干后，用丙酮溶解定容至2.0ml，再转移至离心管中，并在离心管中加入(C18)80-120mg，在旋涡混合器上混匀2-4min，然后在离心机转速3500-5000rpm条件下离心5-10min，离心后取上清液1ml，最后加入基质保护剂A0.05-0.15mL和B0.05-0.15mL，供色谱测定；3)由气相色谱测定待测样和混合标准溶液a.测定由自动进样器吸取1.0μL农药混合标准工作液和经净化后的待测样注入色谱仪中，以双柱保留时间定性，以分析柱A获得的样品溶液峰面积与标准溶液峰面积定量；b.结果分析双柱测得的样品中未知组分的保留时间分别与标样在同一色谱柱上的保留时间相比较，如果样品中某组分的两组保留时间与标准中某一农药的两组保留时间相差都在±0.05min内的可认定为该农药；样品中被测农药残留量以质量分数ω计，计算公式如下<mrow><mi>ω</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><msub><mi>V</mi><mn>1</mn></msub><mo>×</mo><mi>A</mi><mo>×</mo><msub><mi>V</mi><mn>3</mn></msub></mrow><mrow><msub><mi>V</mi><mn>2</mn></msub><mo>×</mo><msub><mi>A</mi><mn>5</mn></msub><mo>×</mo><mi>m</mi></mrow></mfrac><mo>×</mo><mi>Ψ</mi></mrow>式中Ψ-标准溶液中农药的含量，单位为毫克/升(mg/L)；A-样品中被测农药的峰面积；As-农药标准溶液中被测农药的峰面积；V1-提取溶剂总体积；V2-吸取出用于检测的提取溶液的体积；V3-样品定容体积；m-样品的质量。2.如权利要求1所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤l)中称取敌百虫、敌敌畏、甲胺磷、速灭磷、乙酰甲胺磷、丙线磷、甲拌磷、氧乐果、百治磷、乙拌磷、胺丙畏、异稻瘟净、除线磷、久效磷、乐果、磷胺、皮蝇磷、甲基嘧啶硫磷、毒死蜱、甲基对硫磷、嘧啶磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、乙基溴硫磷、水胺硫磷、稻丰散、杀虫畏、灭菌磷、甲基硫环磷、乙硫磷、三唑磷、伐灭磷、苯硫磷、亚胺硫磷、伏杀硫磷、谷硫磷、吡菌磷、益棉磷、蝇毒磷、二溴磷、治螟磷、二嗪农、地虫硫磷、地毒磷、倍硫磷、溴硫磷、对氧磷、异柳磷、丙溴磷和硫环磷农药标准品，逐一用丙酮稀释，配制成51种农药1000mg/L的单一农药标准储备液，并用丙酮配制成混合标准储备溶液；待色谱测定时，取l.OmL农药混合标准储备溶液，加入基质保护剂A0.lmL和B0.lmL配制成农药混合标准工作液。3.如权利要求1所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤1)中步骤b在果糖1.75-2.25g中加水8.5mL溶解，再用丙酮定容至50mL，制得浓度为35-45mg/mL的基质保护剂A;在L-古洛糖酸-y-内酯0.75-1.25g中加水10mL溶解，再用丙酮定容至50mL，制得浓度为15-25mg/mL的基质保护剂B。4.如权利要求1所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤2)中步骤b离心采用4000rpm条件下离心10min。5.如权利要求1所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤2)中步骤c离心采用4000rpm条件下离心5min。6.如权利要求1所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤2)中步骤c离心后取上清液lml，最后加入基质保护剂A0.lmL和B0.lmL，供色谱测定；净化后的待测样过于混浊，用0.2ym滤膜过滤后再进行色谱测定。7.如权利要求1所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的步骤3)中气相色谱条件为色谱柱预柱，1.0m，0.32mm内径，脱活石英毛细管柱，采用两根色谱柱，分别为A柱50X聚苯基甲基硅氧烷柱，30mX0.32mmX0.25iim，B柱100X聚甲基硅氧烷柱，30mX0.32mmX0.25iim;温度进样口温度为22(TC，检测器温度为250°C;升温程序初始为80°C，保持lmin后，以15°C/min升温速度升到220°C，保持lmin;然后以20°C/min升温速度升到25(TC，保持7min;气体及流量载气氮气，纯度^99.999%，流速为10mL/min，燃气氢气，纯度^99.999%，流速为75mL/min，助燃气空气，流速为100mL/min;进样方式不分流进样。8.如权利要求2所述的基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，其特征在于所述的各种农药的纯度大于等于96%。全文摘要基于基质效应补偿的茶叶中有机磷类多农残测定方法，属于食品安全检测
技术领域：
。本发明包括以下步骤1)农药标准溶液配制，2)样品溶液制备，3)由气相色谱测定待测样和混合标准溶液，该方法快速、简单、经济、灵敏度高，有效地减小或消除了来自茶叶的复杂基质给有机磷农药残留测定的干扰，为进一步完善茶叶质量安全的评价体系提供了科学依据。文档编号G01N1/38GK101782558SQ201010108788公开日2010年7月21日申请日期2010年2月9日优先权日2010年2月9日发明者刘新,段俊彦,汪庆华,蒋迎,陈红平申请人:中国农业科学院茶叶研究所