水溶性寡肽的萃取方法及测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种水溶性寡肽的萃取方法，包括：制备含水溶性寡肽的给出相溶液；将附着有阳离子载体中间相的中空纤维膜的一端热封，向所述中空纤维膜内缓慢注射接收相溶液，并热封所述中空纤维膜的另一端，制备成离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置；将所述离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置转移至装有所述给出相溶液的容器中并振荡一段时间，进而把水溶性寡肽从所述给出相溶液萃取到接收相溶液。本发明还公开了一种水溶性寡肽血浆样品的测定方法。通过上述实施方式，水溶性寡肽富集倍数高，有利于提高水溶性寡肽的分析效率。
【专利说明】
水溶性寡肽的萃取方法及测定方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种水溶性寡肽的萃取方法及测定方法。
【背景技术】
[0002]水溶性肽生物样品因其含量低、杂质多和不易被有机溶剂萃取等特点，其快速萃取、富集和准确定量分析是目前水溶性肽生物样品检测的难点。目前水溶性肽生物样品多采用化学方法或有机溶剂方法去除蛋白后旋转蒸发或氮吹等去除有机溶剂的提取方式。存在费时费力、去除杂质效果不好、基质效应高，水溶性肽浓度低等缺点。
[0003]肽类分析物的分析方法主要包括免疫法、高效液相色谱法(HPLC)电泳法(CE)和液相色谱-质谱法(HPLC-MS)等，其中HPLC是肽类分析物含量测定应用最广泛的技术，反相高效液相色谱法(RP-HPLC)用于寡肽分析具有成本低、操作简单、较高的分辨率，能够应用于大量样品分析等优点。但是，当生物基质中肽的浓度很低，结构与内源性物质非常接近或相似时，HPLC灵敏度低、特异性不强的缺点会凸显，因此需要一个高效、灵敏的前处理过程。然而，常规液相萃取方法并不适用从生物样品中萃取水溶性肽。
【发明内容】
[0004]本发明为解决上述技术问题提供一种水溶性寡肽的萃取方法及测定方法，该萃取方法使水溶性寡肽富集倍数高，有利于提高水溶性寡肽的分析效率。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供一种水溶性寡肽的萃取方法，包括如下步骤:制备含水溶性寡肽的给出相溶液;将附着有阳离子载体中间相的中空纤维膜的一端热封，向所述中空纤维膜内缓慢注射接收相溶液，并热封所述中空纤维膜的另一端，制备成离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置;将所述离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置转移至装有所述给出相溶液的容器中并振荡一段时间，进而把水溶性寡肽从所述给出相溶液萃取到接收相溶液。
[0006]进一步地，在制备含水溶性寡肽的给出相溶液的步骤之中，包括:取适量含水溶性寡肽的溶液并进行蛋白沉淀;对所述溶液进行离心分离后取上清液；向所述上清液中加入缓冲液调节PH值至适量值以作为所述给出相溶液。
[0007]进一步地，所述水溶性寡肽是降血压肽，所述溶液是血浆；在进行沉淀的步骤之中，具体为:对所述血浆进行醇沉淀，其中，向所述血浆中加入甲醇并调配至血浆:甲醇的比例为1: 3?1: 5以进行醇沉淀；在对所述血浆进行醇沉淀的步骤之后，包括:将所述血浆摇匀，并冷却至4±0.5°C。
[0008]进一步地，在对所述血楽进行离心分离后取上清液的步骤之中:在转速12000rpm、时长5min、温度4°C的条件下进行离心分离。
[0009]进一步地，在向所述上清液中加入缓冲液调节pH值至适量值的步骤之中:用添加氢氧化钠的磷酸盐缓冲液调节所述上清液的PH值至9-13。
[0010]进一步地，在将附着有阳离子载体中间相的中空纤维膜的一端热封的步骤之中，具体为:将所述中空纤维膜在室温下浸入含有阳离子载体的有机溶液中间相5-8min后取出；在将所述中空纤维膜转移至装有所述给出相溶液的容器中并振荡一段时间中，采用涡旋振荡仪振荡10-90min。
[00?1 ]进一步地，所述阳离子载体为al iguat336，其浓度范围为1%_20%;所述有机溶剂选用正辛醇、甲苯、二甲苯和邻苯二甲酸二丁酯中的一种。
[0012]进一步地，所述接收相溶液为添加盐酸的pH值为1-5、浓度为lm0l/L-4m0l/L的NaCl溶液。
[0013]为完整解决上述技术问题，本发明还提供一种水溶性寡肽的测定方法，包括如下步骤:制备含水溶性寡肽的给出相溶液;将附着有阳离子载体中间相的中空纤维膜的一端热封，向所述中空纤维膜内缓慢注射接收相溶液，并热封所述中空纤维膜的另一端，制备成离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置;将所述离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置转移至装有所述给出相溶液的容器中并振荡一段时间，进而把水溶性寡肽从所述给出相溶液萃取到接收相溶液;吸取一定量的接收相溶液并注入装有衬管的液相瓶中；将所述接收相溶液稀释5-10倍后进行高效液相色谱检测。
[0014]进一步地，所述高效液相色谱检测的色谱条件为流动相为各含有0.1%TFA的乙腈和水，所述乙腈与所述水的比例为18:82，流速ImL.min—1，检测波长202nm，柱温35 °C，1yL进样。
[0015]本发明实施方式的水溶性寡肽的萃取方法及测定方法，该萃取方法使水溶性寡肽富集倍数高，有利于提高水溶性寡肽的分析效率。
【附图说明】
[0016]图1是本发明水溶性寡肽的萃取方法实施方式的流程图。
[0017]图2是图1所示水溶性寡肽的萃取方法中制备含水溶性寡肽的给出相溶液的流程图。
[0018]图3是本发明水溶性寡肽的测定方法实施方式的流程图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和实施方式对本发明进行详细说明。
[0020]参阅图1，本发明提供一种水溶性寡肽的萃取方法。该方法包括如下步骤:
步骤SI，制备含水溶性寡肽的给出相溶液。
[0021]步骤S2，将附着有阳离子载体中间相的中空纤维膜的一端热封，向中空纤维膜内缓慢注射接收相溶液，并热封中空纤维膜的另一端，制备成离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置。采用中空纤维膜能够增加萃取液滴的稳定性，避免有机溶剂的损失，而且大分子物质、杂质不能进入有机溶剂。其中，阳离子载体中间相附着于中空纤维膜的膜壁内，接收相溶液注入于中空纤维膜的内腔内。
[0022]步骤S3，将离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置转移至装有给出相溶液的容器中并振荡一段时间，进而把水溶性寡肽从给出相溶液萃取到接收相溶液。举例而言，可选涡旋振荡仪振荡10-90min。
[0023]如图2所示，在步骤SI之中，包括如下子步骤: 步骤Sll，取适量含水溶性寡肽的溶液，并对其进行蛋白沉淀以抑制寡肽的进一步酶解。
[0024]在一【具体实施方式】中，该水溶性寡肽通常可以是降血压肽，该溶液可以是血浆。进而，该蛋白沉淀步骤具体可以为:对血浆进行醇沉淀。
[0025]具体而言，向血浆中加入甲醇，血浆:甲醇比例为1: 3?1: 5，然后进行醇沉淀以去除血浆中的蛋白。在醇沉淀之后，可以将血浆摇匀，并冷却至4 ± 0.5°C。冷却时可以将血浆置入冰箱等冷却设备进行，在预设为4±0.5°C的冰箱等设备中，通常冷却降温5-lOminSP可。
[0026]步骤SI 2，对溶液进行离心分离后取上清液。
[0027]以溶液为含降血压肽的血浆为例进行说明，该离心分离的条件可以设置为:转速12000rpm、时间5min、温度4°C。
[0028]步骤S13，向上清液中加入缓冲液调节pH值至适量值以作为给出相溶液。其中，可以用添加氢氧化钠的磷酸盐缓冲液调节上清液的PH值至9-13。
[0029]在一【具体实施方式】中，具体在步骤S2中，需要先准备附着有阳离子载体中间相的中空纤维膜，具体准备步骤为:将中空纤维膜在室温下浸入含有阳离子载体有机溶液的中间相5-8min后取出。该阳离子载体可以选用aliguat336，其浓度范围可选为1%_20%。进一步地，有机溶剂的选择要求对水溶性寡肽有足够大的溶解度，以得到较高的萃取效率，在水中有较小的溶解度尽量减少在萃取过程中的损失，举例而言，有机溶剂可选用正辛醇、甲苯、二甲苯和邻苯二甲酸二丁酯中的任意一种。
[0030]上述实施方式中，接收相溶液可选用添加盐酸的pH值为1-5、浓度为lm0l/L-4m0l/L的NaCl溶液。
[0031]本发明的萃取原理是在较高的pH条件下，水溶性寡肽阴离子(具体如降血压肽)由原来不容易被有机溶剂萃取的的被分析物，依靠离子载体的主动运输功能，暂时变成了易于进入中空纤维膜的疏水离子对化合物。当离子对化合物到达中空纤维膜腔内水相的接收相时，受PH和盐效应的影响，重新解离，向中空纤维膜腔内接收相释放被分析物。因为接收相溶液的体积远远小于样品溶液的体积，所以分析物具有富集效应。
[0032]参阅图3，本发明还提供一种水溶性寡肽的测定方法。该方法包括上述步骤S1-S3，还包括:
步骤S4，从由步骤S1-S3制备的接收相溶液中，吸取一定量的接收相溶液并注入装有衬管的液相瓶中。
[0033]步骤S5，将接收相溶液稀释5-10倍后进行高效液相色谱检测。
[0034]〈实施例1>
(I)样品准备
取适量含5yg/mL水溶性降血压肽VLPVPR( Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg)的血浆，按血浆:甲醇=1: 3比例对血楽进行醇沉淀，4°C下经12000rpm/min、离心5min后取上清液，用缓冲液调节pH至12，作为给出相溶液。
[0035](2)萃取过程
先将合适大小的聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜浸入离子载体aliquat 336浓度为10%的正辛醇溶液中5min后取出，随后将中空纤维膜小管的一端热封，然后用微量进样器缓慢的将25μ1添加盐酸的pH值为2，浓度为2mol/L的NaCl溶液加入到中空纤维膜腔中，热封闭中空纤维膜的另外一端。将该中空纤维膜转移至装有8ml给出相的样品瓶中，置于涡旋速度为650 rpm的祸旋振荡仪上振荡50min，取出中空纤维膜。
[0036](3)HPLC 检测
用微量进样器吸取20μ1接收相溶液，注入装有衬管的液相瓶中，稀释至ΙΟΟμΙ后进行HPLC检测。
[0037]其中，高效液相色谱检测的色谱条件可以为流动相为各含有0.1%TFA的乙腈和水，乙腈与水的比例为18:82，流速ImL.min—S检测波长202nm，柱温35 °C，1yL进样。
[0038]根据上述的VLPVPR降血压肽萃取和测定方法，其线性回归方程为y= I X 10—5X +
0.331 (R=0.995)，线性范围为0.2-20 yg/mL，富集倍数为35，回收率为108%。
[0039]〈实施例2>
(I)样品准备
取适量含lyg/mL水溶性降血压肽VLPVP(Val-Leu-Pro-Val-Pro)的血浆，按血浆:甲醇=1:3比例对血楽进行醇沉淀，4°C下经12000rpm/min、离心5min后取上清液，用缓冲液调节pH至9，作为给出相溶液。
[0040](2)萃取过程
先将合适大小的聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜浸入离子载体aliquat 336浓度为15%的正辛醇溶液中5min后取出，随后将中空纤维膜小管的一端热封，然后用微量进样器缓慢的将25μ1添加盐酸的pH为4，浓度为1.5mol/L的NaCl溶液加入到中空纤维膜腔中，热封闭中空纤维膜的另外一端。将该中空纤维膜转移至装有8ml给出相的顶空瓶中，置于涡旋速度为600 rpm的祸旋振荡仪上振荡40min，取出中空纤维膜。
[0041 ] (3)HPLC 检测
用微量进样器吸取20μ1接收相溶液，注入装有衬管的液相瓶中，稀释至ΙΟΟμΙ后进行HPLC检测。
[0042]其中，高效液相色谱检测的色谱条件可以为流动相为各含有0.1%TFA的乙腈和水，乙腈与水的比例为18:82，流速ImL.min—S检测波长202nm，柱温35 °C，1yL进样。
[0043]根据上述的VLPVP降血压肽萃取和测定方法，其线性回归方程为y = 31.654x -8.5251 (R=0.998)，线性范围为0.2-20 yg/mL，富集倍数为29，回收率为103%。
[0044]本发明实施方式的水溶性寡肽的萃取方法及测定方法，接收相溶液中寡肽富集倍数尚，有利于提尚暴妝的分析效率。
[0045]以上仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1.一种水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，包括如下步骤: 制备含水溶性寡肽的给出相溶液； 将附着有阳离子载体中间相的中空纤维膜的一端热封，向所述中空纤维膜内缓慢注射接收相溶液，并热封所述中空纤维膜的另一端，制备成离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置；将所述离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置转移至装有所述给出相溶液的容器中并振荡一段时间，进而把水溶性寡肽从所述给出相溶液萃取到接收相溶液。2.根据权利要求1所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，在制备含水溶性寡肽的给出相溶液的步骤之中，包括: 取适量含水溶性寡肽的溶液并进行蛋白沉淀； 对所述溶液进行离心分离后取上清液； 向所述上清液中加入缓冲液调节pH值至适量值以作为所述给出相溶液。3.根据权利要求2所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于: 所述水溶性寡肽是降血压肽，所述溶液是血浆； 在进行蛋白沉淀的步骤之中，具体为:对所述血浆进行醇沉淀蛋白，其中，向所述血浆中加入甲醇并调配至血浆:甲醇的比例为1:3?1:5以进行醇沉淀； 在对所述血浆进行醇沉淀的步骤之后，包括:将所述血浆摇匀，并冷却至4 ± 0.5 °C。4.根据权利要求3所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，在对所述血浆进行离心分离后取上清液的步骤之中:在转速12000rpm、时长5min、温度4°C的条件下进行离心分离。5.根据权利要求3所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，在向所述上清液中加入缓冲液调节PH值至适量值的步骤之中:用添加氢氧化钠的磷酸盐缓冲液调节所述上清液的pH 值至 9-13 ο6.根据权利要求1所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于: 在将附着有阳离子载体的中空纤维膜的一端热封的步骤之中，具体为:将所述中空纤维膜在室温下浸入含有阳离子载体的有机溶液中间相中5-8min后取出； 在将所述离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置转移至装有所述给出相溶液的容器中并振荡一段时间中，米用祸旋振荡仪振荡10_90min。7.根据权利要求6所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，所述中间相溶液中阳离子载体为aliguat 336，其浓度范围为1%_20%；有机溶剂选用正辛醇、甲苯、二甲苯和邻苯二甲酸二丁酯中的一种。8.根据权利要求1所述的水溶性寡肽的萃取方法，其特征在于，所述接收相溶液为添加盐酸的PH值为1-5、浓度为Imo l/L-4mo 1/L的NaCl溶液。9.一种血浆中水溶性寡肽的测定方法，其特征在于，包括如下步骤: 制备含水溶性寡肽的给出相溶液； 将附着有阳离子载体中间相的中空纤维膜的一端热封，向所述中空纤维膜内缓慢注射接收相溶液，并热封所述中空纤维膜的另一端制备成离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置；将所述离子载体辅助的溶剂棒微萃取装置转移至装有所述给出相溶液的容器中并振荡一段时间，进而把水溶性寡肽从所述给出相溶液萃取到接收相溶液； 吸取一定量的接收相溶液并注入装有衬管的液相瓶中； 将所述接收相溶液稀释5-10倍后进行高效液相色谱检测。10.根据权利要求9所述的血浆中水溶性寡肽的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的色谱条件为流动相为各含有0.1% TFA的乙腈和水，所述乙腈与所述水的比例为18:82，流速ImL.min—1，检测波长202nm，柱温35 °C，1yL进样。
【文档编号】G01N30/06GK105823848SQ201610298664
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】崔淑芬, 王金林, 翁盼伟
【申请人】深圳职业技术学院