专利名称：一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法
技术领域：
本发明涉及一种在酵母细胞中检测抗朊病毒药物作用效果的方法，特别涉及一种 在蛋白质水平的精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。
背景技术：
朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔痒症、库鲁 病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社会造成了极大的危害。关于 朊病毒的分子致病机理和治疗药物筛选、开发的研究是国际上生物学、医学领域研究的前 沿和热点。目前国际上一般使用SDS-PAGE/Western Blot来在蛋白质水平通过检测细胞内 朊病毒蛋白聚集体的可溶性的变化来评估抗朊病毒药物的作用效果，这种方法首先通过高 速离心将细胞内可溶状态的单体朊蛋白与不可溶状态的聚集体朊蛋白分开，然后分别进行 SDS-PAGE/Western Blot，从而通过条带的有无以及条带亮度来判断细胞内的朊病毒的聚 集状态。尽管这是一种行之有效的方式，但是使用这种方法不能够定量测定朊病毒蛋白聚 集体的分子量大小的变化。而朊病毒蛋白聚集体的分子量大小是其致病性、传染性的根本 原因，其聚集体的分子量大小的变化是抗朊病毒药物作用效果的重要指标。因此，尤其是在 基于酵母细胞的抗朊病毒药物筛选中，需要一种更为有效的方法来对药物的作用效果进行 精确地检测与评估。
发明内容
针对国际上不能够定量测定朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化的不足，本发 明提供一种新型的采用半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白质印迹的方法(SDD-AGE/Western blot)，用琼脂糖凝胶电泳来定量检测朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化，以解决测定 朊病毒蛋白聚集体的分子量大小方面的技术问题。本发明使用的菌种为野生型酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiaeATCC 208719)，来自于美国标准菌种库(American Type Culture Collection, ATCC)，保藏编号 为208719。这种野生型酿酒酵母细胞带有[PSI+]朊病毒，即Sup35p呈聚集状态，表现为 较大的分子量，菌落颜色表现为白色；经药物作用后，聚集的Sup35p解聚，不同的药物促进 Sup35p聚集体解聚的能力不同，从而表现出不同的分子量，菌落的颜色也随着聚集体的变 化而变化——Sup35p聚集体越小菌落颜色越深，即随着Sup35p聚集体从大到小，菌落依次 表现为白色，粉色，红色。彻底治愈的细胞内Sup35p完全解聚呈单体，表现为恒定的较小的 分子量(约为74kDa)，菌落颜色表现为红色，称为[psil细胞。本发明采用的技术方案是一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效 果的方法，其步骤如下1)酿酒酵母细胞的活化取酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae ATCC 208719)接入 YPD 液体培养基中，30°C水浴振荡培养18h，然后进行酵母菌初始0D值的调试，调制菌悬液0D, = 0.5；2)抗朊病毒药物的初筛选取无菌冻存管，加入待测药物、YPD液体培养基以及调试好的酿酒酵母细胞菌悬 液，在24°C的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的酿酒酵母细胞放入新的装有 YPD液体培养基和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1 5天，每天取菌悬液少量稀释涂 平板到1/2YPD固体培养基上，通过观察菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；Sup35p呈聚集状态时，朊病毒蛋白聚集体表现为较大的分子量，菌落颜色表现 为白色；经药物作用后，聚集的Sup35p解聚，菌落的颜色也随着聚集体的变化而变化—— Sup35p聚集体越小菌落颜色越深，即随着Sup35p聚集体从大到小，菌落依次表现为白色， 粉色，红色。彻底治愈的细胞内Sup35p完全解聚呈单体，表现为恒定的较小的分子量(约 为74kDa)，菌落颜色表现为红色。3)定量检测抗朊病毒药物的作用效果酿酒酵母细胞裂解液的制备取经药物治疗不同时间后稀释涂平板在1/2YPD上 长出的单菌落，按菌落颜色分组，每组挑取3-5个单菌落接种到10ml YPD液体培养基中活 化18h，然后再以的接种量接种到50mlYPD液体培养基中扩大培养12h，离心收集细胞， 然后加入裂解缓冲液，用珠磨仪裂解细胞，离心收集上清得到蛋白样品；琼脂糖凝胶电泳用含0. 1 %十二烷基硫酸钠(SDS)的TBE配制1. 5%琼脂糖凝 胶，用含0. 5% SDS的上样缓冲液于42°C温育蛋白样品lOmin，然后将蛋白样品在100V，4°C 的条件下电泳至凝胶前沿，再将蛋白湿法电转移到PVDF膜上，进行免疫印迹反应，并曝光X 光片获得图像信息；4)用全自动图像分析系统Dolphin-DOC进行图像扫描，分析。本发明中，朊病毒被治愈的酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiaeATCC 208719)中Sup35p呈单体可溶状态，未被治愈的细胞中Sup35p聚集在一起形成聚合物。通 过细胞中Sup35p聚集体分子量的大小变化，可以在蛋白质水平精确定量检测待测药物对 朊病毒聚集体的作用效果。本发明的有益效果是本发明，采用半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白质印迹的方 法(SDD-AGE/Western blot)，相对于国际上一般使用的SDS-PAGE/Western Blot方法，能够 更加精确地在蛋白质水平通过检测细胞内朊病毒蛋白聚集体的可溶性的变化，依此来评估 抗朊病毒药物的作用效果。由于，朊病毒蛋白聚集体的分子量大小是其致病性、传染性的根 本原因，其聚集体的分子量大小的变化是抗朊病毒药物作用效果的重要指标，而本发明通 过SDD-AGE/Western blot方法能够精确的确定朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化，从 而实现在蛋白质水平定量判断药物对朊病毒的作用效果，并在分子机理和细胞学上探讨抗 朊病毒药物的作用机理。本发明采用湿法电转移的方法将经凝胶电泳的蛋白转移到PVDF 膜上，该法与虹吸法相比可以节约80%以上的时间，同时它也克服了半干法电转蛋白转移 不完全的缺点。
图1是实施例1中，利用SDD-AGE/Western Blot方法检测[PSI+]、[psi_]的照片；图2是实施例2中，利用SDD-AGE/Western Blot方法检测盐酸胍对朊病毒[PSI+]
4作用效果的照片。图3是实施例3中，利用SDD-AGE/Western Blot方法检测菲啶对朊病毒[PSI+]作 用效果的照片。
具体实施例方式菌种来源Sf生型酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae ATCC208719)，来自 于美国标准菌种库(American Type Culture Collection，ATCC)，保藏编号为 208719。实施例1定量检测[PSI+]、[psil细胞中Sup35p的聚集水平1)酿酒酵母细胞的活化取野生型酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae ATCC 208719)中的[PSI+]、 [psi_]菌株单菌落，分别接种到10ml YPD液体培养基中，30°C水浴振荡培养18h。然后用 YPD进行酵母菌初始0D值的调试，调制菌悬液终浓度0D_ = 0.5；以的接种量将调试好的[PSI+]、[psi-]分别接种到50ml YPD液体培养基中， 30°C，180转振荡培养约12h，到0D_ = 1. 5左右时停止培养。2)采用 SDD-AGE/Western blot 的方法，定量检测[PSI+]、[psil 细胞中 Sup35p 的聚集水平酿酒酵母细胞裂解液的制备将1)步培养好的[PSI+]、[psil酵母菌培养液分 别离心，5000rpm，5min，去上清收集细胞，加入裂解缓冲液(25mM Tris-Cl，pH 7. 4,100mM NaCl,50mM KCl,5mM MgC12，4%甘油，1 % TritonX-100，2. 5mM EDTA,0. 1% SDS,2mM DTT 现 用现加，5mM PMSF现用现加)悬浮细胞，再次离心收集细胞，取0. 3ml细胞放入可密封的样 品管中，加裂解缓冲液适量(0. 6ml)，悬浮细胞，再加锆珠适量(0. 3g)，拧紧管盖密封样品 管，将其置于酵母细胞破碎仪(珠磨仪，MiniBeadbeater-1)中，震荡破碎细胞。破碎方法 震荡破碎30s，取出置于冰上60s，再次震荡破碎30s，再取出置于冰上60s，如此反复4次。 5000rpm,离心5min，收集上清得到蛋白样品PSI+和psi—，用蛋白质测定试剂盒(protein assay kit)分别测定两个蛋白样品的浓度。琼脂糖凝胶电泳用含0. 1 % SDS的TBE (45mM Tris-硼酸，ImMEDTA, pH 8. 0)配制 1. 5%琼脂糖凝胶(12cmX 12cm，称取0. 45g琼脂糖加热溶于30ml含0. SDS的TBE中)， 用上样缓冲液(0.5XTBE，0.5% SDS，5%甘油，0. 05%溴酚蓝)混勻蛋白样品，于42°C水浴 中温育蛋白样品lOmin，然后将样品在含0. SDS的TBE电泳缓冲液的作用下，进行1. 5% (12X12)的琼脂糖凝胶电泳，100V，4°C电泳至凝胶前沿。再将电泳完的凝胶中的蛋白在转 移缓冲液(48mM甘氨酸，39mM Tris，0. 0375% SDS，20%甲醇)的作用下，湿法电转(恒压 100V, 60min)到PVDF膜上，进行免疫印迹反应，最后曝光X光片获得图像信息。3)结果分析用全自动图像分析系统Dolphin-DOC进行图像扫描，分析目标带的分子量和净光 密度值。如图1所示。根据实验操作以及图1所示可以看出，本发明采取的SDD-AGE/Western Blot方 法操作简单(样品离心次数大大减少)、对设备要求较低(普通离心机即可)且耗时较少， 而实验结果不但可以确定目的蛋白的分布及多少，更重要的是可以确定蛋白分子的聚集状 态，从而在蛋白质水平精确定量抗朊病毒药物的作用效果。
实施例2定量检测盐酸胍对朊病毒的作用效果1)酵母细胞的活化取野生型酿酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae ATCC 208719)中的[PSI+]、 [psi_]菌株单菌落，分别接种到10ml YPD液体培养基中，30°C水浴振荡培养18h。然后用 YPD进行酵母菌初始0D值的调试，调制菌悬液终浓度0D_ = 0.5；2)抗朊病毒药物的初筛选取2ml无菌冻存管，加入盐酸胍，0. 9ml YPD液体培养基以及0. lml调试好的酵母 细胞菌悬液，使盐酸胍的终浓度为5mM。在24°C的条件下，水浴摇床振荡培养，每天定时取 适量的前一天冻存管中的酵母细胞放入新的装有YPD培养液和盐酸胍的无菌冻存管中，振 荡培养1 5天；在盐酸胍作用的过程中，适时取出经药物治疗ld，3d，5d的酵母细胞，稀释10000 倍，取0. lml均勻涂平板到1/2YPD固体培养基上，放24°C温箱中培养5 8d，观察菌落颜 色的变化，经1 5天的治疗，菌落颜色从白色逐渐变为粉色和红色，初步判断盐酸胍对朊 病毒具有治疗效果；3)使用SDD-AGE/Western blot的方法，定量检测盐酸胍的作用效果酿酒酵母细胞裂解液的制备分别取经盐酸胍治疗ld，3d，5d稀释涂平板在 1/2YPD上长出的单菌落，按菌落颜色分组(将同一天的颜色相同的菌落作为一组)，每组挑 取单菌落3 5个接种到10ml YPD液体培养基中，30°C摇床活化18h。然后再以接种 量接种到50ml YPD的液体培养基中，分别进行扩大培养12h。分别离心，5000rpm，5min，去上清收集细胞，然后加入裂解缓冲液(25mM Tris-Cl, pH7. 4,100mM NaCl,50mM KCl,5mM MgC12，4 % 甘油，1 % TritonX-100，2. 5mM EDTA,0. 1% SDS,2mM DTT现用现加，5mM PMSF现用现加)悬浮细胞，再次离心收集细胞。取0. 3ml细 胞放入可密封的样品管中，加裂解缓冲液适量(0. 6ml)，悬浮细胞，再加锆珠适量(0. 3g)， 拧紧管盖密封样品管，将其置于酵母细胞破碎仪(珠磨仪，MiniBeadbeater-1)中，震荡 破碎细胞。破碎方法震荡破碎30s，取出置于冰上60s，再次震荡破碎30s，再取出置于冰 上60s，如此反复4次。5000rpm，5min离心，收集上清得到蛋白样品，用蛋白质测定试剂盒 (proteinassay kit)分别测定各个蛋白样品的浓度。琼脂糖凝胶电泳用含0. 1% SDS 的 TBE(45mM Tris-硼酸，ImMEDTA，pH 8. 0)配 制1. 5 %琼脂糖凝胶(12cmX 12cm,称取0. 45g琼脂糖加热溶于30ml #0.1% SDS的TBE 中)，用上样缓冲液(0. 5XTBE，0. 5% 505，5%甘油，0. 05%溴酚蓝)混勻样品，于42°C水浴 中温育蛋白样品lOmin，然后将样品在含0. 1%SDS的TBE电泳缓冲液的作用下，进行1. 5% (12X12)的琼脂糖凝胶电泳，100V，4°C电泳至凝胶前沿。再将电泳完的凝胶中的蛋白在转 移缓冲液(48mM甘氨酸，39mM Tris,0. 0375% SDS，20%甲醇)的作用下，湿法电转(恒压 100V,60min)到PVDF膜上，进行免疫印迹反应，最后曝光X光片获得图像信息。4)结果分析用全自动图像分析系统Dolphin-DOC进行图像扫描，分析目标带的分子量和净光 密度值。如图2所示。结论由图2的结果可以看出，经SDD-AGE结合蛋白印迹的方法，我们可以看出盐 酸胍作用不同天数下不同菌落颜色的细胞内的Sup35p的状态。由X光片的信息可以看出，
6同为白色或者粉色菌落，1天，3天和5天下的相同颜色菌落内的Sup35p的聚集状态是不一 样的。经过5天的盐酸胍作用，虽然还有个别的白色菌落出现，但是在蛋白水平，Sup35p聚 集体的分子量已经大大减小。这种聚集体分子量变化的信息同时也在另一方面极为重要地 反映出了待测药物对于朊病毒聚集体的抑制及降解能力。这是使用传统的分析方法所不能 实现的。实施例3定量检测菲啶对朊病毒的作用效果1)酿酒酵母细胞的活化同实施例2 ；2)抗朊病毒药物的初筛选取2ml无菌冻存管，分别加入盐酸胍，菲啶，0. 9ml YPD培养液以及0. lml调试好 的酵母细胞悬液，使盐酸胍的终浓度为0. 5mM(在此浓度下，盐酸胍对朊病毒没有治愈作 用，但是和别的药物同时作用起到增效剂的作用)、使菲啶的终浓度为0. 2mM。在24°C的条 件下，水浴摇床振荡培养，每天定时取适量的前一天冻存管中的酵母细胞放入新的装有YPD 培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1 5天；在待测药物作用的过程中，适时取出经药物治疗ld，2d，3d，4d，5d的酵母细胞，稀 释10000倍，取0. lml均勻涂平板到1/2YPD固体培养基上，放24°C温箱中培养5 8d，观 察菌落颜色的变化，经1 5天的治疗，菌落颜色从白色逐渐变为粉色和红色，初步判断菲 啶对朊病毒具有治疗效果；3)使用SDD-AGE/Western blot的方法，定量检测菲啶的作用效果方法同实施例24)结果分析用全自动图像分析系统Dolphin-DOC进行图像扫描，分析目标带的分子量和净光 密度值。如图3所示。结论由图3的结果可以看出，经SDD-AGE结合蛋白印迹的方法，我们可以看出菲 啶作用不同天数下不同菌落颜色的细胞内的Sup35p的状态。由X光片的信息可以看出，同 为白色或者粉色菌落，1天，3天和5天下的相同颜色菌落内的Sup35p的聚集状态是不一样 的。经过5天的菲啶作用，虽然还有个别的白色菌落出现，但是在蛋白水平，Sup35p聚集体 的分子量已经大大减小。这种聚集体分子量变化的信息同时也在另一方面极为重要地反映 出了待测药物对于朊病毒聚集体的抑制及降解能力。这是使用传统的分析方法所不能实现 的。根据实施例2、实施例3以及图2、图3可以看出，本发明采取的SDD-AGE/Western Blot方法不仅可以确定目的蛋白在分布和数量方面变化，也能精确的确定药物作用下朊病 毒聚集体在大小上的变化，从而在蛋白质的水平判断药物对朊病毒的作用效果，进而为在 分子机理和细胞学上的探讨抗朊病毒药物的作用机理提供可能。实施例2和实施例3用已知的抗朊病毒药物盐酸胍和菲啶对本发明的方法进行了 验证。本发明的方法适用于在次级药物筛选中精确定量的检测其抗朊病毒的作用效果，对 于某一新的化合物或已知的药物，可以按本发明的步骤，通过初筛选来初步判断其是否具 有抗朊病毒的作用，经初步判断后，可以进一步采用SDD-AGE/Western blot的方法，来定量 检测其抗朊病毒的作用效果。
权利要求
一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法，其特征在于步骤如下1)酿酒酵母细胞的活化取酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae ATCC 208719)接入YPD液体培养基中，30℃水浴振荡培养18h，然后进行酵母菌初始OD值的调试，调制菌悬液OD600＝0.5；2)抗朊病毒药物的初筛选取无菌冻存管，加入待测药物、YPD液体培养基以及调试好的酿酒酵母细胞菌悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的酿酒酵母细胞放入新的装有YPD液体培养基和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1～5天，每天取菌悬液少量稀释涂平板到1/2YPD固体培养基上，通过观察菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；3)定量检测抗朊病毒药物的作用效果酿酒酵母细胞裂解液的制备取2)步中，经药物治疗不同时间后稀释涂平板在1/2YPD上长出的单菌落，按菌落颜色分组，每组挑取3-5个单菌落接种到10ml YPD液体培养基中活化18h，然后再以1％的接种量接种到50ml YPD液体培养基中扩大培养12h，离心收集细胞，然后加入裂解缓冲液，用珠磨仪裂解细胞，离心收集上清得到蛋白样品；琼脂糖凝胶电泳用含0.1％SDS的TBE配制1.5％琼脂糖凝胶，用含0.5％SDS的上样缓冲液于42℃温育蛋白样品10min，然后将蛋白样品在100V，4℃的条件下电泳至凝胶前沿，再将蛋白湿法电转移到PVDF膜上，进行免疫印迹反应，并曝光X光片获得图像信息；4)用全自动图像分析系统Dolphin-DOC进行图像扫描，分析。
全文摘要
本发明涉及一种在蛋白质水平精确定量检测抗朊病毒药物作用效果的方法。采用的技术方案是1)酿酒酵母细胞的活化；2)抗朊病毒药物的初筛选将待测药物、YPD液体培养基以及调试好的酿酒酵母细胞菌悬液，振荡培养1～5天，通过菌落颜色的变化初步判断待测药物的治疗效果；3)使用SDD-AGE/Western blot的方法，定量检测抗朊病毒药物的作用效果；4)用全自动图像分析系统Dolphin-DOC进行图像扫描，分析。本发明可精确地在蛋白质水平通过检测细胞内朊病毒蛋白聚集体的可溶性变化来评估药物的作用效果；通过定量检测朊病毒蛋白聚集体的分子量大小的变化，完成在蛋白质的水平上判断药物对朊病毒的作用大小。
文档编号G01N33/561GK101858910SQ20101013200
公开日2010年10月13日 申请日期2010年3月25日 优先权日2010年3月25日
发明者兰万军, 宋尧, 宋有涛, 李辉 申请人:辽宁大学