一种链霉素抗体及其应用的制作方法

专利名称：一种链霉素抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种链霉素抗体及其应用。
背景技术：
链霉素(Str印tomycin，STM)是氨基糖苷类抗生素的一种，对革兰氏阴性菌和部 分革兰氏阳性菌特别是结核分枝杆菌具有显著的抗菌活性。链霉素主要作用于细胞的核糖 体，通过抑制细菌蛋白质的生物合成而呈现杀菌作用。正是由于其独特的抗菌活性，所以自 1943年首次在灰色链球菌属中发现链霉素以来，它被广泛应用于多种疾病的治疗和动物饲 料添加剂，并在人畜传染病的防治方面发挥了巨大作用。然而，链霉素对人又有一定的、有时甚至是严重的毒副作用。链霉素引起的主要毒 副作用是耳毒性。因其能选择性地损害第8对脑神经，导致前庭功能损害和耳蜗神经损害， 严重时可造成永久性的耳聋，长期使用还会使细菌产生耐药性。为了保障动物源性食品的 安全，欧盟、美国及我国等很多国家都对链霉素在动物源性食品中残留制定了最大残留限 量(MRL)。链霉素目前一般采用HPLC或LC/MS，但这类方法样本前处理及测定操作烦琐，检 测所需时间较长，检测费用高，推广使用受到限制。酶联免疫吸附实验是将抗体抗原反应的高度特异性、敏感性与酶的高度催化性有 机地结合，在不同的载物上进行有毒物质残留分析的方法，具有操作简便快速、成本低、灵 敏度较高、分析样本量大的优点。目前，用于免疫检测的抗体都是单克隆抗体或多克隆抗 体。单克隆抗体或多克隆抗体的制备必须通过细胞培养获得，整个生产过程复杂，消耗时间 长，费用高，且不易进行操作。单链抗体是将抗体重链可变区和轻链可变区基因通过一个短 肽链连接后融合表达出来的抗体片断，具有分子量小、特异性高、结合力强、易于利用基因 工程技术操作等优点。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测链霉素的单链抗体及其编码基因。本发明所提供的单链抗体，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、 轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第1-123位 氨基酸残基所示，所述轻链可变区的的氨基酸序列如序列1自N末端起第139-248位氨基 酸残基所示。上述单链抗体中，所述连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽的氨基酸序列如 序列1自N末端起第124-138位氨基酸残基所示。所述编码基因为如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5'末端起第1-369位核苷 酸所示的DNA分子；2)所述轻链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5'末端起第415-744位核 苷酸所示的DNA分子；
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3)所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的编码基因为自序列表中序列2的 5'末端起第370-414位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)、2)或3)、4)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系和表达盒也属于 本发明的保护范围。上述任一所述单链抗体在检测链霉素或双氢链霉素中的应用也属于本发明的保 护范围。本发明的另一个目的是提供一种检测链霉素或双氢链霉素的免疫试剂盒。本发明所提供的检测检测链霉素或双氢链霉素的免疫试剂盒，为下述1)、2)、3) 或4)中任一所述试剂盒1)试剂盒中包括链霉素半抗原与载体蛋白的偶联物、上述任一所述单链抗体和酶 标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；2)试剂盒中包括链霉素半抗原的酶标记物、上述任一所述单链抗体和抗抗体；其 中，所述抗抗体作为包被原；3)试剂盒中包括链霉素半抗原的酶标记物、上述任一所述单链抗体；其中，所述 单链抗体作为包被原；4)试剂盒中包括链霉素半抗原与载体蛋白的偶联物、上述任一所述单链抗体的酶 标记物；其中，所述偶联物作为包被原。上述任一所述免疫试剂盒中，所述试剂盒中包括链霉素标准品溶液、洗涤液和样 品稀释液；所述链霉素标准品为硫酸链霉素；所述链霉素标准品溶液为如下各浓度的溶液0 48/1、0.5 48/1、1.5 48/1、 4. 5 μ g/L、13. 5 μ g/L、40. 5 μ g/L ；每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的将IOml吐温20，5g叠氮化钠和 990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0. 005M-0. 015M, 具体为0. 01M, pH值为7. 2-7. 6，具体为7. 4 ；所述样品浓缩液为浓度为0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液，具体为 0. 04mol/L的磷酸盐缓冲液。所述链霉素半抗原与载体蛋白的偶联物是按照如下方法制备得到的(1)将每145. 7mg链霉素半抗原溶于水中，得到链霉素半抗原的水溶液；将每 21. 9mg羧甲基羟胺半盐酸盐溶于水中，得到羧甲基羟胺半盐酸盐的水溶液；将所述硫酸链 霉素的水溶液和所述羧甲基羟胺半盐酸盐的水溶液混合均勻，调节PH值至8. 0，25°C磁力 搅拌24h，干燥，将得到的物质记作物质I ； (2)将所述物质I溶于500 μ L 2_(Ν_吗啉代) 乙磺酸缓冲液中，得到的溶液记作溶液I ；将每20. 7mg碳化二亚胺溶于200 μ L 20% (体 积百分含量)乙醇水溶液中，将得到的溶液记作溶液II ；将50mg BSA溶于ImL MES缓冲液 中，将得到的溶液记作溶液III ；将溶液I、溶液II和溶液III混勻，25°C磁力搅拌24h，将得到 的溶液记作溶液IV ； (3)将所述溶液IV进行透析，得到所述链霉素半抗原与载体蛋白的偶 联物；
所述链霉素半抗原为硫酸链霉素；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、 鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗体为鼠抗HIS标签单克隆抗体。所述样品稀释液为将所述样品浓缩液稀释20倍得到的。本发明的另一个目的是提供一种检测链霉素或双氢链霉素的胶体金试纸。本发明所提供的检测链霉素或双氢链霉素的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体 金垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述胶金垫包被有胶体金标记的上述任一所述单链抗 体；所述反应垫上含有检测带和质控带，检测带位置包被有上述任一所述链霉素半抗原与 载体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体；所述链霉素半抗原为链 毒素。本发明的另一个目的是提供一种检测样品中链霉素或双氢链霉素的方法。本发明所提供的检测样品中链霉素或双氢链霉素的方法，为如下I )或II )所 示I)检测样品中链霉素或双氢链霉素的方法包括如下步骤1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；2)用上述任一所述免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；所述前处理的方法为下述a)、b)、c)、d)和e)中的任一a)所述待测样品为牛奶；将所述待测样品4000r/min离心lOmin，吸除上层脂肪， 得到去除脂肪的待测样品；取ImL所述去除脂肪的待测样品与样品稀释液混合，得到的混 合溶液即为待测样本溶液；所述去除脂肪的待测样品与样品稀释液的体积比为1 39;b)所述待测样品为奶粉；将每Ig所述待测样品与40mL样品稀释液混合均勻，得 到的溶液即为待测样本溶液；c)所述待测样品为鸡肝；去除所述待测样品中的脂肪，得到去除脂肪的待测样 品；将每5. O士0. 05g去除脂肪的待测样品的均质物与20mL PBST缓冲液混合，振荡30min， 4000r/min离心lOmin，取2mL上层清液；将所述2mL上层清液与3mL正己烷振荡混合5min， 4000r/min离心lOmin，取下层清液；将所述下层清液与样品稀释液混合，得到的混合溶液 即为待测样本溶液；所述下层清液与样品稀释液的体积比为1 9;d)所述待测样品为鸡肉；去除所述待测样品中的脂肪，得到去除脂肪的待测样 品；将每2士0. 05g所述去除脂肪的待测样品的均质物与8mL PBST缓冲液混合振荡5min， 加入5mL正己烷振荡混合lOmin，静置lh，4000r/min离心15min，取ImL中间层溶液；将所 述ImL中间层溶液与ImL正己烷振荡混合5min，4000r/min离心15min，取下层清液；将所 述下层清液与样品稀释液混合，得到的混合溶液即为待测样本溶液；所述下层清液与样品 稀释液的体积比为1 9;e)所述待测样品为蜂蜜；将每1 士0.05g所述待测样品用IOmL样品稀释液溶解， 200C -25°C、4000r/min离心lOmin，取上清液，即得到待测样本溶液；II)检测样品中链霉素的方法包括如下步骤1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；2)用上述任一所述胶体金试纸对所述待测样本溶液进行检测；所述前处理的方法为下述a)或b)
a)所述待测样品为牛奶；将所述待测样品与样品稀释液混合，得到的混合溶液即 为待测样本溶液；所述待测样品与样品稀释液的体积比为1 (4-6)或1 5;b)所述待测样品为蜂蜜；将所述待测样品与样品稀释液混合，得到的混合溶液即 为待测样本溶液；所述待测样品与样品稀释液的体积比为1 (3-5)或1 4。上述试剂盒既可以为酶联免疫试剂盒，又可为发光免疫试剂盒，当为酶联免疫试 剂盒时，所述试剂盒中包括底物显色液；所述底物显色液由A液和B液组成，所述A液为浓 度为1. 5% -2. 5%的过氧化脲的水溶液，B液为浓度为0. 5% -1. 5%的四甲基联苯胺的水 溶液； 所述A液优选为浓度为2 %的过氧化脲的水溶液，B液优选为浓度为1 %的四甲基 联苯胺的水溶液。本发明的单链抗体(scFv)是用基因工程方法将抗体重链可变区(VH)和轻链可变 区(VL)通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组抗体，是保持了亲本抗体的抗原亲和活 性和特异性的最小功能性抗体片段，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中很经 济地大规模生产，从而使得免疫检测抗体的生产变得非常容易、简便和经济，进而大大减少 检测试剂的费用，比杂交瘤细胞培养得到单抗的方法要简单得多。本发明抗体的亲和常数 为2.61X109L/mol、半数抑制量(IC5tl)为0. 75ng/mL。本发明为食品中链霉素残留检测方 法的建立提供高效价、高特异性的抗体来源。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作 简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量 样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的抗体、试剂盒、胶体金试纸及检测方法在 链霉素的检测中将发挥重大作用。


图1为试剂盒标准曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、抗体的制备及功能检测一、链霉素单链抗体的制备(一 )抗体的筛选取6个月雄性Balb/c小鼠，Trizol —步法提取脾细胞总RNA，纯化得到mRNA，再逆 转录得到cDNA。使用全套引物，以cDNA为模板分别扩增得到重链可变区(VH)、轻链可变区 (VL)基因，经叠加延伸聚合酶链式反应(Overlap-PCR)将VH、VL基因随机拼接为单链抗体 基因(ScFv)，然后将ScFv与载体pCANTAB5E连接得pCANTAB5E/ScFv，并转化大肠杆菌TGi， 即得到鼠源非免疫单链抗体库。用ELISA方法筛选得到带有特异性的多种抗链霉素的单链 抗体的噬菌体颗粒，通过测序得到其相应的核苷酸序列。该单链抗体由重链可变区、连接所述重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变 区顺次连接组成。该抗体的氨基酸序列如序列表中序列1所示，自序列1的N端起第1-123
8位氨基酸残基为重链可变区的氨基酸序列，自序列1的N端起第139-248位氨基酸残基为 轻链可变区的氨基酸序列，自序列1的N端起第124-138位氨基酸残基为短肽序列。该单链抗体的编码基因序列如序列表中序列2所示，自序列2的5'末端起第 1-369位核苷酸编码重链可变区，自序列2的5'末端起第415-744位核苷酸编码轻链可变 区，自序列2的5'末端起第370-414位核苷酸编码短肽。( 二)抗体的制备表达载体pET20b购自德国N0VAGEN公司；大肠杆菌BL21购自德国N0VAGEN公司； 蛋白纯化用HisLink Protein Purification Resin购自美国Promega公司，产品目录号 为 V8823。合成序列表中序列2所示基因，并在两端引入酶切位点Xba I和Not I，用限制性 内切酶Xba I和Not I酶切，回收目的基因片段；用限制性内切酶Xba I和Not I酶切表达 载体pET20b，回收载体大片段；连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选培养，挑取单克隆；将单 克隆接入液体培养基进一步培养，提取质粒，酶切和测序验证，结果测得的序列如序列表中 序列2所示，表明重组载体中基因插入方向和序列均正确，将阳性重组载体记作重组表达 载体 pET20b/ScFv。采用氯化钙法将重组表达载体pET20b/ScFv转化大肠杆菌BL21，抗性筛选，经菌 液PCR及质粒酶切验证，得到含有重组表达载体pET20b/ScFv的重组大肠杆菌，记作重组大 肠杆菌 BL21/pET20b/ScFv。2XTY培养液的组成由胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl和水组成，每1升2XTY培养 液中胰蛋白胨的浓度为1.6%、酵母提取物的浓度为l%、NaCl的浓度为0.5%;各百分含量 均为质量百分含量。含氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的2XTY培养液是按照如下方法得到的向2XTY 培养液中添加氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖，使氨苄青霉素在溶液中的终浓度为IOOyg/ ml，使氯霉素在溶液中的终浓度为34 μ g/ml，使葡萄糖在溶液中的终浓度为1 % (质量百分 含量)。发酵重组菌将重组大肠杆菌BL21/pET20b/ScFv的单个阳性菌落接种至含氨苄 青霉素、氯霉素和葡萄糖的2 X TY培养液中，37°C振摇，至培养体系的A6tltl为0. 6时，收集细 菌；将细菌重悬于2ml LB液体培养基中，按1 20的体积比将菌悬液接种至50ml含相同 浓度抗生素的LB液体培养基中(含相同浓度抗生素的LB液体培养基的组成氨苄青霉素、 氯霉素、酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水组成；溶液中各成分的浓度为酵母提取物0. 5%, 蛋白胨1 %，NaCl 1 %，氨苄青霉素100 μ g/ml，氯霉素34 μ g/ml)，37°C振摇，至培养体系的 A600 为 0. 6 时，加 IPTG(0. 7mmol/L)诱导，30°C振摇 2. 5h，在 4°C下 5000r/min 离心 lOmin， 收获细菌。用洗涤液(将20mmol Tris和0. 15mol NaCl用水溶解，用HCL调PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升洗涤液)洗涤1次，加溶菌液(将20mmol TrisUOml Triton Χ-100、250 μ mol PMSF、62. 5 X IO4U溶菌酶用水溶解，用HCL调PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升溶菌液)，30°C放置15min，然后在冰上超声处理(输出功率80% ) 10s，停10s， 反复3次，至细胞不再粘稠。在4°C 2000Xg离心20min，分别收集上清及沉淀。将沉淀用结 合缓冲液I (将20mmol Tris,0. 5mol Nacl和5mmol咪唑用水溶解，用HCL调PH值至8. 0， 再用水定容至1L，得到1升结合缓冲液I)洗涤一次，而后，悬于结合缓冲液11(将20mmolTris,0. 5mol Nacl、5mmol咪唑和6mol尿素用水溶解，用HCL调PH值至8. 0，再用水定容至 1L，得到1升结合缓冲液II)中，4°C，12000 X g离心20min,收集上清，经0. 45mm滤膜过滤， 收集滤液，得到抗体的粗制液。纯化利用表达载体上带有的组氨酸标签(His-tag)标记通过亲和层析纯化单链 抗体蛋白。将 HisLink Protein Purification Resin 装柱，以 10 倍柱体积的 binding buffer (将 lOOmmolHEPES、IOmmol 咪唑和 500mmol NaCl 用水溶解，再调节 pH 值至 7. 5，然 后用水定容至1升，得到1升binding buffer)平衡纯化柱，取抗体的粗制液上样，然后用5 倍柱体积的wash buffer (将lOOmmolHEPES、IOOmmol咪唑和用水溶解，再调节pH值至7. 5， 然后用水定容至1升，得到1升wash buffer)洗脱杂蛋白，最后用10倍柱体积的elution buffer (将lOOmmolHEPES、250mmol咪唑用水溶解，再调节pH值至7. 5，然后用水定容至1 升，得到1升elution buffer)洗脱目标蛋白，收集洗脱液，透析，得到纯化的抗体。蛋白验证Western blot 收集上述各阶段产物，进行12% SDS-PAGE电泳；将电泳 条带印迹到NC膜上，再与HRP标记的硫酸链霉素杂交，用ECL发光液检测发光条带。硫酸 链霉素购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为46754。同时以转入空载体pET20b的大肠杆菌BL21作为对照，并按照上述方法进行表达 和纯化，和Western blot检测。Western blot检测结果表明1)实验组得到的蛋白具有与链霉素结合的功能，蛋 白的分子量为28kD，与预期的蛋白分子量一致，表明目的蛋白为与链霉素结合的抗体。2) 对照组没有检测到任何与链霉素结合的蛋白条带。1、用ELISA方法，检测抗体的半抑制率(IC5tl)a、将实施例2中制备得到的偶联物(STM-BSA)用包被缓冲液溶解，得到STM-BSA 的溶液(该溶液中STM-BSA的浓度为1 μ g/ml)。包被缓冲液pH9. 6,0. lmol/L的碳酸钠缓 冲液。向96孔板的孔中加入STM-BSA的溶液，100 μ L每孔，37°C温育2h ；倾去包被液，用 PBST溶液(PBS+0. 05% Tween20)洗涤3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液体。b、向每孔中加入200 U L2% BSA封闭液，37°C温育2h，倾去孔内液体；用PBST溶液 (PBS+0. 05% Tween20)洗涤3次，250 μ L每孔，每次30s，甩干孔中液体。C、向孔中加入单链抗体溶液和不同浓度的链霉素标准品溶液，各50 μ L每孔， 37°C孵育1小时。以只加入单链抗体溶液不加入链霉素标准品溶液的孔作阳性对照。单链抗体溶液的制备用样品稀释液稀释实验(二)中的纯化抗体得到溶液，抗体 在溶液中的浓度为5ng/mL ；样品稀释液为0. 002mol/L的磷酸盐缓冲液。不同浓度的链霉素溶液的制备用样品稀释液稀释链霉素得到溶液。d、用PBST溶液(PBS,0. 05% Tween20)洗涤3次，250 μ L每孔，甩干孔中液体，加 入HRP标记的鼠抗His标签单克隆抗体，37°C孵育1小时；e、用 PBST 溶液(PBS,0. 05%Tween20)洗涤 3 次，250 μ L 每孔；加入 TMB 显色，37°C 反应10分钟，加入2M硫酸终止显色反应，每孔50 μ L，使用酶标仪进行读数。实验设3次重复。结果如下1)吸光度值与每孔所加入的标准品溶液中链霉素的浓度成反比；证明，所表达纯
10化得到的单链抗体具有针对链霉素的结合特异性，并呈现线性关系，说明该抗体可用于对 链霉素的免疫检测。2)半抑制率(IC5tl)阳性对照孔(即不添加链霉素标准品溶液的孔)的吸光度值 为Btl，各实验孔的吸光度值为B，当BziBtl为50%时所对应的链霉素标准品溶液的浓度即为 半抑制率(IC50)。该单抗的半抑制率(IC50)为0. 75ng/mL。2、抗体的亲和常数测定方法取定量的一定稀释度的抗体，分别加入逐渐增加的抗原里，可使抗体的结合 达到饱和，以结合部分(B)为纵坐标，抗原浓度(mol/L)为横坐标绘制饱和曲线，求出抗体 饱和程度为50%时的游离抗原浓度，其倒数即为该抗体在此稀释度下的亲和常数。结果抗体的亲和常数为2. 61X 109L/mol。实施例2、检测链霉素的酶联免疫试剂盒及其制备一、酶联免疫试剂盒由下述物质组成1、包被链霉素与载体蛋白偶联物(STM-BSA)的酶标板；2、链霉素抗体实施例1中所述单链抗体。抗体工作液的浓度为5. Ong/mL，抗体 工作液是用样品稀释液稀释实施例1中的纯化抗体得到的到的；3、链霉素标准品链霉素标准品为硫酸链霉素，标准品溶液浓度分别为 0 μ g/L、0. 5 μ g/L、1· 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、13. 5 μ g/L、40. 5 μ g/L ；硫酸链霉素购自美国 Sigma-Aldrich公司；产品目录号为46754 ；用样品稀释液稀释成上述各浓度；4、酶标二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗HIS标签单克隆抗体；购自美国 Sigma-Aldrich公司，产品目录号为A7058 ；5、底物显色液由A液和B液组成，A液为2%过氧化脲的水溶液，B液为1 %四甲 基联苯胺的水溶液；6、终止液0. 2M硫酸水溶液；7、洗涤液每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的将IOml吐温20、5g叠 氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0. 01M, PH值为7.4;8、样品浓缩液0. 04mol/L的磷酸盐缓冲液；将其进行20倍稀释，成为样品稀释液
后使用。二、试剂盒组分的制备(一)包被原的制备硫酸链霉素购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为46754 ；(1)将145. 7mg硫酸链霉素溶于超轻水(DDW)中，得到硫酸链霉素的水溶液；将 21. 9mg羧甲基羟胺半盐酸盐溶于超轻水(DDW)中，得到羧甲基羟胺半盐酸盐的水溶液；将 硫酸链霉素的水溶液和羧甲基羟胺半盐酸盐的水溶液混合均勻，用浓度为lmol/L的碳酸 钠缓冲液将其PH值调至8. 0，室温(25°C )磁力搅拌24h ；再将该混合物置真空干燥箱，45°C 烘干称重，将得到的物质记作物质I，称得该物质I的重量为IOOmg ；(2)将IOOmg物质I溶于500 μ L 2- (N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，得到的 溶液记作溶液I；将20. 7mg碳化二亚胺(EDC)溶于200 μ L 20% (体积百分含量)乙醇水溶液中，
11将得到的溶液记作溶液II ；将50mgBSA溶于ImL MES缓冲液中，将得到的溶液记作溶液III ；将溶液I、溶液II和溶液III混勻，室温(25°C )磁力搅拌24h，将得到的溶液记作溶 液IV ；(3)将溶液IV在4°C下对PBS(pH7. 2)透析，透析后的反应液进一步用葡聚糖凝胶 Sephadex G-25纯化，制得人工抗原STM-BSA，冻干-20°C保存备用。( 二 )包被有包被原的酶标板及其制备包被有合成抗原STM-BSA的聚苯乙烯酶标板用IOmM的碳酸盐溶液将抗原作 1 50000倍稀释(6. Oyg/mL)，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100yL，37°C温育2h，倾 去包被液，用洗涤液稀释20倍后洗涤3次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200 μ L封闭 液，37°C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。包被缓冲液pH9. 6,0. 05mol/L的碳酸钠缓冲液；封闭液每1升封闭液按照如下方法配制将5ml马血清、Ig叠氮化钠、30g酪蛋 白混合，用磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，得到封闭液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为 0. 02M, pH 值为 7. 2。三、试剂盒检测方法(一)样品前处理1、检测样本为牛奶取牛奶样品，4000r/min离心lOmin，吸除上层脂肪；取ImL去 除脂肪的牛奶样品至15mL玻璃管中；用样品稀释液按1 40比例进行稀释(即50μ L牛 奶样品加入1950 μ L样品稀释液)。取50 μ L用于分析。2、检测样本为奶粉称取Ig奶粉，溶于40mL样品稀释液中，混合均勻，取50μ L用 于检测。3、检测样本为鸡肝除去肝脏中的脂肪部分，用均质器均质肝脏样品；称取 5. O士0. 05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入20mLPBST缓冲液混合振荡30min ； 4000r/min离心IOmin ；移取2mL上层清液至IOmL玻璃离心管中，加入3mL正己烷用振荡器 充分振荡5min ；4000r/min离心IOmin ；除去上层，取下层清液用样品稀释液按1 10体积 比进行稀释(50 μ L下层清液加入450 μ L样品稀释液)；取50 μ L水相进行分析。4、检测样本为鸡肉除去鸡肉中的脂肪部分，用均质器均质鸡肉样品；称取 2士0. 05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入8mL PBST缓冲液混合振荡5min，加入正 己烷5mL充分上下振荡混合IOmin后静置Ih ；4000r/min离心15min ；移取ImL中间层溶液 至IOmL玻璃离心管中，加入ImL正己烷，用振荡器充分振荡5min，4000r/min离心15min ；除 去上层，取下层清液用样品稀释液按1 10体积比进行稀释(50 μ L下层清液加入450 μ L 样品稀释液)；取50 μ L用于分析。5、检测样本为蜂蜜称取1 士0.05g蜂蜜样品至50mL聚苯乙烯离心管中，加入 IOmL样品稀释液，用振荡器振荡IOmin至蜂蜜全部溶解，4000r/min、室温(20_25°C )离心 IOmin,直至清亮，取上清液50 μ L进行分析。(二)用试剂盒检测1、标准曲线的制作向包被有包被原的酶标板微孔中加入链霉素标准品溶液50 μ L，再加入链霉素抗体工作液50 μ L，用盖板膜封板，37°C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250 μ L 洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入酶标二抗工作 液100μ L，37°C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每孔加入底物显色液， 轻轻振荡混勻，37°C恒温箱避光显色15min，每孔加入终止液50 μ L，轻轻振荡混勻，用酶标 仪，测定每孔吸光度值。用每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准) 的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以链霉素标准品浓度(yg/L)的半对 数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。得到的标准曲线如图1所示。百分吸光度值(%) = (Β/Β。)X 100%2、样品中链霉素浓度的测定向包被有包被原的酶标板微孔中加入检测样本溶液50 μ L，再加入链霉素单链抗 体工作液50 μ L，用盖板膜封板，37°C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250 μ L 洗板液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物 酶标记的抗体工作液100μ L，37°C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，重复洗涤步骤，每 孔加入混合底物显色液100 μ L，轻轻振荡混勻，37°C恒温箱避光显色15min，每孔加入终止 液50μ L，轻轻振荡混勻，用酶标仪，测定每孔吸光度值。结果判断用每个检测样本溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标 准)的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。相对应每一个检测样本溶液的百 分吸光度值，则可从标准曲线上读出检测样本溶液的吸光度值，再根据标准品溶液的浓度 值换算出样本溶液中链霉素的残留量。四、试剂盒检测效果评价(一)准确度和精密度试验向不含链霉素的样品(牛奶、蜂蜜、鸡肉和鸡肝)中添加链霉素标准品，使链霉素 标准品在样品中的终浓度分别为5、10和20 μ g/L或μ g/kg ；将添加后的样品分别按照实验三中所述方法进行前处理，得到检测样本溶液。从三个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，检测方法如实验三中所 述，每个实验重复5次，分别计算变异系数。结果分别见表1。表1精密度测定结果统计表
1权利要求
一种单链抗体，由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N末端起第1 123位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的的氨基酸序列如序列1自N末端起第139 248位氨基酸残基所示。
2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于所述连接所述重链可变区和轻链可 变区的短肽的氨基酸序列如序列1自N末端起第124-138位氨基酸残基所示。
3.权利要求1或2所述单链抗体的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)、2)、3)、4) 或5)所示1)所述重链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5'末端起第1-369位核苷酸所 示的DNA分子；2)所述轻链可变区的编码基因为自序列表中序列2的5'末端起第415-744位核苷酸 所示的DNA分子；3)所述连接重链可变区和轻链可变区的短肽的编码基因为自序列表中序列2的5'末 端起第370-414位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列2所示的DNA分子；5)在严格条件下与1)、2)或3)、4)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系和表达盒。
6.权利要求1或2所述单链抗体在检测链霉素或双氢链霉素中的应用。
7.—种检测链霉素或双氢链霉素的免疫试剂盒，为下述1)、2)、3)或4)中任一所述试 剂盒1)试剂盒中包括链霉素半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1或2所述单链抗体和 酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；2)试剂盒中包括链霉素半抗原的酶标记物、权利要求1或2所述单链抗体和抗抗体； 其中，所述抗抗体作为包被原；3)试剂盒中包括链霉素半抗原的酶标记物、权利要求1或2所述单链抗体；其中，权利 要求1或2所述单链抗体作为包被原；4)试剂盒中包括链霉素半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1或2所述单链抗体的 酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原。
8.根据权利要求7所述的免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包括链霉素标准品溶液、洗涤液和样品稀释液；所述链霉素标准品为硫 酸链霉素；所述链霉素标准品溶液为如下各浓度的溶液0 μ g/L、0. 5 μ g/L、1. 5 μ g/L、4. 5 μ g/L、 13. 5μ g/L、40. 5μ g/L ；每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的将IOml吐温20，5g叠氮化钠和990ml 磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0. 005M-0. 015M，具体为 0. 01M, pH 值为 7. 2-7. 6，具体为 7. 4 ；所述样品浓缩液为浓度为0. 03mol/L-0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液，具体为0. 04mol/L 的磷酸盐缓冲液；所述链霉素半抗原与载体蛋白的偶联物是按照如下方法制备得到的(1)将每145. 7mg链霉素半抗原溶于水中，得到链霉素半抗原的水溶液；将每21. 9mg 羧甲基羟胺半盐酸盐溶于水中，得到羧甲基羟胺半盐酸盐的水溶液；将所述硫酸链霉素的 水溶液和所述羧甲基羟胺半盐酸盐的水溶液混合均勻，调节PH值至8. 0，25°C磁力搅拌 24h，干燥，将得到的物质记作物质I ； (2)将所述物质I溶于500 μ L 2_(Ν_吗啉代)乙磺 酸缓冲液中，得到的溶液记作溶液I ；将每20. 7mg碳化二亚胺溶于200 μ L 20% (体积百 分含量)乙醇水溶液中，将得到的溶液记作溶液II 将50mg载体蛋白溶于ImL MES缓冲液 中，将得到的溶液记作溶液III ；将溶液I、溶液II和溶液III混勻，25°C磁力搅拌24h，将得到 的溶液记作溶液IV ； (3)将所述溶液IV进行透析，得到所述链霉素半抗原与载体蛋白的偶 联物；所述链霉素半抗原为硫酸链霉素；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血 清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清白蛋白；所述抗抗体为鼠抗HIS标签单克隆抗体。
9.一种检测链霉素或双氢链霉素的胶体金试纸，包括样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和 吸水垫，其依次连接；所述胶体金垫包被有胶体金标记的权利要求1或2所述单链抗体；所 述反应膜上含有检测带和质控带，检测带位置包被有权利要求8中所述链霉素半抗原与载 体蛋白的偶联物，质控带位置包被有鼠抗HIS标签单克隆抗体。
10.一种检测样品中链霉素或双氢链霉素的方法，为如下I )或II )所示I)检测样品中链霉素或双氢链霉素的方法包括如下步骤1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；2)用权利要求7或8所述免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；所述前处理的方法为下述a)、b)、c)、d)和e)中的任一a)所述待测样品为牛奶；将所述待测样品4000r/min离心lOmin，吸除上层脂肪，得到 去除脂肪的待测样品；取ImL所述去除脂肪的待测样品与样品稀释液混合，得到的混合溶 液即为待测样本溶液；所述去除脂肪的待测样品与样品稀释液的体积比为1 39;b)所述待测样品为奶粉；将每Ig所述待测样品与40mL样品稀释液混合均勻，得到的 溶液即为待测样本溶液；c)所述待测样品为鸡肝；去除所述待测样品中的脂肪，得到去除脂肪的待测样品；将 每5. O士0. 05g去除脂肪的待测样品的均质物与20mL PBST缓冲液混合，振荡30min，4000r/ min离心lOmin，取2mL上层清液；将所述2mL上层清液与3mL正己烷振荡混合5min，4000r/ min离心lOmin，取下层清液；将所述下层清液与样品稀释液混合，得到的混合溶液即为待 测样本溶液；所述下层清液与样品稀释液的体积比为1 9;d)所述待测样品为鸡肉；去除所述待测样品中的脂肪，得到去除脂肪的待测样品；将 每2士0. 05g所述去除脂肪的待测样品的均质物与8mL PBST缓冲液混合振荡5min，加入5mL 正己烷振荡混合lOmin，静置lh，4000r/min离心15min，取ImL中间层溶液；将所述ImL中 间层溶液与ImL正己烷振荡混合5min，4000r/min离心15min，取下层清液；将所述下层清 液与样品稀释液混合，得到的混合溶液即为待测样本溶液；所述下层清液与样品稀释液的 体积比为1:9;e)所述待测样品为蜂蜜；将每1士0.05g所述待测样品用IOmL样品稀释液溶解， 200C -25°C、4000r/min离心lOmin，取上清液，即得到待测样本溶液；II )检测样品中链霉素或双氢链霉素的方法包括如下步骤1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；2)用权利要求9所述胶体金试纸对所述待测样本溶液进行检测； 所述前处理的方法为下述a)或b)a)所述待测样品为牛奶；将所述待测样品与样品稀释液混合，得到的混合溶液即为待 测样本溶液；所述待测样品与样品稀释液的体积比为1 (4-6)或1 5;b)所述待测样品为蜂蜜；将所述待测样品与样品稀释液混合，得到的混合溶液即为待 测样本溶液；所述待测样品与样品稀释液的体积比为1 (3-5)或1 4;所述样品稀释液为将所述样品浓缩液稀释20倍得到的。
全文摘要
本发明公开了一种链霉素抗体及其应用。该抗体由重链可变区、连接重链可变区和轻链可变区的短肽、轻链可变区依次连接组成，所述重链可变区的氨基酸序列如序列1自N端起第1-123位氨基酸残基所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列1自N端起第139-248位氨基酸残基所示。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的抗体、试剂盒、胶体金试纸及检测方法在链霉素的检测中将发挥重大作用。
文档编号G01N33/531GK101955538SQ20101016518
公开日2011年1月26日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者刘丹, 吴小平, 师伟, 徐飞, 李杰超, 江海洋, 沈建忠, 王世恩, 王奇昌, 王战辉, 王照鹏, 王进 申请人:北京维德维康生物技术有限公司