专利名称：一种精子顶体反应试剂盒及诱发顶体反应检测的方法和顶体反应状况评估的方法
技术领域：
本发明涉及精子顶体功能筛查，特别是在体外摸拟人体内受精的环境，在体外启 动精子获能、诱发顶体反应，通过荧光染色来评价获能精子发生顶体反应的能力，从而评估 精子穿透卵母细胞并使之受精的能力，为不育症病因分析、辅助生殖治疗方案的选择提供 理论依据。
背景技术：
男性及其相关因素至少占不孕不育夫妇病因的50%。临床实践中主要靠检测精子 密度、活力和形态等指标的精液常规分析，来评价男性生育能力，但常规精液分析提供的指 标只反映了精子的质量，而只有精子的功能才能反映精子体内外的授精能力(生育能力)， 因此仅依靠精液常规来解释男性不育的原因和判断男性生育能力是远远不够的。然而临床 实践中，全面评价精子功能是极其困难的。近几十年来，围绕精卵相遇、结合、授精及胚胎生长发育等一系列生理过程，研究 人员和临床工作者探索了多种能反映这些生理过程的精子功能试验，其中最重要的是精子 顶体功能试验。顶体是精子特有的细胞结构，参与包括精卵识别、结合、穿透等受精过程的 最关键步骤，对精子授精能力起决定作用。顶体反应发生在精子与卵母细胞透明带结合之 后、精子穿透卵母细胞膜并使卵母细胞受精之前，是卵母细胞自然受精的必要环节之一。如 无顶体的圆头精子症，精子完全不能与卵子结合，该类患者即使应用体外授精-胚胎移植 技术(IVF-ET)治疗也不能授精。目前精子顶体功能试验包括精子形态和完整性测定试验、透明带诱发精子顶体 反应测定试验等，尽管这些试验对评估精子受精能力、选择和预测IVF(体外授精)或 ICSI (单精子卵泡浆内注射)的成功率有积极作用，但因这些检测方法多处于研究阶段，世 界卫生组织推荐的方法学太过繁琐和复杂，方法学的稳定性和重复性较差，难以在临床上 作为常规方法得以普及，缺乏产业化的产品。现有的实验方法，要求整个试验过程一气呵 成，从精液标本的预处理、体外获能、钙离子诱发到涂片荧光染色和结果判读，整个试验费 时6 7小时，实验强度大，难以临床应用及普及。且现有试验方法的荧光染色系统强度不 高，通常会在半小时内迅速衰减，影响了结果判读的准确性，会造成检测结果的不稳定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种可将精子诱发顶体反应检测实验分为两部 分进行以降低实验强度、同时使试验结果更加准确、重复性好的试剂盒，同时提供利用这种 试剂盒进行精子诱发顶体反应检测的方法，并提供利用这种试剂盒进行精子顶体反应状况 评估的方法。为解决上述技术问题，本发明提供一种精子顶体反应试剂盒，其特征在于，包括组 织片保存液、荧光结合物、荧光封固液。
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所述组织片保存液每100ml含有戊二醛0. 5ml、甲醇5ml、乙醇2ml、聚乙烯吡咯 酮PVPO. 2g、福尔马林1ml，余量为纯净水。所述荧光结合物由荧光结合物PSA-FITC与荧光结合物保存液组成，pH7. 5 8. 0， 每100ml荧光结合物保存液中加入lmg荧光结合物PSA-FITC ；其中所述荧光结合物保存液以纯净水溶解如下物质配制而成，每100ml含有荧光素标记物0. 5 10ng，其中，荧光素为异硫氰酸荧光素、四甲基巨异硫氰酸 若丹明；被标记物为豌豆凝集素、花生凝集素或刀豆蛋白A ；摩尔比为1 2的甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物0. 4 2. 4g;Tris 缓冲液0. 7 3. 5g ；NaCl :() 3 1. 5g ；酪蛋白0.1 0.5g;水杨酸钠0.2 2. Omg ；防腐剂 Proclin300 20 lOOul ；余量为纯净水。所述荧光封固液以纯净水溶解如下物质配制而成，pH8. 5-9. 0，每100ml含有N-(l，3_ 二甲基丁基)_N'-苯基对苯二胺0. 05 0. 5g ；聚乙烯醇PVA :0. 2 1. 6g ；聚乙二醇8000 :0. 1 1. 5g ；Tris 缓冲液1. 0 5. Og ；NaCl :0. 4 1. 6g ；小牛血清白蛋白BSA :0. 5 5g ；NaN3 或硫柳汞:0. 01 0. 05g ;甘油6% 60%;余量为纯净水。所述精子顶体反应试剂盒还包括钙离子载体。所述钙离子载体为钙离子载体A23187。所述精子顶体反应试剂盒还包括80%密度梯度溶液、40%密度梯度溶液、精子洗 涤液A、精子培养液、5X精子洗液B、对照液、固定液、组织载片、长形盖玻片。同时，本发明还提供一种利用所述试剂盒进行精子诱发顶体反应检测的方法，其 特征在于，包括如下步骤步骤一将新鲜的精液标本完全液化，再以密度梯度法或上泳法提取活力精子，然 后计数提取后活动精子的密度，以精子培养液配制密度为1X106活动精子/ml的精子悬 液；步骤二 以容量为1. 5ml的洁净Eppendorf管作为反应管，每例检测标本均同时设 测定管和对照管，每管加入步骤二中制备得到的精子悬液0. 5ml，在C02占体积含量5%、空 气占体积含量95%的二氧化碳培养箱中在37°C下孵育3小时，以诱导精子获能；步骤三向测定管内避光加入钙离子载体2. 5ul,向对照管中加入对照液2. 5ul, 分别混勻；将两管在C02占体积含量5%、空气占体积含量95%的二氧化碳培养箱中在37°C 下孵育15分钟；
步骤四取出反应管，迅速在对照管和测定管中分别加入精子洗液B应用液1ml ； 以600g相对离心力离心5min后去除上清液，加入精子洗液B应用液1. 5ml，再次以600g相 对离心力离心5min后去除上清液，然后以精子洗液B应用液调整精子悬液体积至lOOul ；步骤五取步骤四得到的10iU精子悬液均勻涂布于组织载片上的涂片窗内，空 气中自然干燥；步骤六将组织载片完全浸泡于盛有固定液的反应池内，盖紧盖后置室温固定 30min ；生理盐水洗涤3次，每次浸泡2min ；步骤七去除组织载片表面及涂片窗内的水分，组织载片干燥后在涂片窗内迅速 加入所述荧光结合物40iU，水平放置于湿盒内，37°C反应60min，以蒸馏水洗涤3次，每次 浸泡2min ；步骤八步骤七得到的组织片自然干燥后，在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖 上盖玻片，在激发光450-490nm、蓝色滤光片的荧光显微镜100倍物镜下观察结果，其中，每 个涂片窗至少观察计数400个精子，记录发生顶体反应的精子数量，并进行结果计算和判定。所述的精子诱发顶体反应检测的方法中，当不能一次性连续完成检测工作，则可 在所述步骤五之后、步骤六之前，执行如下步骤将干燥后的组织载片完全浸泡于盛有组织 片保存液的反应池内，盖紧盖后置于2-8°C保存，在72小时内取出，然后继续执行所述步骤 六 八。本发明还提供一种利用所述试剂盒进行精子顶体反应状况评估的方法，其特征在 于，包括如下步骤步骤一简单洗涤精子标本或以上泳法提取高活力精子或以密度梯度法提取高活 力精子，然后以生理盐水将精子密度调节至5X106/ml ；步骤二 取10iU精子悬液均勻涂布于组织载片上的涂片窗内，空气中自然干燥；步骤三将组织载片完全浸泡于盛有固定液的反应池内，盖紧盖后置室温固定 30min ；生理盐水洗涤3次，每次浸泡2min ；步骤四去除组织载片表面及涂片窗内的水分，在涂片窗内迅速加入荧光结合物 50 iil，水平放置于湿盒内，37 °C反应60min ；步骤五然后以蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min ；步骤六组织片自然干燥后，每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在激 发光450-490nm、蓝色滤光片的荧光显微镜100倍物镜下观察结果，其中，每个涂片窗至少 观察计数400个精子，记录各类精子顶体状态的数量精子头部1/2以上部位有明亮均勻的 荧光为顶体完整，计为AI ；仅在精子头部赤道板有一条荧光带或者所有的顶体区均无荧光 为顶体反应，计为AR;其它精子为异常顶体；计算AI、AR占所观察精子的百分率。本发明的有益效果本发明的试剂盒及其精子诱发顶体反应检测的方法和精子顶体反应状况评估的 实验方法，经过系统优化，相比较传统试验方法操作更加简便，试验过程更加紧凑，确保了 试验结果的准确性和重复性，可以临床应用推广。本发明的精子顶体反应检测试剂盒中含 有组织片保存液，可让整个精子诱发顶体反应检测试验过程分成两部分进行第一部分是 精液标本的预处理、体外获能和钙离子诱发；第二部分是涂片荧光染色和结果的判读。这种
6组织片保存液可以有效终止和保存第一部分实验得到的样品和试验结果，在随后72小时 内的任意时间里进行第二部分的操作都不会影响最终的试验结果，缓解了临床大规模检测 时的工作强度。实验可以分成两部分后，使得精子获能和钙离子诱发之后的标本可以暂时 储存起来，第二天可以集中进行荧光染色，以便于临床进行批量化检测。如图1所示，三个 实验标本在第一部分实验完成后，分别分4个不同时间进行第二部分实验，分别是不保存 于组织液而直接进行第二部分实验、以及保存于所述组织液中于24小时、48小时和72小时 分别取出进行第二部分实验，从图中可见，对同一标本而言，4个不同时间得到的顶体诱发 率波动很小，证明在组织片保存液中保存72小时不影响诱发顶体反应检测的实验结果。进一步技术方案中，本发明的试剂盒提供了一种新的荧光染色系统，包括荧光结 合物和荧光封固液，使得荧光强度得到极大的加强，反应时间大大缩短，荧光强度可以稳定 15天不衰减，从而使检测结果更加稳定、易判读，也保证了结果的可重复性。如图2所示，是 采用发明的试剂盒进行荧光染色得到的显微照片，可以非常清晰地看到未发生顶体反应的 精子整个精子头部顶体区发荧光，而发生顶体反应的几个精子头部仅赤道板发荧光。如图3 是本发明的荧光封固液与现有的其它同类试剂性能比较图，图3A 图3C是在ND、3% ND、10%ND下分别进行的抗荧光衰减系数(矩形图)和EM1亮度值(折线图)比较图，图 中可以看到，本发明的荧光封固液与传统甘油方案、传统荧光封固液(PPD)方案、和本领域 现有技术中的SlowFade light商品试剂和ProLong商品试剂比较后得知，本发明的荧光封 固液的抗荧光衰减系数接近100%，抗荧光衰减系数和亮度值均远远高于现有的其他荧光 封固液方案。图4是本发明的荧光封固液封固组织片后4-8°C保存，在4个月之内的每周进 行组织片荧光稳定性检测结果，图中不同时间对应的矩形图可以看到，抗荧光衰减系数总 的趋势是有衰减，但衰减很少；折线图中可以看到，EM1亮度值总的趋势是减小，但减小的 量很少。这都说明本发明的荧光封固系统荧光强而稳定、不易衰减。本发明的试剂如果不进行钙离子诱发，则可以用于精子顶体反应状况评估、作为 精子顶体完整性测定的试剂，即同一个试剂盒可同时可以满足两个临床检测项目的需要。
图1是本发明的精子诱发顶体反应检测的方法在第一部分实验完成后将标本保 存于组织片保存液中、并于72小时内的不同时间取出进行第二部分实验得到的顶体诱发 率比较的柱形图。图2是采用发明的试剂盒进行荧光染色得到的显微照片，图2A是未发生顶体反应 的精子特征；图2B是发生顶体反应的精子特征。图3是本发明的荧光封固液与其它同类试剂性能比较图；图3A是在ND下进 行的抗荧光衰减系数(矩形图)和EMi亮度值(折线图)比较图；图3B是在3% ND下进行的抗荧光衰减系数(矩形图)和亮度值(折线图) 比较图；图3C是在10% ND下进行的抗荧光衰减系数(矩形图)和EM:亮度值(折线图) 比较图。图4是本发明的荧光封固液封固组织片后4_8°C保存，在4个月之内的不同时间取 出进行组织片荧光稳定性检测结果，其中矩形图表示抗荧光衰减系数，折线图表示EMi亮度 值。
具体的实施方式本发明的检验原理是钙离子载体诱发、荧光染色法。钙离子流入精子体内可启动 精子发生顶体反应。使用钙离子载体A23187处理，诱导钙离子流入精子内部，使其发生顶 体反应；由于精子顶体膜表面含有能与凝集素特异性结合的糖蛋白，通过凝集素荧光染色 观察精子顶体区的变化，从而判定顶体反应的发生状况。本实施例的试剂盒由如下(1) (13)项组成
(1)80%密度梯度溶液1瓶25ml
(2) 40%密度梯度溶液1瓶25ml
(3)精子洗涤液A1瓶80ml
(4)精子培养液1瓶80ml
(5)5X精子洗液B1瓶50ml稀释至250ml
(6)钙离子载体1瓶150ul
(7)对照液1瓶300ul
(8)固定液1瓶100ml
(9)组织片保存液1瓶100ml
(10)荧光结合物(FITC)1瓶冻干粉复溶至5ml
(11)荧光封固液1瓶5ml
(12)组织载片2盒10块/盒8孔/块
(13)长形盖玻片20块。
本发明适用仪器
1.本试剂盒适用仪器荧光显微镜
2.操作过程中用到的其他设备
1)2-8°C药品保存箱5)光学显微镜
2)-20°C 冷柜6) 二氧化碳培养箱
3) 37 °C水浴箱7)超净工作台
4)低速离心机
3.其他需要的材料
1)精液采样装备8) 50ml玻璃量筒
2)纯化水9) 50ml玻璃烧杯
3) 1-10 u 1数字可调移液枪和一次吸头10) 10ml锥形离心管
4) 20-100 u 1数字可调移液枪和一次吸头ll)Eppendorf 管
5) 100-1000 u 1数字可调移液枪和-一次吸头12) 20ml装塑料试剂瓶
6) 一次性塑料吸管13)湿盒
7) 5ml、10ml玻璃吸管14) 一次性使用手套
实施例1
一、试剂盒制备
1.选用现有技术中的通用产品、按上述规格和用量准备好80%密度梯度
40%密度梯度溶液、精子洗涤液A(酸碱度为7. 2 7. 6)、精子培养液、5X精子洗液B、钙 离子载体、对照液、固定液、组织载片、长形盖玻片。其中钙离子载体为Sigma公司提供的A23187钙离子载体。试剂盒中也可以不包含这些现有产品的物质，而由使用者在实验前自 行准备这些物质。2.配制组织片保存液。取戊二醛0. 5ml、甲醇5ml、乙醇2ml、PVP(聚乙烯吡咯 酮)0. 2g和福尔马林1ml与纯净水混合，得到100ml组织片保存液。3.制备荧光结合物。首先配制荧光结合物保存液取荧光素标记物0. 5ng,甲基 丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯共聚物(1 2) :0.4g，Tris缓冲液0.7g，NaCl :0.3g，酪蛋白 0. lg，水杨酸钠0. 2mg, Sigma公司的防腐剂Proclin300 :20ul，将这些物质溶解到余量的 纯净水中，配制成pH7. 5 8. 0的荧光结合物保存液100ml。再将荧光结合物PSA-FITC lmg 加入得到的100ml荧光结合物保存液中，然后制成冻干粉1瓶，即为本试剂盒中的荧光结合 物。其中，该荧光素标记物是Sigma公司生产的PSA-FITC，荧光素为异硫氰酸荧光素、 四甲基巨异硫氰酸若丹明；被标记物为豌豆凝集素、花生凝集素或刀豆蛋白A。其中，Tris缓冲液配方Tris(三羟甲基氨基甲烷)60. 57g、lN HCL约420ml、双 蒸水；Tris缓冲液配制方法先以少量双蒸水(300 500ml)溶解Tris，加入HC1后，用 HCl(lN)或NaOH(lN)将pH调至7. 6，最后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4°C冰箱中保 存。4.制备荧光封固液。取N-(l，3_ 二甲基丁基)_N'-苯基对苯二胺0. 05g、聚乙 烯醇 PVA 0. 2g、聚乙二醇 8000 0. lg、Tris 缓冲液1. 0g、NaCl 0. 4g、Sigma 公司提供的小 牛血清白蛋白BSA 0. 5g、NaN3 0. Olg ；甘油6%，将这些物质溶解到余量的纯净水中，配制 成100ml pH8. 5-9. 0的荧光封固液。试剂盒中只需5ml。二、进行诱发精子顶体反应检测(一 )试剂准备1.两种浓度的密度梯度溶液、精子洗液A和精子培养液均不含防腐剂，从已开盖 后的试剂瓶中吸取试剂时，应注意避免污染。不得使用已产生絮状沉淀物的液体试剂。推 荐上述试剂开封后一次性分装-20°C保存，用前取出解冻，未用完试剂置2-8°C保存(不再 冻存)，尽量避免多次反复使用。2.精子洗液B应用液配制50ml 5X精子洗液B加4份体积的纯化水稀释至 250ml，混勻，得到精子洗液B应用液。4°C保存可用2_3周。3.使用前，需将试剂盒平衡至室温，并将两种浓度的密度梯度溶液、精子洗液A、 精子培养液置37°C孵育0. 5-1小时。4.在荧光结合物冻干瓶中加入5ml纯净水，混勻，得到复溶的荧光结合物备用。(二)进行检测程序1.将新鲜的精液标本置37°C或室温30-60min，待其完全液化。若液化迟缓，则可 在精液中加入少量精子洗液A后，以吸管反复吹打精液促进其完全液化。2.将上述得到的完全液化的精液以密度梯度法提取活力精子，方法如下1)吸取80%密度梯度溶液0.5ml于洁净锥底试管底部，再在其液层上面，轻轻加 入40%密度梯度溶液0. 5ml，小心操作，注意不要打乱两种液体的界面。2)轻轻加入0. 4ml精液于40%密度梯度溶液之上。400g离心20分钟。3)用吸管小心吸去精液和40%密度梯度溶液(注意勿吹动底层精子)；换一支新的吸管，将吸液管预先捏成负压状态后，然后轻轻插入到锥底管最底部，缓慢吸取沉降在 底部的精子团悬液0. 2-0. 4ml，将此吸取液转移至另一支新的锥形管。4)新的锥形管中加入精子洗液A 1. 5ml，轻轻混合后，400g离心5分钟。5)小心吸去精子洗液，留下底层精子沉淀团；加入精子培养液0.2ml，混勻。6)计数提取后活动精子的密度，以精子培养液配制密度为IX 106活动精子/ml的 精子悬液1.2ml (例如提取后活动精子的密度为50X 106/ml，则取该精子悬液25ul，加入 精子培养液1.2ml，混勻即可)。3.以容量为1. 5ml的洁净Eppendorf管作为反应管。每例检测标本均同时设测定 管和对照管。每管加入上述已制备好的精子悬液(密度为1X106活动精子/ml)0.5ml，在 二氧化碳培养箱中(5% C02、95%空气、37°C )孵育3小时，以诱导精子获能。4.向测定管内避光加入钙离子载体2. 5ul，向对照管中加入对照液2. 5ul，混勻； 将两管在二氧化碳培养箱中(5% C02、95%空气、37°C )孵育15分钟。5.取出反应管，迅速在对照管和测定管中分别加入精子洗液B应用液1ml ；600g 离心5min后去除上清液，加入精子洗液B应用液1. 5ml，再次600g离心5min后去除上清 液，最后以精子洗液B应用液调整精子悬液体积至lOOul。6.取10 yl精子悬液均勻涂布于组织载片上的涂片窗内，空气中自然干燥。7.将干燥后的组织载片完全浸泡于盛有组织片保存液的反应池内，盖紧盖后置于 2 8°C保存。(注意反应池内的组织片保存液可至少反复使用3 5次，使用过程中应 尽量避免保存液直接暴露于空气中，以免试剂挥发而失效。)8.在存放36小时时取出组织载片，将组织载片完全浸泡于盛有固定液的反应池 内，盖紧盖后置室温固定30min ；生理盐水洗涤3次，每次浸泡2min。(注意反应池内的固 定液可至少反复使用3 5次，使用过程中应尽量避免固定液直接暴露于空气中，以免试剂 挥发而失效。)9.去除组织载片表面及涂片窗内的水分(可以洗耳球轻轻吹几下)，组织载片干 燥后在涂片窗内迅速加入复溶后的荧光结合物(FITC)40iU，水平放置于湿盒内，37°C反应 60min。以蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。10.组织片自然干燥后，每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在激发光 450-490nm(蓝色滤光片)荧光显微镜100X物镜下观察结果。每个涂片窗至少观察计数 400个精子，记录发生顶体反应的精子数量。计数的精子总数不可少于400个，以免产生较 大的计数误差。荧光显微镜的质量与荧光强度直接影响结果观察的准确性，推荐使用功率 不低于100W的荧光汞灯。(三)结果判定与计算未发生顶体反应的精子特征头部顶体区发荧光(参阅图2A)。发生顶体反应的精子特征头部仅赤道板发荧光(参阅图2B)，或者所有的顶体区 均无荧光。结果计算测定管顶体反应率(％ )=测定管中发生顶体反应的精子数量+对照管中被观察 的精子总数 X100% ) = 200^-400X100%= 50% ；对照管顶体反应率(％ )=对照管中发生顶体反应的精子数量+对照管中被观察的精子总数 X100% ) = 20^-400X100%= 5% ；钙离子载体诱发的顶体反应率(％ )=测定管顶体反应率_对照管顶体反应率= 45%。结论根据世界卫生组织推荐参考值判定被测精液为顶体反应正常的精液。世界卫生组织推荐参考值为正常钙离子载体诱发的顶体反应率> 15% ；异常钙离子载体诱发的顶体反应率< 10% ；可能异常钙离子载体诱发的顶体反应率10 15%之间；过早顶体反应孵育3h后，对照管顶体反应率> 20%。三、进行精子顶体反应状况评估检测1.精子标本准备简单洗涤精子①取新鲜精液0. 2ml于锥底离心管中，加入10ml生理盐水，混合，500g离心10分钟。②倾倒弃去上清液，留取底部精子沉淀团。③加入10ml生理盐水，以吸管轻轻混合精子悬液，500g离心10分钟。④倾倒弃去上清液，留取底部精子沉淀团。⑤加入少量生理盐水，混勻，计数精子密度，调节精子密度至5 X 106/ml。2.取10 iU精子悬液均勻涂布于组织载片上的涂片窗内，空气中自然干燥。3.将组织载片完全浸泡于盛有固定液的反应池内，盖紧盖后置室温固定30min; 生理盐水洗涤3次，每次浸泡2min。(注意反应池内的固定液可至少反复使用3_5次，使 用过程中应尽量避免固定液直接暴露于空气中，以免试剂挥发而失效。)4.去除组织载片表面及涂片窗内的水分(可用洗耳球轻轻吹干)，在涂片窗内迅 速加入荧光结合物50 u 1，水平放置于湿盒内，37°C反应60min。5.以蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min。6.组织片自然干燥后，每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在激发光 450-490nm(蓝色滤光片)荧光显微镜100X物镜下观察结果。每个涂片窗至少观察计数 400个精子，记录各类精子顶体状态的数量。7.结果观察与计算。顶体完整(AI)精子头部1/2以上部位有明亮均勻的荧光(参阅图A)。顶体反应(AR)仅在精子头部赤道板有一条荧光带(参阅图B)，或者所有的顶体 区均无荧光。异常顶体除外的其它精子。计算AI、AR的百分率。本实施例中观察了 400个精子，AR精子44个，则AR(% ) =44 + 400X100%= 11%。实施例2一、试剂盒的准备实施例2的试剂盒准备大致同实施例1，所不同的是，在制备荧光结合物时，配 制荧光结合物保存液过程中，取荧光素标记物5ng，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯共聚
11物(1 2) :1.5g, Tris 缓冲液2. 5g，NaCl :0.9g，酪蛋白0. 3g，水杨酸钠1. 4mg，防腐 剂PrOclin300 :60ul，制备方法同实施例1。在制备荧光封固液时取N-(1，3-二甲基丁 基)-N'-苯基对苯二胺0. 2g，聚乙烯醇PVA 0. 9g，聚乙二醇8000 0. 8g，Tris缓冲液 2. 5g，NaCl :1. 0g, Sigma公司提供的小牛血清白蛋白BSA :3g，Sigma公司提供的硫柳汞 0. 03g，甘油30%，制备方法同实施例1。二、进行诱发精子顶体反应检测(一)试剂准备同实施例1。(二)进行检测程序1.将新鲜的精液标本置37°C或室温30-60min，待其完全液化。若液化迟缓，则可 在精液中加入少量精子洗液A后，以吸管反复吹打精液促进其完全液化。2.将上述得到的完全液化的精液以上泳法提取活力精子，并以精子培养液配制密 度为1 X 106活动精子/ml的精子悬液1. 2ml。接着执行实施例1所述的步骤3-6，直到取10 yl精子悬液均勻涂布于组织载片上 的涂片窗内，空气中自然干燥。接着不将干燥后的组织载片保存于组织片保存液中，而是紧 接着直接参照执行实施例1中所述的步骤8，将组织载片完全浸泡于盛有固定液的反应池 内，盖紧盖后置室温固定30min ；生理盐水洗涤3次，每次浸泡2min。然后执行实施例1中 所述的步骤9-10。(三)结果判定与计算测定管顶体反应率(％ )=测定管中发生顶体反应的精子数量+对照管中被观察 的精子总数 X100% ) = 120^-400X100%= 30% ；对照管顶体反应率(％ )=对照管中发生顶体反应的精子数量+对照管中被观察 的精子总数 X100% ) = 80^-400X100%= 20% ；钙离子载体诱发的顶体反应率(％ )=测定管顶体反应率_对照管顶体反应率= 30% -20%= 10%。结论根据世界卫生组织推荐参考值判定本实施例2的被测精液为顶体反应异常 精液。三、进行精子顶体反应状况评估检测1.精子标本准备实施例1中直接检测经简单洗涤后的精子标本，但优选使用经提取后的高活力精 子标本完成检测，因为通过密度梯度法或上泳法将精子从碎片、白细胞、生精细胞和死精子 等干扰物中分离出来，可以获得更准确的检测结果。因此本实施例2中用泳法提取高活力 精子，步骤如下①吸取0. 5-lml已液化的精液至洁净圆底小试管的底部。②换一支新的吸液管，轻轻在精液上层加入1. 0ml精子培养液(或其它类型精子 培养液)。③勿打乱液面分层，保持试管45°角倾斜，37°C孵育lh，活动精子将游动到培养 液中。④小心吸取最上层含有活动精子的培养液0. 6-0. 8ml。
⑤将吸取的最上层液体转移至另一支装有10ml生理盐水的锥底离心管内；⑥300_500g离心5分钟，勿使用制动闸；⑦弃去精子沉淀团上方的生理盐水，使精子沉淀团上方的残存液量不超过2mm ；⑧加入少量生理盐水，混勻，计数精子密度，调节精子密度至5 X 106/ml。然后执行实施例1中相应的步骤2-6，接着进行结果观察与计算。本实施例中观察 了 481 个精子，AR 精子 50 个，则 AR(% ) = 50 + 481X100%= 10.4%。实施例3一、试剂盒制备实施例2的试剂盒制备大致同实施例1，所不同的是，在制备荧光结合物时，配 制荧光结合物保存液过程中，取荧光素标记物10ng，甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯共聚 物(1 2) :2.4g，Tris 缓冲液3. 5g，NaCl :1.5g，酪蛋白0. 5g，水杨酸钠2. Omg，防腐 剂PrOclin300 :100ul，制备方法同实施例1。在制备荧光封固液时取N_(l，3-二甲基丁 基)-N'-苯基对苯二胺0. 5g，聚乙烯醇PVA 1. 6g，聚乙二醇8000 1. 5g，Tris缓冲液 5. Og，NaCl :1.6g，小牛血清白蛋白BSA :5g, NaN30 . 05g，甘油:60%，制备方法同实施例1。二、进行诱发精子顶体反应检测(一)试剂准备同实施例1。(二)进行检测程序步骤1-7同实施例1的步骤1-7，然后参照实施例1的步骤8执行在存放72小 时时内取出组织载片，将组织载片完全浸泡于盛有固定液的反应池内，盖紧盖后置室温固 定30min ；生理盐水洗涤3次，每次浸泡2min。接着执行同实施例1所述的步骤9_10。(三)结果判定与计算测定管顶体反应率(％ )=测定管中发生顶体反应的精子数量+对照管中被观察 的精子总数 X100%= 200^-400X100%= 50% ；对照管顶体反应率(％ )=对照管中发生顶体反应的精子数量+对照管中被观察 的精子总数 X100% ) = 40^-400X100%= 10% ；钙离子载体诱发的顶体反应率(％ )=测定管顶体反应率_对照管顶体反应率= 50% -10%= 40%。结论根据世界卫生组织推荐参考值判定被测精液为顶体反应正常精液。三、进行精子顶体反应状况评估检测方法大致同实施例1，其中以密度梯度法提取高活力精子，同“诱发精子顶体反应 检测”程序中密度梯度法操作步骤。然后以生理盐水将提取后的精子密度调节至5X106/ ml。然后执行实施例1中相应的步骤2-6，接着进行结果观察与计算。本实施例中观察了 435个精子，AR精子65个，则AR(% ) = 65^435X100% = 15%。
权利要求
一种精子顶体反应试剂盒，其特征在于，包括组织片保存液、荧光结合物、荧光封固液。
2.根据权利要求1所述的精子顶体反应试剂盒，其特征在于，所述组织片保存液每 100ml含有戊二醛0. 5ml、甲醇5ml、乙醇2ml、聚乙烯吡咯酮PVPO. 2g、福尔马林lml，余量 为纯净水。
3.根据权利要求1所述的精子顶体反应试剂盒，其特征在于，所述荧光结合物由荧光 结合物PSA-FITC与荧光结合物保存液组成，pH7. 5 8. 0，每100ml荧光结合物保存液中加 入lmg荧光结合物PSA-FITC ；其中所述荧光结合物保存液以纯净水溶解如下物质配制而成，每100ml含有 荧光素标记物0. 5 10ng，其中，荧光素为异硫氰酸荧光素、四甲基巨异硫氰酸若丹 明；被标记物为豌豆凝集素、花生凝集素或刀豆蛋白A ；摩尔比为1 2的甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯共聚物0. 4 2. 4g;Tris 缓冲液0. 7 3. 5g ；NaCl 0. 3 1. 5g ；酪蛋白0. 1 0. 5g;水杨酸钠0. 2 2. Omg ；防腐剂 Proclin300 20 lOOul ；余量为纯净水。
4.根据权利要求1所述的精子顶体反应试剂盒，其特征在于，所述荧光封固液以纯净 水溶解如下物质配制而成，PH8. 5-9. 0，每100ml含有N-(l，3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺0. 05 0. 5g;聚乙烯醇PVA 0. 2 1. 6g ；聚乙二醇 8000 0. 1 1. 5g ；Tris 缓冲液1.0 5. 0g ；NaCl 0. 4 1. 6g ；小牛血清白蛋白BSA 0. 5 5g ；NaN3或硫柳汞:0. 01 0. 05g ;甘油6% 60% ；余量为纯净水。
5.根据权利要求1所述的精子顶体反应试剂盒，其特征在于，所述精子顶体反应试剂 盒还包括钙离子载体。
6.根据权利要求5所述的精子顶体反应试剂盒，其特征在于，所述钙离子载体为钙离 子载体A23187。
7.根据权利要求1所述的精子顶体反应试剂盒，其特征在于，所述精子顶体反应试剂 盒还包括80%密度梯度溶液、40%密度梯度溶液、精子洗涤液A、精子培养液、5X精子洗液 B、对照液、固定液、组织载片、长形盖玻片。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒进行精子诱发顶体反应检测的方法，其 特征在于，包括如下步骤步骤一将新鲜的精液标本完全液化，再以密度梯度法或上泳法提取活力精子，然后计数提取后活动精子的密度，以精子培养液配制密度为1 X 106活动精子/ml的精子悬液；步骤二 以容量为1. 5ml的洁净Eppendorf管作为反应管，每例检测标本均同时设测定 管和对照管，每管加入步骤二中制备得到的精子悬液0. 5ml，在C02占体积含量5%、空气占 体积含量95%的二氧化碳培养箱中在37°C下孵育3小时，以诱导精子获能；步骤三向测定管内避光加入钙离子载体2. 5ul,向对照管中加入对照液2. 5ul，分别 混勻；将两管在C02占体积含量5%、空气占体积含量95%的二氧化碳培养箱中在37°C下孵 育15分钟；步骤四取出反应管，迅速在对照管和测定管中分别加入精子洗液B应用液lml ；以 600g相对离心力离心5min后去除上清液，加入精子洗液B应用液1. 5ml，再次以600g相对 离心力离心5min后去除上清液，然后以精子洗液B应用液调整精子悬液体积至lOOul ；步骤五取步骤四得到的10 yl精子悬液均勻涂布于组织载片上的涂片窗内，空气中 自然干燥；步骤六将组织载片完全浸泡于盛有固定液的反应池内，盖紧盖后置室温固定30min ； 生理盐水洗涤3次，每次浸泡2min ；步骤七去除组织载片表面及涂片窗内的水分，组织载片干燥后在涂片窗内迅速加入 所述荧光结合物40 iU，水平放置于湿盒内，37°C反应60min，以蒸馏水洗涤3次，每次浸泡 2min ；步骤八步骤七得到的组织片自然干燥后，在每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖 玻片，在激发光450-490nm、蓝色滤光片的荧光显微镜100倍物镜下观察结果，其中，每个涂 片窗至少观察计数400个精子，记录发生顶体反应的精子数量，并进行结果计算和判定。
9.根据权利要求8所述的精子诱发顶体反应检测的方法，其特征在于，当不能一次性 连续完成检测工作，则可在所述步骤五之后、步骤六之前，执行如下步骤将干燥后的组织 载片完全浸泡于盛有组织片保存液的反应池内，盖紧盖后置于2-8°C保存，在72小时内取 出，然后继续执行所述步骤六 八。
10.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒进行精子顶体反应状况评估的方法， 其特征在于，包括如下步骤步骤一简单洗涤精子标本或以上泳法提取高活力精子或以密度梯度法提取高活力精 子，然后以生理盐水将精子密度调节至5X106/ml ；步骤二 取10iU精子悬液均勻涂布于组织载片上的涂片窗内，空气中自然干燥； 步骤三将组织载片完全浸泡于盛有固定液的反应池内，盖紧盖后置室温固定30min ； 生理盐水洗涤3次，每次浸泡2min ；步骤四去除组织载片表面及涂片窗内的水分，在涂片窗内迅速加入荧光结合物 50iU，水平放置于湿盒内，37°C反应60min ；步骤五然后以蒸馏水洗涤3次，每次浸泡2min ；步骤六组织片自然干燥后，每个涂片窗内加1滴荧光封固液，盖上盖玻片，在激发光 450-490nm、蓝色滤光片的荧光显微镜100倍物镜下观察结果，其中，每个涂片窗至少观察 计数400个精子，记录各类精子顶体状态的数量精子头部1/2以上部位有明亮均勻的荧光 为顶体完整，计为AI ；仅在精子头部赤道板有一条荧光带或者所有的顶体区均无荧光为顶 体反应，计为AR;其它精子为异常顶体；计算AI、AR占所观察精子的百分率。
全文摘要
一种精子顶体反应试剂盒，包括组织片保存液、荧光结合物、荧光封固液。所述组织片保存液每100ml含有戊二醛0.5ml、甲醇5ml、乙醇2ml、聚乙烯吡咯酮PVP0.2g、福尔马林1ml，余量为纯净水。该试剂盒可进行精子诱发顶体反应检测，如不进行钙离子诱发，则可用于精子顶体反应状况评估、精子顶体完整性测定。组织片保存液可让整个精子诱发顶体反应检测试验过程分成两部分进行，保存第一部分实验得到的样品和试验结果，在随后72小时内的任意时间里进行第二部分的操作都不会影响最终的试验结果，缓解工作强度。荧光染色系统的荧光强、可稳定15天不衰减，检测结果更加稳定、易判读，也保证了结果的可重复性。该试剂盒及测定方法可以临床应用推广。
文档编号G01N21/64GK101865844SQ20101019304
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者程锦军, 胡勇华, 邓少君 申请人:深圳市博锐德生物科技有限公司