专利名称：一种卵黄膜溶膜片的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种溶膜片的制备方法，尤其是涉及一种卵黄膜溶膜片的制备方法。
背景技术：
测定精子顶体酶及生物毒素酶类活力的方法有多种，如滴定法、分光光度法及放射化学法等，其中滴定法由于灵敏度和特异性均不高，已逐渐被淘汰，分光光度法及放射化学法虽较滴定法在特异性、灵敏性方面有所提高，但其操作复杂，影响因素较多，结果的重复性仍显不足。
樊廷俊(动物学报.2000，46(3)308～313)在测定非洲爪蟾孵化酶溶膜活性时所采用的方法是将非洲爪蟾卵与孵化酶一起孵育，每隔10min观察1次，记录卵黄膜被溶解的时间和个数，一般15min内卵黄膜即发生膨胀，50～60min内卵黄膜即可被完全溶解。在该实验中，由于卵黄膜从发生膨胀到完全溶解是一个较慢的渐进过程，故其从量变到质变的临界点难以较精确地判定，从而极大地限制了对该酶溶膜活力的量化研究。
禽类的卵是自然界最大的单个细胞-卵母细胞，主要由卵壳、卵清及卵黄构成。包裹卵黄的外膜-卵黄膜由卵母细胞膜聚合形成。近年来，人们利用鸡卵黄膜的质膜特性，建立了以观察病原微生物侵袭力为目的“穿膜实验模型”，Murase T等沙门氏菌接种的在鸡卵黄膜上，25℃孵育6天，通过检查卵黄中的菌株数，以判定该菌的穿透/渗透卵黄膜的能力。所以可以用卵黄膜建立新的生物膜溶膜模型。目前，国内外尚无有关卵黄膜溶膜片制备方面的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种卵黄膜溶膜片的制备方法，该制备方法操作简单、费用低廉、稳定性好，使用方便。
本发明的目的是通过以下技术措施来实现的一种卵黄膜溶膜片的制备方法，它包括以下步骤(1)采集生物溶膜酶，制备溶膜溶液；(2)采用惰性材料作为介质吸取溶液至饱和；(3)干燥吸取了溶液的惰性材料；
(4)覆膜；(5)包装。
所述步骤(1)中溶膜溶液为蛇毒溶膜溶液或顶体酶溶膜溶液；所述蛇毒溶膜溶液中的生物溶膜酶采用以下过程获得蛇毒取毒器取毒，毒液按1∶4比例加入蛇毒保护液稀释，离心去沉淀，-20℃冷冻，真空、低温干燥为冻干粉，4℃密闭保存。
所述的蛇毒保护液为2～6℃的低温去离子水，用其稀释毒液可显著降低蛇毒中的细菌、蛋白酶及环境高温对蛇毒蛋白的破坏。
所述的惰性材料是指具有较强吸水性能且不与溶液发生化学反应的材料，如滤纸、凝胶海绵等；为方便使用将其用打孔器制成圆片状。所述的圆片状介质直径为0.3～0.4cm。
步骤(2)中惰性材料的溶液吸取可采用以下方法将滤纸或凝胶海绵等距分置在包装底板上，再滴入适量溶液。
步骤(2)中惰性材料的溶液吸取还可采用以下方法预先将滤纸或凝胶海绵浸泡于溶液中，再放置在包装底板上。所述的包装底板要求对溶液无吸/无渗作用，以保证介质上的溶液浓度保持一致。
步骤(3)中采用冷冻干燥法对吸取了溶液的惰性材料进行干燥。
本发明提供的溶膜片的制备方法具有简单、操作便捷、费用低廉、稳定性好等优点，根据本发明的方法可先把溶膜片做成干性溶膜片，到需要使用时再用定量溶液(超纯水或含有抗体等其他溶质)浸润后使用，以保证实验条件的齐同性。将阳性对照化合物(如蛇毒、顶体酶等)制成干性溶膜片，具有保存期长、便于运输等优点，应用时既可免除临时配液的繁琐工序，也提高了实验的稳定性。
本发明的溶膜片制备方法可用于制备用于定性及定量检测的各种具有溶膜或抗溶膜活性的化合物的溶膜片，在细胞生物学、医学及药学领域中有较广泛的应用前景。
具体实施例方式
实施例一我国主要毒蛇有尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)、山烙铁头蛇(Ovophismonticola)、蝮蛇(Agkistrodon halys)、竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)、蝰蛇(Vipera russelii)、舟山眼镜蛇(Naja atra)、孟加拉眼镜蛇(Naja kaouthia)、眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)、银环蛇(Bungarus multicinctus)、金环蛇(Bungarusfasciatus)、环纹海蛇(Hydrophis fasciatus)等十余种，各自所产生的蛇毒在成分、毒性等方面有明显不同，制成不同的蛇毒酶溶膜片，可分别用于不同蛇毒及其抗体的特异性鉴别。以下以尖吻蝮为例，介绍蛇毒酶溶膜片制备的具体步骤，其他种/属的蛇毒酶溶膜片制备与此类同(1)尖吻蝮蛇毒制备成年尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)，用自制的蛇毒取毒器(专利号ZL200420046279.9)取毒，毒液按1∶4比例加入2℃的去离子水稀释，离心(3000g×30min)去沉淀，-20℃冷冻，真空、低温干燥为冻干粉，4℃密闭保存。
(2)尖吻蝮蛇毒冻干粉以林格氏溶液(Ringer’s solution)为溶剂配成溶液；取具有较强吸水性能且不与溶液发生化学反应的滤纸或凝胶海绵，利用打孔器将其制成直径0.3cm的小圆片，在溶液中浸泡10～45s，再放置在包装底板上；包装底板要求对溶液无吸/无渗作用，以保证介质上的溶液浓度保持一致。
(3)也可以进行下一步骤制成干溶膜片，将上述制得的溶膜片置于真空冷冻干燥机中干燥，密闭、避光保存；(4)覆膜；用透明薄膜覆膜，各溶膜片周围的覆膜与底板呈紧密粘结，以使溶膜片各自独立；(5)包装。
实施例二与实施例一不同的是所述的蛇毒加入6℃的去离子水稀释，步骤(2)中的滤纸或凝胶海绵，利用打孔器将其制成直径0.4cm的小圆片。
实施例三与实施例一不同的是所述的蛇毒加入4℃的去离子水稀释，步骤(2)中的滤纸或凝胶海绵，利用打孔器将其制成直径0.35cm的小圆片。
实施例四顶体酶溶膜片(1)顶体酶制备利用按摩采集法采集健康成年男性精液于无菌瓶内，于37℃水浴中液化后收集精子，用2％的醋酸抽提液提取顶体酶，置4℃下保存备用。
(2)溶膜片制备将上述顶体酶抽提液经超滤浓缩为试验溶液，后续制备步骤与实施例一所述的蛇毒酶溶膜片的制备相同。
实施例五与实施例一不同的是步骤(2)中先将滤纸或凝胶海绵等距分置在包装底板上，再滴入适量试验溶液，然后进行冷冻干燥即可。
权利要求
1.一种卵黄膜溶膜片的制备方法，包括以下步骤(1)采集生物溶膜酶，制备溶膜溶液；(2)采用惰性材料作为介质吸取溶液至饱和；(3)干燥吸取了溶液的惰性材料；(4)覆膜；(5)包装。
2.根据权利要求1所述的卵黄膜溶膜片制备方法，其特征在于溶膜溶液为蛇毒溶膜溶液或顶体酶溶膜溶液。
3.根据权利要求2所述的卵黄膜溶膜片制备方法，其特征在于所述蛇毒溶膜溶液中的生物溶膜酶采用以下过程获得蛇毒取毒器取毒，毒液按1∶4比例加入蛇毒保护液稀释，离心去沉淀，-20℃冷冻，真空、低温干燥为冻干粉，4℃密闭保存。
4.根据权利要求3所述的卵黄膜溶膜片制备方法，其特征在于所述的蛇毒保护液为2～6℃的低温去离子水。
5.根据权利要求1所述的溶膜片制备方法，其特征在于所述的惰性材料为滤纸或凝胶海绵；用打孔器将其制成的圆片状。
6.根据权利要求5所述的卵黄膜溶膜片制备方法，其特征在于所述的圆片状惰性材料直径为0.2～0.3cm。
7.根据权利要求1所述的卵黄膜溶膜片制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中惰性材料吸取溶液的过程为将滤纸或凝胶海绵等距分置在包装底板上，再滴入适量溶液。
8.根据权利要求1所述的卵黄膜溶膜片制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中惰性材料吸取溶液的过程为预先将滤纸或凝胶海绵浸泡于溶液中，再放置在包装底板上。
9.根据权利要求7或8所述的卵黄膜溶膜片制备方法，其特征在于所述的包装底板采用对溶液无吸/无渗作用的材料。
10.根据权利要求1所述的卵黄膜溶膜片制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中采用冷冻干燥法对吸取溶液了的惰性材料进行干燥。
全文摘要
本发明公开了一种卵黄膜溶膜片的制备方法，包括以下步骤(1)采集生物溶膜酶，制备溶膜溶液；(2)采用惰性材料作为介质吸取溶液至饱和；(3)干燥吸取了溶液的惰性材料；(4)覆膜；(5)包装。该制备方法操作简单、费用低廉、稳定性好，使用方便；可用于制备各种具有溶膜或抗溶膜活性的化合物的溶膜片，在细胞生物学、医学及药学领域中有较广泛的应用前景。
文档编号G01N33/50GK101016561SQ20071002683
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月8日 优先权日2007年2月8日
发明者孔天翰, 董伟华, 刘四红, 黄热平, 黄劭, 祁俊华 申请人:广州医学院