专利名称：4－胍基苯甲酰胺类抗生育化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是一类具有抑制人精子顶体酶活性的4-胍基苯甲酰胺类抗生育化合物。
背景技术：
实行计划生育，控制人口增长是全球性的工作，也是我国的基本国策。目前临床上常用的避孕方法主要有外科手术，永久或可逆性地阻断输卵管或输精管，这种方法对一对夫妇只生一个孩子后顾之忧甚大，难为大众接受；避孕工具，如使用安全套，宫颈帽，节育环等阻止精子运动，这些方法亦存在诸多问题，如避孕套的异物感、刺激性，宫内节育器的脱环、带环妊娠、出血等问题；避孕药物，多年来应用最多的是激素类避孕药，这类药物干扰正常人的生理机能，副作用大，应用受到限制。另外，外用避孕药临床也有应用，由于这类药物避孕效果不够理想，加之其它副反应，临床上未能推广应用。当今，寻找高效、低毒尤其是避孕机理独特的男性避孕药，成为各国研究人员研究的新热点。
众多的研究表明，人精子顶体部分的顶体酶是受精过程中精卵结合必不可少的蛋白水解酶，抑制顶体酶可阻止受精，达到避孕目的。各国研究人员相继开展了寻找人精子顶体酶抑制剂工作，这方面主要研究有从天然动植物和微生物中寻找蛋白酶抑制剂。Schill等利用明胶薄层技术研究蛋白酶抑制剂对精子顶体膜的穿透作用，结果表明以上两类蛋白酶抑制剂抑制效果均很差，不能作为避孕药进一步开发。Joyce C等发现对甲苯磺酰赖氨酰氯甲基酮(TLCK)对顶体酶有较好抑制作用，遗憾的是TLCK具极强的致癌性。Kaminsk等用酚取代对-硝基酚合成了一系列芳香族4-胍基苯甲酸酯盐，经体外及动物体内抗生育试验表明具有低毒、高效抗生育作用(J.Med.Chem.1986，29514～519)，但由于该类化合物具有酚酯结构，化学性质不稳定。但研究表明，4-胍基苯甲酸是顶体酶抑制剂的必需结构。
发明内容
众所周知，酯键与酰胺键是电子等排体，酰胺键比酯键稳定，因此本发明将4-胍基苯甲酸制备成4-胍基苯甲酸酰胺类化合物。该类化合物化学性质稳定，具有显著的抑制人精子顶体酶活性，是一类高效、低毒的新型抗生育化合物。本发明化合物的结构式通式为 其中R基团表示-CH2CH2CH3-(CH2)7CH3-[(CH2)4CH3]2-C(CH3)3-COCH＝CH2 本发明化合物的合成路线分两步叙述一、制备关键中间体4-胍基苯甲酰氯盐酸盐，合成路线如下
具体操作过程为1.取对氨基苯甲酸于水溶液中，在盐酸存在下与硫氰酸铵作用，生成异硫脲基苯甲酸盐酸盐；2.异硫脲基苯甲酸盐酸盐在乙醇溶液中与碘甲烷反应，生成4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氢碘酸盐；3.4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氢碘酸盐与过量氨水反应生成4-胍基苯甲酸；4.4-胍基苯甲酸与过量氯化亚砜作用生成4-胍基苯甲酰氯盐酸盐。
二、合成目标化合物，合成路线如下 操作过程为将胺类化合物溶于四氢呋喃，在三乙胺作用下与新鲜制备的4-胍基苯甲酰氯盐酸盐反应，得4-胍基苯甲酰胺类化合物。
具体实施例方式试剂与材料试剂与材料规格 购买公司对氨基苯甲酸 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司盐酸 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司硫氰酸铵 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司无水乙醇 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司碘甲烷 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司氨水 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司丙胺 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司特丁基胺 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司4-氟苯胺 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司2，4-二氯苯胺 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司4-硝基苯胺 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司4-甲基苯胺 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司2-氨基吡啶 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司三乙胺 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司四氢呋喃 CP 中国医药(集团)上海化学试剂公司一)、制备中间体实施例1中间体4-胍基苯甲酰氯盐酸盐的制备(1)合成异硫脲基苯甲酸盐酸盐对氨基苯甲酸0.5mole，水1500ml，浓盐酸0.5mole，硫氰酸铵0.55mole，水浴60～70℃，搅拌反应，得异硫脲基苯甲酸盐酸盐白色固体粗制品，再将此固体倾入10％NaOH400ml溶液中，活性炭脱色，滤液以20％盐酸中和至pH2～3，得异硫脲基苯甲酸盐酸盐白色固体101g，产率86.8％。
(2)合成4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氢碘酸盐异硫脲基苯甲酸盐酸盐0.5mole，无水乙醇650ml，碘甲烷1mole，于90℃水浴，搅拌回流2小时，得4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氢碘酸盐固体141g，产率83.1％。
(3)合成4-胍基苯甲酸4-{[(氨基-甲硫基)甲基]氨基}苯甲酸氢碘酸盐0.5mole，氨水2.5mole，40～50℃搅拌反应2小时，得白色固体，过滤，水洗，乙醇重结晶后得对4-基苯甲酸78g，产率87.7％(元素分析实侧值C 53.61％；H 5.07％；N 23.42％)。
(4)合成4-对-胍基苯甲酰氯盐酸盐4-胍基苯甲酸0.1mole，氯化亚砜1mole，搅拌回流1小时，放冷，固体过滤，石油醚洗涤固体，得4-胍基苯甲酰氯盐酸盐19g，产率81.2％。
二)、制备具有不同R基的4-胍基苯甲酰胺类化合物实施例2N-丙基-4-胍基苯甲酰胺的制备(R基为CH2CH2CH3)取丙胺0.02mole，四氢呋喃30ml，三乙胺3ml，搅拌，加4-胍基苯甲酰氯盐酸盐0.04mole(新鲜制)，室温搅拌反应2小时，得N-丙基-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品经柱层析纯化，得N-丙基-4-胍基苯甲酰胺白色固体3.5g。
实施例3N-(4-氟-苯基)-4-胍基苯甲酰胺的制备(R基为4-氟苯基)取4-氟苯胺0.01mole，四氢呋喃15ml，三乙胺3ml，于搅拌下加入4-胍基苯甲酰氯盐酸盐0.015mole，0℃反应1个半小时后，室温反应6小时，得N-(4-氟-苯基)-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品经柱层析纯化，得N-(4-氟-苯基)-4-胍基苯甲酰胺精品3.1g。
实施例4N-(4-氨基磺酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺的制备(R基为4-氨基磺酰苯基)4-氨基苯磺酰胺0.01mole，四氢呋喃15ml，三乙胺3ml，氮氮二甲基甲酰胺(DMF)5ml，搅拌溶解，于15℃，加入4-胍基苯甲酰氯盐酸盐0.01mole，加毕，65℃反应12小时，得N-(4-氨基磺酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品经柱层析纯化，得N-(4-氨基磺酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺精品2.8g。
实施例5N-(4-乙氧甲酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺的制备(R基为4-乙氧甲酰苯基)对氨基苯甲酸乙酯0.01mole，四氢呋喃15ml，三乙胺2.5ml，搅溶，冰浴下加入4-胍基苯甲酰氯盐酸盐0.01mole，搅拌3小时，生成黄色沉淀，过滤得N-(4-乙氧甲酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品以甲醇精制，得N-(4-乙氧甲酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺2.9g。
实施例6N-(2-吡啶基)-4-胍基苯甲酰胺的制备取2-氨基吡啶0.01mole，四氢呋喃20ml，三乙胺3ml，室温下加入4-胍基苯甲酰氯盐酸盐0.02mole，55℃搅拌反应6小时，得N-(2-吡啶基)-4-胍基苯甲酰胺粗品，粗品经柱层析纯化，得N-(2-吡啶基)-4-胍基苯甲酰胺纯品1.9g。
对于R基分别为-(CH2)7CH3-[(CH2)4CH3]2-C(CH3)3-COCH＝CH2的4-胍基苯甲酰胺类化合物，制备方法同实施例2。R基分别为 的4-胍基苯甲酰胺类化合物，制备方法同实施例3。R基分别为 的4-胍基苯甲酰胺类化合物，制备方法同实施例4。R基为 的N-(4-甲氧甲酰苯基)-4-胍基苯甲酰胺，制备方法同实施例5。
所有4-胍基苯甲酰胺类化合物均可制成盐酸盐、硫酸盐、甲烷磺酸盐。
现已合成的化合物见表1，其中部分4-胍基苯甲酰胺类化合物的核磁氢谱见表2。表1 4-胍基苯甲酰胺类化合物的结构、分子式结构通式 化合物编号 R 基团 分子式1 -CH2CH2CH3C11H17ClN4O2 -(CH2)7CH3C16H27ClN4O3 -[(CH2)4CH3]2C18H31ClN4O4 -C(CH3)3C12H19ClN4O5 C11H13ClN4O26C14H15ClN4O7 C14H14ClN4F8 C14H14ClN4I9 C14H13Cl3ON410 C14H14ClO3N511 C14H13ClO5N612 C14H18ClO3N5S13 C15H14ClON4F314 C15H17ClON415 C16H19ClON4化合物编号 R 基团 分子式16 C16H19ClON417 C16H17ClO2N418C17H19ClN4O319 C13H14ClN5O20C11H12N6ClO21 C13H14N5ClO22 C12H13N6ClO23C11H12N5ClOS24C11H12N5ClO2
表2部分4-胍基苯甲酰胺类化合物核磁H谱结构通式 化合物编号 R 基团HNMR DMSO-D60.85(t，3H)1.4～1.6(m，2H)3.1～3.3(m，2H)7.25(d，J＝8.50Hz，2H)7.737(s，3H)1 -CH2CH2CH37.95(d，J＝8.50Hz，2H)8.5～8.6(m，1H)10.40(s，1H)0.85(m，5H)1.1～1.6(m，10H)3.1～3.3(m，2H)7.25(d，J＝8.50Hz，2H)7.74(s，3H)2 -(CH2)7CH37.90(d，J＝8.5Hz，2H)8.04(s，1H)8.55(t，1H)10.41(s，1H)7.15(d，J＝8.6Hz，2H)7.35(d，J＝8.4Hz，2H)7.65(d，J＝8.4Hz，2H)8.05(d，J＝8.6Hz6 ，2H)10.44(s，1H)7.08(m，1H)10.45(s，1H)6.95(d，J＝8.5Hz，2H)7.8(s，3H)7.35(d，J＝8.6Hz，2H)7.95(d，J＝8.5Hz，2H)8.05(8 d，J＝8.6Hz，2H)10.44(s，1H)10.48(s，1H)7.35(d，J＝8.6Hz，2H)7.8～7.9(m，4H)735(d，J＝8.5Hz，2H)7.77(s，3H)9 10.42(s，1H)2.16(s，3H)2.27(s，3H)6.9～7.2(m，3H)7.35(d，J＝8.5Hz，2H)7.77(s，3H)15 8.05(d，J＝8.5Hz，2H)9.90(s，1H)10.44(s，1H)2.15(s，3H)2.27(s，3H)6.95(m，3H)7.15(d，J＝8.50Hz，2H)7.35(d，J＝8.40Hz，2H)16 7.72(s，3H)8.05(d，J＝8.5Hz，2H)9.89(s，1H)10.34(s，1H)
药理试验精子顶体蛋白酶是一种类胰蛋白酶，具有溶解明胶的特性。精子在超薄明胶膜上孵育，先是顶体破溃解聚，导致顶体酶释放，继而于明胶基质上溶解形成一个围绕精子头部可见的晕轮，通过显微镜可观察精子晕轮的阳性反应率和晕轮直径，前者反应了有受精能力精子的百分比，后者则反应了单个精子顶体酶活性的强弱。本实验采用明胶底物膜法，观察了十九个化合物对人精子顶体酶活性抑制的情况，测定了人精子顶体酶对明胶反应阳性率及平均晕轮直径。结果见表3、表4、表5。
检测方法如下1、明胶膜的制作将408mg干明胶放入12ml蒸馏水中浸泡15分钟，于40℃水浴中使其溶解。再将明胶溶液升温至50℃，然后准确量取0.1ml明胶溶液，滴在洁净的载玻片上，制成45×20mm2薄膜。随即放于4℃冰箱内3～5分钟，置室温下干燥18小时。将已干燥的明胶膜用0.05％的戊二醛固定再用巴比妥醋酸缓冲液调整膜的pH为7.0±0.05，0.5％的台盼蓝滴染。
2、精子的处理用0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤精子二次，并调整精子浓度为50×106个/ml，向不同浓度的4-胍基苯甲酰胺化合物1ml液中各加入0.2ml的精子悬液，室温下孵育5分钟取一滴(约50μl)上述精子混和液滴于明胶膜上，用另一干净玻片将精子悬液涂均匀，然后放入37℃恒温箱内孵育3小时，取出，空气干燥，中性树胶封固。
3、测定光镜观察，凡精子头部周围出现白色亮区者为阳性反应。平均晕轮阳性率(mean halorate mHR)(％)数各视野中100个精子，计数其中有阳性反应的精子数目。
平均晕轮直径(mean halo diameter，mHD)(微米)，用显微镜测微尺测量晕轮直径。当晕轮不是圆形而呈半月形时，取其长短之和的一半作为晕轮直径。测50个精子晕轮直径，取平均值。
4、结果本实验分实验组、空白对照组及阳性对照组(TLCK组)。结果表明，实验组所有化合物均有不同程度抑制精子顶体蛋白酶的作用。其中表4中的第18号化合物抑制顶体酶活性最强。表3脂肪胺类化合物对人精子顶体酶活性抑制的检测结果 化合物编号 管号R 基团阳性率 反应晕轮直径X±SD药物浓度(mg/ml)1′ 0％01×10-32′ 45％ 22.91±0.46 1×10-51 -CH2CH2CH33′ 48％ 22.94±0.48 1×10-74′ 56％ 23.27±0.49 1×10-91′ 0％01×10-32′ 38％ 12.30±0.33 1×10-52 -(CH2)7CH33′ 43％ 19.93±0.50 1×10-74′ 56％ 21.95±0.30 1×10-91′ 16％ 7.42±0.46 1×10-32′ 40％ 9.31±0.30 1×10-53 -[(CH2)4CH3]23′ 53％ 16.96±0.53 1×10-74′ 60％ 25.94±0.56 1×10-91′ 10％ 5.87±0.73 1×10-32′ 38％ 8.64±0.85 1×10-54 -C(CH3)33′ 51％ 19.93±0.38 1×10-74′ 68％ 25.97±4.26 1×10-91′ 0％01×10-32′ 15％ 8.98±0.25 1×10-553′ 31％ 10.97±0.37 1×10-74 52％ 23.27±0.26 1×10-9对照 68％ 26.27±0.47 8％DMSO表4取代苯胺类化合物对人精子顶体酶活性抑制的检测结果 反应晕轮直径药物浓度化合物编号 管号R基团 阳性率X±SD(mg/ml)1′ 12％ 6.60±0.19 1×10-32′40％ 14.25±0.39 1×10-56 3′ 45％ 17.29±0.48 1×10-74′ 61％ 26.93±0.51 1×10-91′ 21％ 14.96±0.35 1×10-32′38％ 21.61±0.52 1×10-57 3′ 40％ 25.27±0.20 1×10-74′ 45％ 25.93±0.27 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 40％ 15.44±0.47 1×10-58 3′ 58％ 21.66±1.16 1×10-74′ 66％ 22.86±0.77 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 10％ 19.28±0.47 1×10-59 3′ 21％ 22.61±0.48 1×10-74′ 60％ 25.92±0.35 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 10％ 14.63±0.48 1×10-5103′21％ 20.58±0.55 1×10-74′43％ 26.60±0.47 1×10-91′0％0 1×10-32′10％ 13.60±0.84 1×10-5113′21％ 18.14±0.66 1×10-74′43％ 19.89±0.33 1×10-91′0％ 0 1×10-32′6％ 5.72±0.56 1×10-5123′ p 20％ 15.37±0.47 1×10-74′33％ 16.01±0.57 1×10-9
反应晕轮直径 药物浓度化合物编号管号R 基团阳性率 X±SD (mg/ml)1′ 0％ 0 1×10-32′10％ 8.55±0.45 1×10-513 3′ 38％ 19.66±0.44 1×10-74′ 44％ 21.11±0.67 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 30％ 9.64±0.28 1×10-514 3′ 45％ 17.30±0.31 1×10-74′ 54％ 20.89±0.43 1×10-91′ 4％ 5.38±0.41 1×10-32′ 38％ 14.29±0.39 1×10-515 3′ 58％ 25.60±0.36 1×10-74′ 66％ 25.97±0.30 1×10-91′ 13％ 7.21±0.28 1×10-32′ 40％ 17.34±0.84 1×10-516 3′ 48％ 21.61±0.38 1×10-74′ 61％ 27.90±0.40 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 30％ 11.84±0.41 1×10-517 3′ 58％ 18.32±0.40 1×10-74′ 66％ 19.99±0.71 1×10-91′ 0％0 1×10-32′ 3％ 4.25±0.29 1×10-518 3′ 16％ 9.32±0.45 1×10-74′ 25％ 14.18±0.36 1×10-9对照 70％ 22.86±0.75 8％DMSO表5 杂环芳胺类化合物和TLCK对人精子顶体酶活性抑制的检测结果 反应晕轮直径 药物浓度化合物编号管号R基团 阳性率 X±SD (mg/ml)1′0％ 0 1×10-32′18％ 9.64±0.471×10-519 3′33％ 11.32±0.37 1×10-74′50％ 22.61±1.16 1×10-9对照 80％ 29.59±0.37 8％DMSO0％0 5.012.8％6.59±1.58 4.028.9％8.95±1.68 3.036.0％10.57±1.462.5性对 TLCK42.8％11.67±1.792.0照 58.6％12.75±2.001.0组63.50％ 15.82±2.160.570.70％ 19.49±1.820.2577.10％ 21.51±3.410.12权利要求
1.4-胍基苯甲酰胺类化合物，其结构通式为 其中R基团表示-CH2CH2CH3-(CH2)7CH3-[(CH2)4CH3]2-C(CH3)3-COCH＝CH2
2.权利要求1所述4-胍基苯甲酰胺类化合物用于制备抗生育药物的用途。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一类具有抑制人精子顶体酶活性的4－胍基苯甲酰胺类抗生育化合物。该类化合物的结构通式为Ⅰ式，其中R基团表示－CH
文档编号C07D233/88GK1401634SQ0211234
公开日2003年3月12日 申请日期2002年7月2日 优先权日2002年7月2日
发明者吕加国, 朱驹, 周有骏, 张万年, 季海涛, 余建鑫, 宋云龙, 盛春泉, 姚建忠, 朱杰 申请人:中国人民解放军第二军医大学