专利名称：一种固定化酶整体毛细管色谱柱及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属色谱柱制备技术，特别涉及一种固定化酶整体毛细管色谱柱及其制备和应用。 背景技术：
固定化酶色谱柱的制备，目前国内外已有开展。现有技术的制备方法是以颗粒载 体固定酶，装柱而成。颗粒载体种类较多，可以是大孔吸附树脂，离子交换树脂，也可以是葡 聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等。固定酶的方式有吸附法，如大孔树脂固定酶，也有共价交联法，如 葡聚糖固定酶。由于颗粒载体固定酶再装柱，因而，无法制成柱径在1毫米以下的毛细管固 定化柱。颗粒载体固定酶色谱柱主要应用于亲和层析分离，分离纯化与柱中固定的酶具有 亲和力的成分。固定化酶整体毛细管色谱柱目前国内外均处于研究阶段，固定化材料与毛 细管的选用有较多种类，应用领域也处于探索之中。
发明内容
本发明的目的是制备一种可应用于筛选与酶具有亲和作用的化合物的固定化酶 整体毛细管色谱柱。为提高筛选灵敏度，采用溶胶凝胶法固定酶，制成整体毛细管柱。本发明采用的技术方案是一种固定化酶整体毛细管色谱柱，所述的固定化酶整体毛细管色谱柱按照以下方 法制备得到(1)将四乙氧基硅烷与甘油以质量比1 0.2 0.6混合后，再加入四乙氧基硅 烷质量2 3%的强酸性离子交换树脂，在35 45°C下，搅拌混合72 120小时，然后过 滤除去强酸性离子交换树脂，取滤液减压蒸馏除去甘油与反应生成的乙醇(通常在真空度 300Pa、25°C温度下进行减压蒸馏)，得到改性硅烷，改性硅烷中加入改性硅烷质量1. 2 1. 6倍的水和改性硅烷质量1. 5 2. 5%的lmol/L的磷酸溶液，混勻得到改性硅烷溶液；(2)在浓度40mmol/L、pH值为7. 0 7. 5的磷酸缓冲液中加入平均分子量为400 1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液，所述含有酶和聚乙二醇的磷 酸缓冲液中聚乙二醇的浓度为70 90mg/mL，酶的浓度为90 100mg/mL，将含有酶和聚乙 二醇的磷酸缓冲液与步骤(1)得到的改性硅烷溶液以质量比1 1混合，搅拌均勻后得混 合液，用注射器注入所述的混合液预处理过的玻璃毛细管中，注满后静置5 10分钟，然 后将玻璃毛细管浸入40mmol/L、pH值7. 0的磷酸缓冲液中，于3 7 (优选 5°C )下静置 7 9天，制得所述固定化酶整体毛细管色谱柱，所述酶为胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管 紧张素转化酶。所述预处理过的玻璃毛细管按照以下方法制备得到玻璃毛细管用无水乙醇浸泡 1 3小时后，用注射器将体积百分比浓度为10%的氨丙基三乙氧硅烷的无水乙醇溶液注 入毛细管中，注满后静置30 40分钟，再用无水乙醇冲洗干净，于90°C烘箱烘干30 40 分钟，制得所述预处理过的玻璃毛细管，所述玻璃毛细管的内径为0. 2 1. 0毫米，管长通常为5 20厘米。所述步骤(1)中，所述强酸性离子交换树脂优选732型强酸性离子交换树脂、717 型强酸性离子交换树脂、DOOl型强酸性离子交换树脂或D201型强酸性离子交换树脂。本发明还提供一种固定化酶整体毛细管色谱柱的制备方法，所述的方法包括以下 步骤 a、玻璃毛细管用无水乙醇浸泡1 3小时后，用注射器将体积百分比浓度为10% 的氨丙基三乙氧硅烷的无水乙醇溶液注入毛细管中，注满后静置30 40分钟，再用无水乙 醇冲洗干净，于90°C烘箱烘干30 40分钟，制得预处理过的玻璃毛细管，所述玻璃毛细管 的内径为0. 2 1. 0毫米，管长为5 20厘米；b、将四乙氧基硅烷与甘油以质量比1 0.2 0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷 质量2 3%的强酸性离子交换树脂，在35 45°C下，搅拌混合72 120小时，然后过滤 除去强酸性离子交换树脂，取滤液减压蒸馏除去甘油与乙醇(通常在真空度300Pa、25°C温 度下进行减压蒸馏)，得到改性硅烷，改性硅烷中加入改性硅烷质量1. 2 1. 6倍的水和改 性硅烷质量1. 5 2. 5%的lmol/L的磷酸溶液，混勻得到改性硅烷溶液；C、在浓度40mmol/L、pH值为7. 0 7. 5的磷酸缓冲液中加入平均分子量为400 1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液，所述含有酶和聚乙二醇的磷 酸缓冲液中聚乙二醇的浓度为70 90mg/mL，酶的浓度为90 100mg/mL，将含有酶和聚乙 二醇的磷酸缓冲液与步骤b得到的改性硅烷溶液以质量比1 1混合，搅拌均勻后得混合 液，用注射器将所述的混合液注入步骤a制得的预处理过的玻璃毛细管中，注满后静置5 10分钟，然后将玻璃毛细管浸入40mmol/L、pH值7. 0的磷酸缓冲液中，于3 7°C下静置 7 9天，制得所述固定化酶整体毛细管色谱柱，所述酶为胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管 紧张素转化酶。本发明所述的固定化酶整体毛细管色谱柱可应用于筛选与所述固定化酶整体毛 细管色谱柱中固定的酶有亲和作用的化合物。具体的，所述应用的方法为待筛选化合物用水配成浓度小于1 μ g/mL的三种不 同浓度的样品溶液，分别用注射泵注入含有待验亲和作用的酶的固定化酶整体毛细管色谱 柱中，控制流速4 μ L/min，跟踪检测流出液中待筛选化合物的浓度，当流出液中待筛选化合 物的浓度与样品溶液的初始浓度相同时，记录为浓度平衡时间，若三种不同浓度的样品溶 液的浓度平衡时间相同，表示待筛选化合物与固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶无亲 和作用，若三种不同浓度的样品溶液的浓度平衡时间有差别，表示待筛选化合物与固定化 酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用，而且三种不同浓度的样品溶液的浓度平衡时 间相差越大，表示亲和作用越强。本发明提供的固定化酶整体毛细管色谱柱以甘油改性四乙氧基硅烷为酶固定化 材料，较其它硅烷材料生物亲和性好。色谱柱以固定化酶的硅烷整体填充，选用0. 2 1. 0 毫米内径的玻璃毛细管柱，当待筛选化合物的水溶液过柱时，检测化合物与酶亲和作用的 灵敏度，高于现有的固定化酶色谱柱。本发明的制备方法所制成的固定化酶色谱柱较其它 方法制成的色谱柱使用稳定性高，用于化合物筛选更准确。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此。实施例1 选用内径0. 5毫米的玻璃毛细管(美国PolymicroTechnologies，LL 公司产)，取管长10厘米，用无水乙醇浸泡1小时。将氨丙基三乙氧硅烷(比利时ACROS Organics公司产)用无水乙醇为溶剂配制10%体积百分浓度的溶液，用注射器注入毛细管 中，注满，静置保持30分钟，然后用无水乙醇冲洗干净，90°C烘箱烘35分钟，制得预处理过 的玻璃毛细管备用。将30g四乙氧基硅烷(比利时ACROS Organics公司产)与12g甘油混合，加入 0. 7g 732型强酸性离子交换树脂(丹东市东方树脂厂)，在40°C下，共混100小时，滤布过 滤分离出树脂，取滤液于25°C下减压蒸馏(真空度300Pa)去除多余的甘油与生成的乙醇， 得到改性硅烷24g。改性硅烷加入38g水和0. 36gl摩尔/升的磷酸溶液，共混均勻得到改 性硅烷溶液。将磷酸一氢钠与磷酸二氢钠在去离子水中配成总浓度为40毫摩尔/升，pH值7. 5 的磷酸缓冲液。在磷酸缓冲液中配入平均分子量400的聚乙二醇(国药集团化学试剂有限 公司产)，控制浓度为90毫克/毫升，并配入胰蛋白酶(合肥博美生物科技有限责任公司 产)，控制浓度为100毫克/毫升。将0.5g含有胰蛋白酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液与已配 制的0. 5g改性硅烷溶液共混，搅拌均勻得混合液。用注射器将混合液注入已预处理的玻璃 毛细管中，注满后静置10分钟，将制成的毛细管柱浸入pH7. 0，总浓度为40毫摩尔/升的磷 酸一氢钠/磷酸二氢钠缓冲液中，于3°C冰箱中放置7天。即完成固定化酶整体毛细管色谱 柱的制备。将苦参碱(纯度96. 5%)用去离子水配制成浓度为0·25μβ/πι1、0·05μβ/πι1、 0. 01 μ g/ml的溶液，用注射泵注入所制备的固定化酶整体毛细管色谱柱，控制流速4微升/ 分钟。上述三个浓度的样液过柱时苦参碱出柱达到浓度平衡的时间分别为29. 5分钟，25. 3 分钟和22. 6分钟，说明苦参碱与胰蛋白酶有亲和作用。实施例2 选用内径0. 2毫米的玻璃毛细管(美国PolymicroTechnologies，LL 公司产)，取管长20厘米，用无水乙醇浸泡1小时。将氨丙基三乙氧硅烷(比利时ACROS Organics公司产)用无水乙醇为溶剂配制10%体积百分浓度的溶液，用注射器注入毛细管 中，注满，静置保持40分钟，然后用无水乙醇冲洗干净，90°C烘箱烘40分钟，制得预处理过 的玻璃毛细管备用。将30g四乙氧基硅烷(比利时ACROS Organics公司产)与18g甘油混合，加入 0. 9g D201大孔型强酸性离子交换树脂(天津市波鸿树脂科技有限公司)，在45°C下，共混 120小时，滤布过滤分离出树脂，取滤液于25°C下减压蒸馏(真空度300Pa)去除多余的甘 油与生成的乙醇，得到改性的硅烷25g。改性硅烷加入30g水和0. 48g 1摩尔/升的磷酸溶 液，共混均勻得到改性硅烷溶液。将磷酸一氢钠与磷酸二氢钠在去离子水中配成总浓度为40毫摩尔/升，pH值为 7. 0的磷酸缓冲液。在磷酸缓冲液中配入平均分子量1500的聚乙二醇(国药集团化学试剂 有限公司产)，浓度为70毫克/毫升。配入α葡萄糖苷酶(无锡酶制剂厂产)，浓度为90 毫克/毫升。将含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液0. 6g与已配制的改性硅烷溶液0. 6g共混，搅拌均勻得混合液。用注射器将混合液注入已预处理的玻璃毛细管中，注满后静置5分钟， 将制成的毛细管柱浸入PH7. 0，总浓度为40毫摩尔/升的磷酸一氢钠/磷酸二氢钠缓冲液 中，于7°C冰箱中放置9天。即完成固定化酶整体毛细管色谱柱的制备。
将齐墩果酸(纯度95. 3% )用去离子水配制成浓度为0. 20μ g/ml、0· 08μ g/ml、 0. 02μ g/ml的溶液，用注射泵注入所制备的固定化酶整体毛细管色谱柱，控制流速4微升 /分钟。上述三个浓度的样液过柱时齐墩果酸出柱达到浓度平衡的时间分别为28. 7分钟， 26. 2分钟和23. 4分钟，说明齐墩果酸与α葡萄糖苷酶有亲和作用。实施例3 选用内径1.0毫米的玻璃毛细管(美国PolymicroTechnologies，LL 公司产)，取管长5厘米，用无水乙醇浸泡1小时。将氨丙基三乙氧硅烷(比利时ACROS Organics公司产)用无水乙醇配制10%体积百分浓度的溶液，用注射器注入毛细管中，注 满，保持35分钟，用无水乙醇冲洗干净，90°C烘箱烘30分钟，制得预处理过的玻璃毛细管备 用。将30g四乙氧基硅烷(比利时ACROS Organics公司产)与6g甘油混合，加入0. 6g DOOl大孔型强酸性离子交换树脂(北京海德能公司)，在35°C下，共混72小时，滤布过滤分 离出树脂，取滤液于25°C下减压蒸馏(真空度300Pa)去除多余的甘油与生成的乙醇，得到 改性的硅烷22g。改性硅烷加入32g水和0. 55g浓度为1摩尔/升的磷酸溶液，共混均勻得 到改性硅烷溶液。将磷酸一氢钠与磷酸二氢钠在去离子水中配成总浓度为40毫摩尔/升，pH值为 7. 3的磷酸缓冲液。在磷酸缓冲液中配入平均分子量1000的聚乙二醇(国药集团化学试剂 有限公司产)，浓度为80毫克/毫升。配入血管紧张素转化酶(上海西唐生物科技有限公 司)，浓度为95毫克/毫升。将含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液0. 8g与已配制的改性硅 烷溶液0. Sg共混，搅拌均勻得混合液。用注射器将混合液注入已预处理的玻璃毛细管中， 注满后静置8分钟，将制成的毛细管柱浸入pH7. 0，总浓度为40毫摩尔/升的磷酸一氢钠/ 磷酸二氢钠缓冲液中，于5°C冰箱中放置8天。即完成固定化酶整体毛细管色谱柱的制备。将桦木酚(纯度92.7% )用去离子水配制成浓度为0·25μβ/πι1、0· 10 μ g/ml、 0. 05 μ g/ml的溶液，用注射泵注入所制备的固定化酶整体毛细管色谱柱，控制流速4微升/ 分钟。上述三个浓度的样液过柱时桦木酚出柱达到浓度平衡的时间分别为29. 6分钟，26. 5 分钟和24. 1分钟，说明桦木酚与血管紧张素转化酶有亲和作用。
权利要求
一种固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述的固定化酶整体毛细管色谱柱按照以下方法制备得到(1)将四乙氧基硅烷与甘油以质量比1∶0.2～0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷质量2～3％的强酸性离子交换树脂，在35～45℃下，搅拌混合72～120小时，然后过滤除去强酸性离子交换树脂，取滤液减压蒸馏除去甘油与生成的乙醇，得到改性硅烷，所述改性硅烷中加入改性硅烷质量1.2～1.6倍的水和改性硅烷质量1.5～2.5％的1mol/L的磷酸溶液，混匀得到改性硅烷溶液；(2)在浓度40mmol/L、pH值为7.0～7.5的磷酸缓冲液中加入平均分子量为400～1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液中聚乙二醇的浓度为70～90mg/mL，酶的浓度为90～100mg/mL，将含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液与步骤(1)得到的改性硅烷溶液以质量比1∶1混合，搅拌均匀后得混合液，用注射器将所述的混合液注入预处理过的玻璃毛细管中，注满后静置5～10分钟，然后将玻璃毛细管浸入40mmol/L、pH值7.0的磷酸缓冲液中，于3～7℃下静置7～9天，制得所述固定化酶整体毛细管色谱柱，所述酶为胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管紧张素转化酶。
2.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述预处理过的玻璃 毛细管按照以下方法制备得到玻璃毛细管用无水乙醇浸泡1 3小时后，用注射器将体积 百分比浓度为10%的氨丙基三乙氧硅烷的无水乙醇溶液注入毛细管中，注满后静置30 40分钟，再用无水乙醇冲洗干净，于90°C烘箱烘干30 40分钟，制得所述预处理过的玻璃 毛细管，所述玻璃毛细管的内径为0. 2 1. 0毫米。
3.如权利要求2所述的固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述玻璃毛细管的管 长为5 20厘米。
4.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述强酸性离子交换 树脂为732型强酸性离子交换树脂、717型强酸性离子交换树脂、D001型强酸性离子交换树 脂或D201型强酸性离子交换树脂。
5.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱，其特征在于所述步骤(1)中，所述 取滤液减压蒸馏是在真空度300Pa、25°C温度下进行减压蒸馏。
6.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱的制备方法，其特征在于所述的方 法包括以下步骤a、玻璃毛细管用无水乙醇浸泡1 3小时后，用注射器将体积百分比浓度为10%的氨 丙基三乙氧硅烷的无水乙醇溶液注入毛细管中，注满后静置30 40分钟，再用无水乙醇冲 洗干净，于90°C烘箱烘干30 40分钟，制得预处理过的玻璃毛细管，所述玻璃毛细管的内 径为0. 2 1. 0毫米，管长为5 20厘米；b、将四乙氧基硅烷与甘油以质量比1 0.2 0.6混合后，再加入四乙氧基硅烷质量 2 3%的强酸性离子交换树脂，在35 45°C下，搅拌混合72 120小时，然后过滤除去强 酸性离子交换树脂，取滤液在真空度减压蒸馏除去甘油与乙醇，得到改性硅烷，改性硅烷中 加入改性硅烷质量1. 2 1. 6倍的水和改性硅烷质量1. 5 2. 5%的lmol/L的磷酸溶液， 混勻得到改性硅烷溶液；c、在浓度40mmol/L、pH值为7.0 7. 5的磷酸缓冲液中加入平均分子量为400 1500的聚乙二醇和酶，配成含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液，所述含有酶和聚乙二醇的磷酸缓 冲液中聚乙二醇的浓度为70 90mg/mL，酶的浓度为90 100mg/mL，将含有酶和聚乙二醇 的磷酸缓冲液与步骤b得到的改性硅烷溶液以质量比1 1混合，搅拌均勻后得混合液，用 注射器将所述的混合液注入步骤a制得的预处理过的玻璃毛细管中，注满后静置5 10分 钟，然后将玻璃毛细管浸入40mmol/L、pH值7. 0的磷酸缓冲液中，于3 7°C下静置7 9 天，制得所述固定化酶整体毛细管色谱柱，所述酶为胰蛋白酶、α葡萄糖苷酶或血管紧张素 转化酶。
7.如权利要求1所述的固定化酶整体毛细管色谱柱应用于筛选与所述固定化酶整体 毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用的化合物。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用的方法为待筛选化合物用水配成 浓度小于1 μ g/mL的三种不同浓度的样品溶液，分别用注射泵注入含有待验亲和作用的酶 的固定化酶整体毛细管色谱柱中，控制流速4 μ L/min，跟踪检测流出液中待筛选化合物的 浓度，当流出液中待筛选化合物的浓度与样品溶液的初始浓度相同时，记录为浓度平衡时 间，若三种不同浓度的样品溶液的浓度平衡时间相同，表示待筛选化合物与固定化酶整体 毛细管色谱柱中固定的酶无亲和作用，若三种不同浓度的样品溶液的浓度平衡时间有差 另IJ，表示待筛选化合物与固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用。
全文摘要
本发明公开了一种固定化酶整体毛细管色谱柱，按照以下方法制备得到将四乙氧基硅烷与甘油，在强酸性离子交换树脂作用下，制得改性硅烷，改性硅烷中加水和磷酸溶液，混匀得到改性硅烷溶液；然后将含有酶和聚乙二醇的磷酸缓冲液与改性硅烷溶液以质量比1∶1混合，搅拌均匀后，用注射器注入预处理过的玻璃毛细管中，注满后静置5～10分钟，然后将玻璃毛细管浸入磷酸缓冲液中，于3～7℃下静置7～9天，制得固定化酶整体毛细管色谱柱。所述固定化酶整体毛细管色谱柱可应用于筛选与所述固定化酶整体毛细管色谱柱中固定的酶有亲和作用的化合物。本发明固定化酶整体毛细管色谱柱的制备方法简单，使用稳定性高，用于化合物筛选更准确。
文档编号G01N30/60GK101876653SQ20101020929
公开日2010年11月3日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者卢时勇, 张铮, 钱俊青 申请人:浙江工业大学