专利名称：快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法
技术领域：
本发明涉及快速检测氯霉素残留的方法。
背景技术：
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是由土壤中的一些特定的委内瑞拉菌属所产生 的一种抗菌剂，对革兰氏阳性、阴性菌、立克次氏体，衣原体，支原体均有抑制作用，但被证 明其在动物性食品中的残留会给人类带来很大的毒副作用，比如再生障碍性贫血，并且较 难代谢排除。为此，许多国家禁止了氯霉素的使用，比如美国，加拿大，澳大利亚和欧盟成员 国。2002年中国农业部《动物性食品兽药残留规定》中规定氯霉素在可食部分不得检出。 但有的不法分子由于氯霉素的廉价、抑菌效果良好，在利益的驱使下，仍然利用氯霉素治疗 动物的细菌性感染等疾病。目前，检测氯霉素残留的方法有很多HPLC、GC、LC-MS-MS, GC-MS-MS，这些方法虽 然都很精确，有的检测限甚至能达到0. lng/g，但都需要仪器，有的还很昂贵，耗时也较长。 基于免疫学的ELISA方法，虽然减小了检测成本，也缩短了检测时间，但操作繁琐，需要专 业人员进行操作。胶体金免疫层析方法检测氯霉素残留提供了一种快速、简便的氯霉素检 测方法，这是一种利用胶体金标记单克隆抗体，利用抗原抗体的特异性结合判断样品中被 检测物质的含量。其制备方法包括利用柠檬酸三钠法制备胶体金，在适当的标记条件下标 记氯霉素单克隆抗体得到金标抗体，然后离心纯化金标抗体，接着将纯化的好的金标抗体 喷在已处理好的玻璃纤维膜(结合垫)上，同时将包被抗原氯霉素-卵清蛋白(CAP-0VA)、 二抗羊抗小鼠IgG包被在硝酸纤维膜(NC膜)上，将干燥好的NC膜、结合垫、玻璃纤维膜 (样品垫)、吸水纸依次有序贴在PVC底板上，制备胶体金试纸条。但在标记方法、离心纯化 时重悬液配方、结合垫处理液配方方面较为复杂。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术氯霉素胶体金试纸条制备方法的不足，提供一种简 单、易行检测氯霉素残留的胶体金试纸条的制备方法。实现本发明的技术方案如下在现有的氯霉素胶体金试纸条制备的技术基础上， 本发明采用胶体金标记氯霉素单克隆抗体时采用一种同时加入保护剂和抗体的方法制备 金标抗体，这样由于保护剂的加入，更有利于抗体的标记；由于现有的重悬液配方复杂，金 标抗体的浓缩效果欠佳，在离心纯化时使用经过改良的重悬液；由于现有的结合垫处理液 不能产生理想的结合垫释放效果，金标抗体结合垫采用经过改良的结合垫处理液处理。本发明的工艺特点是采用同时加入保护剂和氯霉素单克隆抗体的方法制备金标 抗体，制得的金标抗体使用重悬液离心纯化，金标抗体结合垫先用结合垫处理液处理，再喷 上金标抗体而制得。保护剂是海藻糖，海藻糖终质量浓度为0. 5% 3%，金标抗体离心纯 化所用的重悬液其配方是终质量浓度为0. 0. 5%吐温20， 3%海藻糖，0. 5% 2% BSA,0.01mol/L PBS pH7. 4溶液，结合垫处理液配方为终质量浓度为0. 0. 5%吐温 20，1% 3%海藻糖，5% 10%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。本发明的有益效果是，工艺步骤操作简单、易行，试剂价格低廉、易得。本发明氯霉 素胶体金试纸条检测灵敏度达3ng/ml，检测范围为3 lOOOng/ml ；特异性实验证明与新霉 素、土霉素、链霉素、四环素甲砜霉素等氯霉素的结构类似物的交叉反应在以下；假阳 性率在5%以下、假阴性率在以下；同一批次的试纸条10条结果统一，说明产品重复性 良好；常温干燥条件下能保持20天，稳定性良好。
说明书附图1为氯霉素胶体金试纸条的示意图。图中1为样品垫，2为样品滴加方向，3为金标抗体结合垫，4为控制线(C线)，5为 吸水纸，6为PVC底板，7为层析方向，8为检测线(T线)，9为NC膜。说明书附图2为检测结果示意图。图中，1为阴性结果，2为阳性结果，3为无效，C为控制线，T为检测线。
具体实施例方式实施例11.胶体金制备在冷凝回流装置中的圆底烧瓶中加入100ml超纯水和Iml 的 氯金酸溶液，加热至沸后加入Iml 1 %浓度的柠檬酸三钠溶液，观察颜色变化，待颜色稳定时 继续反应lOmin。冷却静置一天，利用粒度仪检测制得粒径为40nm胶体金，其最大吸收峰在 526nm。2.胶体金标记抗体最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体 金用0. lmol/L的HCl和K2CO3调至pH8. 2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体16 μ g/ml、终质量 浓度为的海藻糖同时加入100ml胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合IOmin后，加入终质 量浓度为0. 5%的BSA，4°C保存过夜后冷冻超速离心纯化。3.金标抗体的纯化(1)金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min，弃去出凝聚的金颗粒形成的沉 淀，取红色上清溶液于4°C再8000r/min离心30min。(2)溶液分为三层透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的 金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬 液终质量浓度为0. 吐温20，1%海藻糖，0. 5%BSA，0.01mol/L PBS pH7. 4溶液。(3)重复离心3次，最后重悬至原体积的1/20，加入0. 1 %的叠氮钠4°C保存备用。4.结合垫的前处理样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封 闭处理，浸泡30min后37°C、2h烘干，结合垫处理液含有终质量浓度为0. 3% %吐温20， 2%海藻糖，10%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。5.喷金金标抗体调浓度至OD526为5，点样机将金标抗体在结合垫上均勻点样，点 样量在30μ l/cm2，37°C干燥。6.检测线抗原和控制线二抗的包被将包被抗原CAP-OVA稀释到1. 5mg/ml，二抗 稀释度为商品化稀释lmg/ml倍，手工点样在NC膜上分别划T线和C线，间距为5mm，37°C干
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7.试纸条的组装将 2cmX0. 3cmNC 膜、1. 8cmX0. 3cm 吸水纸、IcmX0. 3cm 金标 垫、1. 5cmX0. 3cm样品垫按图1方式依次粘贴在PVC胶板上，即成氯霉素胶体金试纸条。8.将氯霉素竞争品按lng/m、3ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的浓度依次滴加在氯霉素 胶体金试纸条上，用PBS作为对照组，观察实验结果。实施例21.根据实施例1中1所述。2.胶体金标记抗体最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体 金用0. lmol/L的HCl和K2CO3调至pH9. 2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体16 μ g/ml、终质量 浓度为0. 5%的海藻糖同时加入IOOml胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合IOmin后，加入终 质量浓度为0. 5%的BSA，4°C保存过夜后冷冻超速离心纯化。3.金标抗体的纯化(1)金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉 淀，取红色上清溶液于4°C再10000r/min离心30min。(2)溶液分为三层透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的 金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬 液终质量浓度为0. 2%吐温20，2%海藻糖，1%85々，0.0111101/1 PBS pH7. 4溶液。(3)重复离心3次，最后重悬至原体积的1/20，加入0. 1 %的叠氮钠4°C保存备用。4.结合垫的前处理样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封 闭处理，浸泡30min后37°C、2h烘干，结合垫处理液含有终质量浓度为0. 2% %吐温20，
海藻糖，8%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。5.根据实施例1中5所述。6.根据实施例1中6所述。7.根据实施例1中7所述。8.根据实施例1中8所述。实施例31.根据实施例1中1所述。2.胶体金标记抗体最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体 金用0. lmol/L的HCl和K2CO3调至pH9. 2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体16 μ g/ml、终质量 浓度为2%的海藻糖同时加入100ml胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合IOmin后，加入终质 量浓度为0. 5%的BSA，4°C保存过夜后冷冻超速离心纯化。3.金标抗体的纯化(1)金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉 淀，取红色上清溶液于4°C再12000r/min离心30min。(2)溶液分为三层透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的 金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬 液终质量浓度为0.5%%吐温20，3%海藻糖，2%85々，0.0111101/1 PBS pH7. 4溶液。(3)重复离心3次，最后重悬至原体积的1/20，加入0. 1 %的叠氮钠4°C保存备用。4.结合垫的前处理样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封 闭处理，浸泡30min后37°C、2h烘干，结合垫处理液含有终质量浓度为0. 5% %吐温20，3%海藻糖，6%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。5.根据实施例1中5所述。6.根据实施例1中6所述。7.根据实施例1中7所述。8.根据实施例1中8所述。实施例41.根据实施例1中1所述。2.胶体金标记抗体最少稳定蛋白量再增加10%左右为最佳标记蛋白用量。胶体 金用0. lmol/L的HCl和K2CO3调至pH9. 2，取最佳用量氯霉素单克隆抗体16 μ g/ml、终质量 浓度为1. 5%的海藻糖同时加入IOOml胶体金溶液，在磁力搅拌器下混合IOmin后，加入终 质量浓度为0. 5%的BSA，4°C保存过夜后冷冻超速离心纯化。3.金标抗体的纯化(1)金标抗体溶液常温低速(1500rpm)离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉 淀，取红色上清溶液于4°C再12000r/min离心30min。(2)溶液分为三层透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的 金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用重悬液重悬至原量，重悬 液终质量浓度为0. 吐温20，2.5%海藻糖，1.5%85六，0.0111101/1 PBS pH7. 4溶液。(3)重复离心3次，最后重悬至原体积的1/20，加入0. 1 %的叠氮钠4°C保存备用。4.结合垫的前处理样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封 闭处理，浸泡30min后37°C、2h烘干，结合垫处理液含有终质量浓度为0. 3 %吐温20， 2. 5%海藻糖，5%蔗糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。5.根据实施例1中5所述。6.根据实施例1中6所述。7.根据实施例1中7所述。8.根据实施例1中8所述。
权利要求
一种快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，包括胶体金的制备，胶体金标记氯霉素单克隆抗体制备金标抗体，金标抗体纯化，金标抗体结合垫以及样品垫的制备，硝酸纤维膜检测线和控制线的包被，试纸条组装，其特征是同时加入保护剂和氯霉素单克隆抗体制备金标抗体，制得的金标抗体使用重悬液离心纯化，金标抗体结合垫先用结合垫处理液处理，再喷上金标抗体而制得。
2.根据权利要求1所述的快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，其特征是 所述保护剂是海藻糖，海藻糖终质量浓度为0. 5% 3%。
3.根据权利要求1所述的快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，其特征是 金标抗体离心纯化所用的重悬液其配方是终质量浓度为0. 0. 5%吐温20， 3% 海藻糖，0. 5% 2% BSA，0. 01mol/L PBS ρΗ7· 4 溶液。
4.根据权利要求1所述的快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，其特征是 结合垫处理液配方为终质量浓度为0. 0. 5%吐温20， 3%海藻糖，5% 10%蔗 糖，0. 01mol/L PBS pH7. 4 溶液。
全文摘要
一种快速检测氯霉素残留的胶体金试纸条制备方法，是针对现有技术的制备工艺条件复杂的问题，在胶体金标记氯霉素抗体的方法、重悬液、结合垫处理液方面做出了改进，制备工艺简单、易行，结果证明试纸条具有高灵敏度、高特异性、准确简便、重复性好等优点，制备试纸条的方法整个工艺条件稳定、成熟、可靠，可以制备出质量较好的胶体金试纸条，可以用于氯霉素试纸条的生产，同时对其它试纸条的生产具有一定的参考价值。
文档编号G01N33/577GK101943701SQ201010219939
公开日2011年1月12日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者严杰琳, 刘成梅, 涂宗财, 罗舜菁, 陈婷婷, 陈文荣, 陈臣, 高鹏 申请人:南昌大学