专利名称：β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及β -兴奋剂检测技术领域，特别是一种β -兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克 多巴胺二元检测测试条及其制备方法。
背景技术：
β -兴奋剂是一类拟肾上腺素，因其能使动物和人体组织中的β受体兴奋(激 动)从而调节体内不同组织的机能而得名，其化学成分为苯乙醇胺衍生物，该类药物具有 促进畜禽脂肪分解、增加肌肉生长作用，作为营养重分配剂，以提高瘦肉率，减少脂肪沉积 和促进动物生长，被一些畜牧养殖者作为养殖促进剂非法使用。在养殖业中最常用的是盐 酸克仑特罗(Clenbuterol)、沙丁胺醇(Salbutamol)和莱克多巴胺(ractopamine)，在家 畜饲料中使用兴奋剂而造成消费者食物中毒事件时有发生。兴奋剂作为促进动物 生长、提高瘦肉率的饲料添加剂，但长期使用会使该类药物在动物食品中蓄积，人食用了饲 喂含β-兴奋剂作为添加剂饲料的畜产品后，就会出现中毒症状，通常会出现肌肉震颤、心 悸、精神紧张、头疼、肌肉疼痛、晕眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，甚至死亡。因此，世界许 多国家禁止在饲料中使用盐酸克伦特罗等β-兴奋剂来增加动物的瘦肉率。我国政府已明 令禁止在畜牧生产中使用盐酸克伦特罗等兴奋剂。目前，现有技术对于盐酸克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的检测主要依赖化学 仪器分析、酶免疫检测试剂盒及单独检测盐酸克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的检测测 试条。监管部门并不知道养殖户使用了何种β兴奋剂，检测存在一定的盲目性，常常造成 漏检。因此，市场迫切需要有一种试剂能同时检测常见的β兴奋剂，以方便日常监管工作。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种β “兴奋剂盐 酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条及其制备方法，可有效解决快速、简便地同时检测 出兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺的问题，其解决的技术方案是，该测试条包括基材 PVC板和覆膜，基材PVC板上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤 维膜和吸水棉浆板，引水玻璃纤维、载体玻璃纤维和吸水棉浆板上面覆盖有由前部覆盖膜 和后部覆盖膜组成的覆膜，测试条前部载体玻璃纤维上吸附有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联 物、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；中部硝酸纤维膜上自后而前分 布有一条包被有兔抗鼠多抗(为公知市售产品，如郑州兰森生物技术有限公司的产品)的 质控线，二条分别包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物的检测线 (所说的前、后是指以引水方向向吸水方向而言，引水玻璃纤维为前，吸水棉浆板为后)，硝 酸纤维膜两端分别与载体玻璃纤维后端面和吸水棉浆板前端面紧密接触，载体玻璃纤维前 端面和引水玻璃纤维后端面紧密接触；本发明的测试条的制备方法是，由以下步骤实现首先分别制备胶体金标记单克隆抗体、胶体金溶液、胶体金标记物、固化金标物、包被膜，再将上述制备好的包被膜、固化 金标物、引水玻璃纤维、吸水棉浆板固定粘结于基材PVC板上，覆盖上覆膜，切割成长条即可。本发明可有效用于同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺，方法简单，方便、快捷，结 果准确。
四
附图为本发明测试条立体结构图(覆膜掀起)。
五具体实施例方式以下结合附图对本发明的具体实施方式
作详细说明。由附图给出，本发明二元检测测试条其结构是，包括基材PVC板和覆膜，基材PVC 板1上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维3、载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2和吸水棉浆 板5，引水玻璃纤维3、载体玻璃纤维4和吸水棉浆板5上面覆盖有由前部覆盖膜7和后部 覆盖膜6组成的覆膜，测试条前部载体玻璃纤维上吸附有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、 抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；中部硝酸纤维膜上自后向前分布有 一条包被有兔抗鼠多抗的质控线，二条分别包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴 胺蛋白质偶联物的检测线(所说的前、后是指以引水方向向吸水方向而言，引水玻璃纤维 为前，吸水棉浆板为后)，硝酸纤维膜两端分别与载体玻璃纤维后端面和吸水棉浆板前端面 紧密接触，载体玻璃纤维前端面和引水玻璃纤维后端面紧密接触。为了保证使用效果，所说的覆膜为不干胶膜。本发明二元检测测试条的制备方法是，由以下步骤实现首先分别制备胶体金标 记单克隆抗体、胶体金溶液、胶体金标记物、固化金标物、包被膜，再将上述制备好的包被 膜、固化金标物、引水玻璃纤维、吸水棉浆板固定粘结于基材PVC板上，覆盖上覆膜，切割成 长条即可；具体是1.胶体金标记单克隆抗体的制备取1份含有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物 或莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水与2份60mM醋酸缓冲液混合，室温 (18-25°C )搅拌下逐滴加入辛酸33 μ 1/ml小鼠腹水(即辛酸加入量为每Iml小鼠腹水中加 入33 μ 1的辛酸)，混勻后，室温(18-25°C )放置30分钟，15000转/分、4°C离心20分钟， 用玻璃棉过滤上清液，弃沉淀，过滤后的上清液用NaOH调PH值至7. 2，再加入硫酸铵，硫酸 铵加入量为每Iml PH值7. 2的上清液中加入硫酸铵0. 277g(硫酸铵0. 277g/ml PH值7. 2 上清液)，快速使硫酸铵溶解，室温(18-25°C )搅拌30分钟，15000转/分4°C离心20分 钟，弃上清液，沉淀物用原小鼠腹水1/2体积的0. OlM PBS pH 7. 2溶液溶解，再放入0. OlM PBS pH 7. 2溶液中浸没，4°C透析48小时，用紫外分光光度计测定蛋白含量，即制备成胶体 金标记用的抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆 抗体；所说的小鼠腹水，其制备方法是，将液体石蜡注射7周龄Balb/c小鼠腹腔内，注射量 为500μ1/只，10天后，将分泌抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联 物单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2 X IO6/只鼠，10 天后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即为抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗盐酸克
5伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水；2、制备胶体金溶液在烧杯中加入IOOOml蒸馏水，100°C煮沸约5分钟，再加入质 量浓度为1 %的氯金酸溶液IOml和质量浓度为1 %的柠檬酸三钠溶液15 20ml，搅拌至溶 液呈深红色，冷至室温(18-25°C)，用碳酸钾(K2CO3)调PH值至待标记单克隆抗体的等电点 或略偏碱，即为待标记的胶体金溶液；3、胶体金标记物的制备取IOOml步骤2中调好PH的胶体金溶液，加入抗盐酸克 伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体1 10 μ g/ml 胶体金溶液，搅拌2分钟，加入质量浓度为10%的牛血清白蛋白(BSA) 15 μ 1/ml胶体金溶液 终止反应，离心50分钟，得沉淀物，取沉淀物用PH为7. 4的0. OlM PBS稀释至步骤2的原 胶体金溶液体积的30 %，制备成抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺 蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；4、固化金标物的制备用载体玻璃纤维吸取抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆 抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，干燥，制备成抗盐酸克伦特 罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体固化金标物；5、包被膜制备取兔抗鼠多抗、盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶 联物，分别包被于硝酸纤维膜上，制备成包被膜；兔抗鼠多抗包被浓度为0. 5 5mg/ml，盐 酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0. 05 2mg/ml ；6、测试条装备取基材PVC板1，将引水玻璃纤维3、固化金标物的载体玻璃纤维 4、构成包被膜的硝酸纤维膜2、吸水棉浆板5自前向后依次粘贴于基材PVC板1上，覆盖上 由前部覆盖膜7和后部覆盖膜6组成的覆膜，切割成长条即可(如附图所示)。本发明在具体实施中，还可由以下实施例给出实施例1 β _兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条，包括基材PVC板 1、粘附于基材中部的硝酸纤维膜2、粘附于基材前部(本实施例中前、后部以测试条使用时 标本样品泳动方向为准，引水端为前，吸水端为后，即引水玻璃纤维为前，吸水棉浆板为后) 的引水玻璃纤维3及载体玻璃纤维4、粘附于基材上部的吸水棉浆板5、上部覆膜6及下部 覆膜7，引水玻璃纤维3后端面和载体玻璃纤维4前端面紧密相接，硝酸纤维膜2两端面分 别和载体玻璃纤维4的后端面及吸水棉浆板5前端面紧密接触，下部载体玻璃纤维4为抗 盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体和抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体固化金 标物，胶体金溶液制备中质量浓度为的柠檬酸三钠溶液量为17ml，胶体金标记抗盐酸 克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体浓度为5μ g/ ml ；中部硝酸纤维膜2上包被有一条质控线和两条测试线，质控线包被有兔抗鼠多抗，测试 线包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物，兔抗鼠多抗包被浓度为 lmg/ml，盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0. 2mg/ml。实施例2 本实施例中，胶体金溶液制备中，质量浓度为的柠檬酸三钠溶液量 为15ml，胶体金标记抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联 物单克隆抗体浓度为4μ g/ml ；兔抗鼠多抗包被浓度为0. 9mg/ml，盐酸克伦特罗蛋白质偶 联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0. lmg/ml。其它同实施例1。实施例3 本实施例中，胶体金溶液制备中，质量浓度为的柠檬酸三钠溶液量 为19ml，胶体金标记抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联
6物单克隆抗体浓度为8μ g/ml ；兔抗鼠多抗包被浓度为2mg/ml，盐酸克伦特罗蛋白质偶联 物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0. 5mg/ml。其它同实施例1。本发明测试条在使用时，将引水玻璃纤维膜一端竖向插入标本样品中，或将标本 样品滴至测试条下部引水玻璃纤维上。样品在毛细作用下，沿测试条向吸水棉浆板方向泳 动，如果标本样品中含有β “兴奋剂盐酸克伦特罗和莱克多巴胺或一种，它们与相应标记 抗体(胶体金标记单克隆抗体)反应形成标记抗体一抗原复合物。当标本样品泳动至包被 有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物检测带时则不发生反应，而与质 控线反应，结果仅出现一条红线(质控线)或两条红线；如果标本样品中无兴奋剂盐酸 克伦特罗和莱克多巴胺，标记抗体(抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多 巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体)分别与包被膜上盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺 蛋白质偶联物以及质控线结合形成红色线条带，结果出现η+1条红线；如质控线不出现红 线，则表明测试条已失效。因此，利用本测试条，只需一次加样，5-10分钟即可对二种β-兴 奋剂进行检测。该方法简单、方便、快捷、结果准确。本发明经试验，利用本测试条同时测试兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺，只 需一次加样，5-10分钟即可对兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺进行测试，经158次试 用，除1例不明确外，其余157例均达到了满意效果，准确率达99%以上，因此，本发明具有 方法简单，方便快捷，结果准确之特点，是β -兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺检测上的 创新。
权利要求
一种β 兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条，包括基材PVC板和覆膜，其特征在于，基材PVC板(1)上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维(3)、载体玻璃纤维(4)、硝酸纤维膜(2)和吸水棉浆板(5)，引水玻璃纤维(3)、载体玻璃纤维(4)和吸水棉浆板(5)上面覆盖有由前部覆盖膜(7)和后部覆盖膜(6)组成的覆膜，测试条前部载体玻璃纤维上吸附有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；中部硝酸纤维膜上自后而前分布有一条包被有兔抗鼠多抗的质控线，二条分别包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物的检测线，硝酸纤维膜两端分别与载体玻璃纤维后端面和吸水棉浆板前端面紧密接触，载体玻璃纤维前端面和引水玻璃纤维后端面紧密接触。
2.根据权利要求1所述的兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条，其特 征在于，所说的覆膜为不干胶膜。
3.权利要求1所述的兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条的制备方 法，其特征在于，由以下步骤实现(1)、胶体金标记单克隆抗体的制备取1份含有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物或莱克 多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水与2份60mM醋酸缓冲液混合，室温搅拌下逐滴 加入辛酸33 μ 1/ml小鼠腹水，混勻后，18-250C放置30分钟，15000转/分、4°C离心20分钟， 用玻璃棉过滤上清液，弃沉淀物，过滤后的上清液用NaOH调PH值至7. 2，再加入硫酸铵，硫 酸铵加入量为每ImlPH值7. 2的上清液中加入硫酸铵0. 277g，快速使硫酸铵溶解，18-25°C 搅拌30分钟，15000转/分4°C离心20分钟，弃上清液，沉淀物用原小鼠腹水1/2体积的 0. OlM PBS pH 7. 2溶液溶解，再放入0.0IM PBS pH 7. 2溶液中浸没，4°C透析48小时，用紫 外分光光度计测定蛋白含量，即制备成胶体金标记用的抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克 隆抗体、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体；所说的小鼠腹水，其制备方法是，将液体 石蜡注射7周龄Balb/c小鼠腹腔内，注射量为500 μ 1/只，10天后，将分泌抗莱克多巴胺蛋 白质偶联物或抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内， 注射杂交瘤细胞的数量为2X IO6/只鼠，10天后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即 为抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水；(2)、制备胶体金溶液在烧杯中加入IOOOml蒸馏水，100°C煮沸5分钟，再加入氯 金酸溶液IOml和1 %柠檬酸三钠溶液15 20ml，搅拌至溶液呈深红色，冷至18_25°C，用碳 酸钾调PH值至待标记单克隆抗体的等电点或略偏碱，即为待标记的胶体金溶液；(3)、胶体金标记物的制备取IOOml步骤2中调好PH的胶体金溶液，加入抗盐酸克伦 特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体1 10μ g/ml胶 体金溶液，搅拌2分钟，加入质量浓度为10%的牛血清白蛋白15μ 1/ml胶体金溶液终止反 应，离心50分钟，得沉淀物，取沉淀物用PH为7. 4的0. OlM PBS稀释至步骤2的原胶体金 溶液体积的30%，制备成抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质 偶联物单克隆抗体胶体金标记物；(4)、固化金标物的制备用载体玻璃纤维吸取抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗 体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，干燥，制备成抗盐酸克伦特罗 蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体固化金标物；(5)、包被膜制备取兔抗鼠多抗、盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物，分别包被于硝酸纤维膜上，制备成包被膜；兔抗鼠多抗包被浓度为0. 5 5mg/ml，盐酸 克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0. 05 2mg/ml ；(6)、测试条装备取基材PVC板(1)，将引水玻璃纤维(3)、固化金标物的载体玻璃纤 维(4)、构成包被膜的硝酸纤维膜(2)、吸水棉浆板(5)自前向后依次粘贴于基材PVC板⑴ 上，覆盖上由前部覆盖膜(7)和后部覆盖膜(6)组成的覆膜，切割成长条即可。
全文摘要
本发明涉及β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条及其制备方法，有效解决快速、简便同时检测β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺的问题，方法是，基材PVC板上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤维膜和吸水棉浆板，引水玻璃纤维、载体玻璃纤维和吸水棉浆板上面覆盖有覆膜，测试条前部载体玻璃纤维上吸附有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；中部硝酸纤维膜上自后而前分布有一条包被有兔抗鼠多抗的质控线，二条分别包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物的检测线，本发明可有效用于同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺，方便、快捷，结果准确。
文档编号G01N33/532GK101936995SQ20101023558
公开日2011年1月5日 申请日期2010年7月26日 优先权日2010年7月26日
发明者刘丽, 杨书豪, 王玉金 申请人:河南省科学院生物研究所有限责任公司