专利名称：一种艾塞那肽药代动力学的测试方法
技术领域：
一种艾塞那肽药代动力学的测试方法，属于分析技术领域。
背景技术：
艾塞那肽(Exendin-4)是人工合成的新一类降糖药物，由39个氨基酸(His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-P he-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2)组 成的多肽，与内源性肠降血糖素的作用相似，用于治疗2型糖尿病。2型糖尿病是一种进展 性疾病，随着病程的延长，患者血糖控制也愈加困难。研究证实，在使用固定剂量的前提下， 艾塞那肽的降糖作用能够持续稳定存在。艾塞那肽已被美国食品与药物管理局(FDA)批准 用于2型糖尿病患者单药起始治疗，随着艾塞那肽相关研究的开展，其治疗适应症和剂型 也在不断更新。因此研究艾塞那肽在人体血液中的药代动力学行为极为重要，它对药物剂 型的研究、对临床医生的合理用药起重要的指导作用。人血浆中的浓度测定有文献报道采用ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay)，用美国LINCO试剂公司生产的试剂盒；ELISA试剂盒价格较昂贵，而 且存在稳定性差等缺陷。本发明采用Se5pax-UCt生产的Styre Screen H2P柱，经固相萃 取将血浆样品浓缩后，采用HPLC分析血浆中艾塞那肽的浓度，用自编的药物动力学定域模 型计算软件PKLMC (Pharmacokinetics Local ModelCalculation)研究药物在血液中的动 力学行为，计算动力学方程、速率常数、半衰期、药-时曲线下的面积AUC、清除率CL、分布容 积等动力学参数。
发明内容
本发明的目的是提供一种艾塞那肽药代动力学的测试方法，我们采用固相萃取将 人血浆样品浓缩后采用高效液相色谱_紫外检测器对色谱行为进行了一系列的考察后，确 定了本发明方法。本发明的技术方案一种艾塞那肽药代动力学的测试方法将人血浆样本经固相 萃取柱萃取浓缩后稀释至合适的浓度，采用高效液相色谱_紫外检测器对艾塞那肽进行检 测，步骤为(1)血浆样本的提取采用固相萃取装置VMF016GL，Sepax-uct 的Styre Screen H2P柱，先依次用 ImL 甲醇、ImL含质量浓度0. 三氟乙酸的去离子水将柱子活化；吸取0. 5mL血浆样本，以1 2mL/min的速度加入固相萃取柱，样本富集后用ImL含质量浓度0. 三氟乙酸的去离子水 淋洗，抽干；再用甲醇-含质量浓度0. 三氟乙酸的去离子水溶液洗脱(甲醇含质量浓 度0. 三氟乙酸的去离子水体积比75 25)，抽干；用氮气吹干有机溶剂，冷冻干燥，待 测；(2) HPLC 测试
色谱条件确定为仪器WATERS 600型高效液相色谱仪，WATERS 2487紫外检测 器，色谱柱S印ax昍-(18，5“111，4.6\250讓；流动相A 含质量浓度0. 三氟乙酸的乙 腈，B 含质量浓度0. 1 %三氟乙酸的去离子水；使用前流动相经0. 45 μ m滤膜抽滤并脱气， 流速0. 8mL/min ；样品的进样体积10 μ L ；柱温室温；检测波长210nm ；精密称取标准品 艾塞那肽作对照，用质量浓度85%乙腈-去离子水配制成含艾塞那肽0. 05mg/mL的溶液，计 为Wwm ；0. 5mL血浆样本经步骤(1)提取冻干后的样本，加50 μ L质量浓度85%乙腈-去离 子水溶解作为被测样本W#s ；经HPLC测试对照品的色谱峰面积分别为SWM，被测样本的色 谱峰面积为S#s，按外标法计算被测样本中艾塞那肽的含量为ff#p= (S样品/S对照)W对照，单位为mg/mL，血浆中艾塞那肽的含量为Wtis X 50/0. 5X 106pg/mL。本发明的有益效果本发明提供了一种经固相萃取将人血浆艾塞那肽样品富集 在Styre Screen H2P柱上，经洗脱血浆中艾塞那肽的回收率接近80% ；用高效液相色 谱_紫外检测器检测人血浆中艾塞那肽的浓度的方法，显示主成分峰与杂质峰分离良好， 在5 160 μ g/mL试验范围内呈线性；用药物动力学定域模型计算软件PKLMC计算出了艾 塞那肽在人血浆中的动力学方程、速率常数、半衰期、药_时曲线下的面积AUC、清除率CL、 分布容积等动力学参数。本发明用液相色谱分析人血浆中艾塞那肽的含量，方法简便、可 靠。为临床用药提供有效的实验数据。
具体实施例方式实施例1血浆样品的提取采用StyreScreen H2P柱(固相萃取装置 VMF016GL，Sepax-uct)，先依次用 ImL甲醇、ImL去离子水(含0. 三氟乙酸)将柱子活化；吸取0. 5mL血浆样本，以1 2mL/min的速度加入固相萃取柱，样品富集后用ImL去离子水(含0. 三氟乙酸)淋洗， 抽干；再用甲醇-含0.1%三氟乙酸的去离子水(体积比75 25)溶液洗脱，抽干；用氮气 吹干有机溶剂，冷冻干燥，待测。实施例2色谱条件的选择色谱柱S印ax昍_(18，5“111，4.6\250讓；流动相4:乙腈(0.1%1卩六)，8:水 (0. 1% TFA)；流速0. 8mL/min ；样品的进样体积=IOyL ；柱温室温；检测波长:210nm。梯度程序的优化0 20min，80% A 20% A ;20 25min，20% A 20% A，色谱 分离能达到理想的分离效果，血浆中的各组份与艾塞那肽分离较好，不影响艾塞那肽的分 析。其他梯度情况下，分离度减小或色谱峰发生分叉。实施例3线性范围和检测限试验精确称取一定量的艾塞那肽标准品适量，用流动相溶解并稀释成浓度分别为5、 10、20、40、80、16(^8/!^的标准溶液，分别进样10 μ L，用积分面积对样品量作图。所得回 归方程为ι = 84703x+3917165, R2 = 0. 9999，线性范围为5 160 μ g/mL。最小检出量为 1. 5ng(S/N ≥ 3)。实施例4精密度试验精确称取一定量的艾塞那肽标准品适量，用流动相溶解稀释，配制10、20、80μ g/ mL的高、中、低3种浓度的艾塞那肽质控溶液，在确定的色谱条件下于同一天内连续进样5次，根据峰面积计算精确度。
表 1 实施例5血浆样本艾塞那肽提取回收率的测定称取一定量的艾塞那肽标准品适量，使其在血浆中的浓度为10、20、80μ g/mL，按 实施例1方案提取血浆中的艾塞那肽，经HPLC测定艾塞那肽的浓度，测定值除以理论值即 得艾塞那肽提取回收率。经Styre Screen H2P固相萃取柱血浆中艾塞那肽平均提取回 收率接近80% ；用⑶C18、CEC18固相萃取柱血浆中艾塞那肽提取回收率仅40%左右，文献 报道的方法血浆中艾塞那肽提取回收率接近50%。实施例6血浆样品浓度测定精密称取标准艾塞那肽对照品，用(85% )乙腈-水配制成含艾塞那肽0.05mg/ mL的溶液，计为W5i ；健康志愿者(10个)分别于给药前(Oh)及给药后(皮下注射，剂量 5 μ g/kg) 0. 25,0. 5、0. 75、1、1. 25、1. 5、2、2. 5、3、4h不同时间点采血约5mL置于无菌干燥抗 凝试管中，3000rpm、4°C离心分离后将上清液置于另一无菌干燥试管中，-80°C冷冻保存。取 0. 5mL血浆，经实施例1方案提取冻干后加50μ L(85% )乙腈-去离子水溶解，超声振荡， 过滤作为被测样本W#s。经HPLC测试对照品的色谱峰面积分别为S5i ，被测样本的色谱 峰面积为S#s，按外标法计算被测样本中艾塞那肽的含量为W#S= (S#s/SM)WM (mg/ mL)，血浆中艾塞那肽的含量为Wtis X 50/0. 5X 106pg/mL。
表2 实施例7用药物动力学定域模型计算软件PKLMC (Pharmacokinetics LocalModel Calculation)研究药物在血液中的动力学行为，计算动力学方程、速率常数、半衰期、 药-时曲线下的面积AUC、清除率CL、分布容积等动力学参数。输入数据给药方式、给药剂量、采样时间点t、t时刻血浆中测得的艾塞那肽浓 度，运行PKLMC软件，软件计算获得以下计算结果。计算结果表 3 从上述计算结果可见，吸收速率常数为1.491/h、消除速率常数为0.661/h、吸收 相半衰期、&为0. 46h、分布相半衰期t1/2a为0. 52h，而消除相半衰期、/20为1. 12h，表明 该药物在肌肉注射进入体内后，很快进入血液循环，吸收快、消除慢，有利发挥其治疗作用。 药物浓度_时间曲线下面积AUC为218. 79ng/L*h，表明该药物在血液中能在一定的时间内 维持适当的药物浓度，其降糖作用能够持续稳定存在，有利于治疗。达峰时间tmax和峰值Cmax 表明该药物在0. 97h时达到最高浓度74. 64ng/L。动力学研究表明艾塞那肽在体内具有良 好的动力学行为，对药物的用量、对临床医生的合理用药起重要的指导作用。
权利要求
一种艾塞那肽药代动力学的测试方法，其特征在于将人血浆样本经固相萃取柱萃取浓缩后稀释至合适的浓度，采用高效液相色谱 紫外检测器对艾塞那肽进行检测，步骤为(1)血浆样本的提取采用固相萃取装置VMF016GL，Sepax uct的柱，先依次用1mL甲醇、1mL含质量浓度0.1％三氟乙酸的去离子水将柱子活化；吸取0.5mL血浆样本，以1～2mL/min的速度加入固相萃取柱，样本富集后用1mL含质量浓度0.1％三氟乙酸的去离子水淋洗，抽干；再用甲醇 含质量浓度0.1％三氟乙酸的去离子水溶液洗脱，甲醇含质量浓度0.1％三氟乙酸的去离子水体积比75∶25，抽干；用氮气吹干有机溶剂，冷冻干燥，待测；(2)HPLC测试色谱条件确定为仪器WATERS 600型高效液相色谱仪，WATERS 2487紫外检测器，色谱柱Sepax HP C18，5μm，4.6×250mm；流动相A含质量浓度0.1％三氟乙酸的乙腈，B含质量浓度0.1％三氟乙酸的去离子水；使用前流动相经0.45μm滤膜抽滤并脱气，流速0.8mL/min；样品的进样体积10μL；柱温室温；检测波长210nm；精密称取标准品艾塞那肽作对照，用质量浓度85％乙腈 去离子水配制成含艾塞那肽0.05mg/mL的溶液，计为W对照；0.5mL血浆样本经步骤(1)提取冻干后的样本，加50μL质量浓度85％乙腈 去离子水溶解作为被测样本W样品；经HPLC测试对照品的色谱峰面积分别为S对照，被测样本的色谱峰面积为S样品，按外标法计算被测样本中艾塞那肽的含量为W样品＝(S样品/S对照)W对照，单位为mg/mL，血浆中艾塞那肽的含量为W样品×50/0.5×106pg/mL。FSA00000205873400011.tif
全文摘要
一种艾塞那肽药代动力学的测试方法，属于分析技术领域。本发明将人血浆样本经固相萃取柱萃取浓缩后稀释至合适的浓度，采用高效液相色谱-紫外检测器对艾塞那肽进行检测；用质量浓度85％乙腈-去离子水配制成含艾塞那肽0.05mg/mL的溶液，计为W对照；0.5mL血浆样本经固相萃取冻干后的样本，加50μL质量浓度85％乙腈-去离子水溶解作为被测样本W样品；经HPLC测试对照品的色谱峰面积分别为S对照，被测样本的色谱峰面积为S样品，按外标法计算被测样本中艾塞那肽的含量为W样品＝(S样品/S对照)W对照，血浆中艾塞那肽的含量为W样品×50/0.5×106pg/mL；本发明用液相色谱分析人血浆中艾塞那肽的含量，方法简便、可靠、为临床用药提供有效的实验数据。
文档编号G01N30/06GK101900712SQ201010237160
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月21日 优先权日2010年7月21日
发明者刘英涛, 周杏琴, 孔艳艳, 曹国宪, 蔡刚明, 钦晓峰 申请人:江苏省原子医学研究所