专利名称：一种人c-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测试纸的制作方法
技术领域：
本发明属人C-反应蛋白的定量检测领域，特别是涉及利用胶体金免疫层析法进 行人C-反应蛋白的定量检测。_
背景技术：
C 反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是由 Tillet 和 Francis 于 1930 年在一 些急性病患者的血清中发现，是环状五球体蛋白，属于Oligomeric钙结合蛋白，相对分子 质量约120，000，由5个相同的单体以非共价键构成，是炎性淋巴因子白介素-6、白介素-1、 肿瘤坏死因子刺激肝脏上皮细胞合成的。因为它能和肺炎链球菌的荚膜C多糖起沉淀反应 而得名。CRP主要用作细菌感染和疾病活动性的指针。当体内有急性炎症、细菌感染、大面 积组织破坏、恶性肿瘤时，很快就会出现CRP升高，而治愈时，又很快就降低到正常范围，这 是一禾中急性其月反应蛋白(acute phase reactant protein)。目前，临床上检测CRP主要用免疫浊度法、单向免疫扩散法、胶乳凝集法等方法。 中国专利申请CN1040438提供了一种快速检测C-反应蛋白的试剂，是由羊抗人CRpZgCT、聚 苯乙烯乳胶、甘氨酸缓冲液、蒸馏水、叠氮钠配制的一种胶乳凝集法检测试剂。该胶乳凝集 法快速简单，但只是半定量，敏感性低，不适合大部分需要定量的临床检测。中国专利申请 CN1769894公开了一种高敏C反应蛋白测定试剂盒，包含试剂R — 1为结合有羊抗人C 一反 应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为200 - 240nm，置于适当的缓冲液中；试剂 R - 2为结合有羊抗人C 一反应蛋白抗体的苯乙烯胶乳溶液，胶乳颗粒直径为30 - 70nm, 置于适当的缓冲液中。该胶乳凝集反应法提高了灵敏度，可进行低含量水平的测定。由于上述方法都需要特殊的仪器设备，故操作人员和环境有一定的要求，而且检 测费时，繁琐，不利于广泛普及。基于免疫层析法的CRP检测试纸或检测卡不需要特殊的仪 器设备，便于携带运输，操作简便，层析试剂比液体的检测试剂容易保存。其中，比较适合于 临床快速检测且方法稳定的是胶体金免疫层析技术，以其简便快速的优势在临床医学检验 中占据一席之地。中国实用新型专利CN201096787涉及一种C-反应蛋白颜色颗粒诊断试 纸，通过利用快速免疫层析法，定性地检测临床标本(全血/血清/血浆)中的CRP。该实 用新型是由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、颜色颗粒固定垫、样品吸液层、MAX线组成，底板中 部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条C-反应蛋白单克隆抗体试验线和一条羊抗鼠 多克隆抗体控制线，在底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两 端分别与吸水板与颜色颗粒固定垫相互交叠连接，在颜色颗粒固定垫上压有样品吸液层。 但是，该方法无法实现CRP的定量检测。中国专利申请CN101320041《一种快速定量检测C 一反应蛋白的胶体金法及其应 用》提供了一种胶体金免疫渗滤法来定量检测CRP的方法。反应原理为固相双抗体夹心法
3的金标免疫斑点渗滤试验，待测样品经40 - 480倍稀释后与免疫胶体金在液相均质介质 中混和均勻，再转加到反应板上，其中所含的、已与免疫胶体金在一起的待测物能为膜上固 定的抗待测物另一决定簇的单抗或多抗特异性地捕获，呈红色斑点，斑点色泽与样品中CRP 浓度呈正比。但是，由于该专利所公开的检测方法为胶体金免疫渗滤法，而非胶体金免疫层 析法，故配套的试剂盒需要由CRP金标液冻干品、反应板、样品稀释液、封闭液和塑料滴管 等组成，组分较多，造成检测操作比较繁琐。由于含有金标液冻干品，该试剂须在检测前室 温平衡30分钟，耗费了等候检测的时间，使检测报告的及时性较差。此外，更为关键的是， 该试剂盒的检测范围相对有限，在检测高浓度CRP样品中容易出现HOOK效应，必须将待测 样品进行佥适的稀释，如其所公开的，稀释40 - 480倍，但是，往往在初次检测时，无法知道 究竟该稀释多少倍，即在样品的初始浓度无法知道的情况下，容易产生高浓度样品稀释倍 数不够的情况，于是，检测结果可能因为HOOK效应而偏低。这样的缺陷使该方法在定量检 测中的可靠性降低。常规CRP免疫层析定性检测试纸由两条线组成，沿样品走向由下端至上端分别为 检测线、质控线。测定时，若检测线和质控线均出现红色可判定为阳性，若仅质控线出现红 色为阴性，质控线不显色则为无效。这样布置的检测试纸一般很难用于定性检测，要在同类 的检测试纸上实现定量检测，必须通过特殊的设计，才能实现定量检测。_
发明内容
所要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测试纸， 以克服现有的人C-反应蛋白胶体金定量检测技术试剂复杂、操作繁琐、报告速度相对较慢 的缺陷。
技术方案
本发明的技术方案之一是提供一种人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测试纸， 该检测试纸包括依次在带有粘合剂的底板上相互搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和 吸水纸，其中，所述的结合垫上涂有胶体金标记的CRP抗体复合物，所述的硝酸纤维素膜上 结合有检测线和质控线，所述的检测线和质控线均为免疫抗体；检测时，将待测样品与所述 检测试纸的下端接触并沿试纸层析，若质控线不显色为无效，若只有质控线显色则表示CRP 浓度小于最低检测浓度，若质控线和定量线均出现红色，则通过一种定量检测装置判读CRP 的含量；其中，沿样品层析方向由该检测试纸的下端至上端分别为质控线和定量线。上述的定量检测试纸的优选方式之一为，所述的胶体金标记的CRP抗体复合物为 标记胶体金颗粒的鼠抗CRP单克隆抗体。上述的定量检测试纸的优选方式之二为，所述的质控线和定量线包被抗体为CRP 抗体。本发明的技术方案之二是提供一种人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测试 剂盒，由包含上述的定量检测试纸的检测卡、样品稀释液和塑料滴管组成。上述的定量检测试纸 以成为CRP检测卡的一部分，所述的检测卡由上述的定量检测试纸和硬质塑料卡组成。本发明的技术方案之三是提供一种人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测卡 的制备方法，依次包括以下步骤
(1)将鼠抗CRP单克隆抗体标记于胶体金颗粒表面，低温离心，用硼酸缓冲液重悬，离 心浓缩，获得胶体金-CRP抗体复合物，冷藏保存；
(2)选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，将其放入含BSA、蔗糖、PVP和吐温的PBS样品 垫处理液中浸泡，烘干备用；
(3)选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料，将上述的胶体金-CRP抗体复合物重新分散 于含蔗糖、BSA、PEG2000和吐温的Tris缓冲稀释液中，并喷于结合垫上烘干；
(4)硝酸纤维素膜的点样用点膜仪在硝酸纤维素膜的不同位置喷点抗体，自下端至 上端依次为质控线、定量线，烘干；
(5)组装将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的底板上，切 成试纸条，与硬质塑料卡一起装配成检测卡。本发明的技术方案之四是提供一种人C-反应蛋白胶体金免疫层析定量检测方 法，依次包括如下步骤
(1)用上述的检测试纸检测系列浓度的标准抗原，利用定量检测装置读出检测值和质 控值之间的比值；
(2)将所述的比值对所述的标准抗原浓度绘制标准曲线，将标准曲线输入到定量检测 装置中；
(3)用上述的检测试纸检测含CRP的待测样品，并利用定量检测装置中的标准曲线获 得所述待测样品的CRP浓度值。本发明的技术方案之五是提供一种人C-反应蛋白胶体金免疫层析定量检测的专 用装置，包括打印机、显示屏、键盘、固定于仪器底板上的电路板和光学部件。本发明的技术方案之六是提供一种上述的人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量 检测试纸在检测人血清中的C-反应蛋白中的应用。具体而言，本发明的CRP定量检测试纸可以应用于如下几方面中的CRP浓度测 定
1.感染的诊断和鉴别由于CRP在感染发生后6 8h即开始升高，24 48h达到高 峰，高峰值可达正常的数百倍，在感染消除后其含量急骤下降，一周内可恢复正常。而CRP 在病毒感染时无显著升高，这为疾病早期感染类型的鉴别提供了极其重要的依据。2.确定抗生素的疗效CRP在确定抗生素的疗效方面也发挥了作用。挪威的一个 研究小组对感染A型溶血性链球菌的11例咽炎确诊病例进行了抗生素治疗，并同时记录其 治疗前、治疗后l、2、3d的CRP水平、体温和咽痛减轻程度等指标。结果显示，与治疗前相比， 治疗后的1、2、3天CRP分别下降34. 1%、60· 1%和75. 3%，并且，CRP降低的程度与症状的减 轻和治疗后的天数明显相关(P<0. 01)。3.与心血管疾病的关系低水平的CRP (0. 1 10mg/L)与心血管疾病的发生有 着密切的关系，是心血管炎症病变的生物标志物。这个水平的C反应蛋白又被称为较高的 超敏C反应蛋白(hs-CRP)。个体的CRP基础水平和未来心血管疾病的发病关系密切。CRP 可能是比低密度脂蛋白胆固醇更有效的独立的心血管疾病预测指标，可以增加血脂检查、
5代谢综合症和Framingham危险评分的预后价值。4.病情的监测CRP炎性疾病发作6h含量即迅速升高，持续时间与病程相当，一 旦疾病恢复，CRP含量迅速下降，对临床有一个先驱的预报作用。若CRP持续升高或再度回 升，提示必须予以重视。5.新生儿疾病的早期诊断和监测有研究显示hs-CRP在早期新生儿，尤其有异 常分娩史者进行常规检测，并观察动态变化，对新生儿疾病的早期诊断、判定疗效有重要意 义。早产儿24h、72h的hsCRP均值有显著性差异，足月儿也有类似变化，可能提示新生儿 72h的免疫功能与24h比较可能有了显著变化，尤其在产生IL-6等因子方面。早产儿与足 月儿的CRP升高与感染明显相关。故认为新生儿出生3d内测CRP仍有非常重要的意义。6.其他疾病血液系统恶性淋巴瘤(何杰金氏病得多)、白血病等；胶原病、过敏 性及自身免疫性疾病的活动期(风湿热、SLE、类风湿等)、传染病、败血病及其他恶性肿瘤。
有益效果
本发明提供一种CRP定量的检测试纸，该检测试纸的特征是沿样品层析方向由下端至 上端分别为质控线和定量线。检测时，将待测样品滴加到检测卡的加样孔中，若质控线不显 色为无效，若质控线和定量线均出现红色，通过定量检测装置，利用基于反射光度计原理的 光学生物传感器和预置的标准曲线直接判读CRP的含量。现有技术中的CRP定量检测试纸 是通过胶体金免疫斑点法来实现的，该方法操作步骤相对繁琐，试剂盒还需配套多种试剂， 检测效率不高。本发明的检测试纸的检测方法属于免疫层析干法，检测时无需其他试剂，只 需直接将待测样品按固定的倍数稀释后取0. 05mL滴入加样孔，十分钟后即可出结果，操作 过程简单快捷，相比斑点法检测试纸其检测效率明显提高。该检测试纸可供医院和个人进 行定性、定量测定，其检测范围为5-200mg/mL，在实际样品检测时，做出的曲线线性良好，R2 值可达0.99以上。定量检测装置读出值和实际样品的真实值之间误差均在0.5%以内，稳 定性和特异性均良好，有效期可达一年以上。 本发明与现有技术文献CN101320041的区别在于该文献中用的是胶体金免疫渗 滤法，本发明用的是胶体金免疫层析法。目前尚未有胶体金免疫层析法定量检测CRP的方 法。具体而言，该文献检测方法的配套试剂盒由CRP金标液冻干品、反应板、样品稀释液、封 闭液和塑料滴管等组成，组分较多，造成检测操作繁琐。而本发明配套的试剂盒只需要CRP 检测卡、配套样品稀释液和塑料滴管，没有其他复杂组分，这样，检测时要节省几个步骤，所 以更加简单快捷。由于该文献的方法中含有金标液冻干品，须在检测前室温平衡30分钟， 耗费了等候检测的时间，使检测报告的及时性相对较差，本发明的检测试纸没有该缺陷。此 外，更为关键的是，该试剂盒的检测范围有限，在检测高浓度CRP样品中容易出现HOOK效 应，必须将待测样品进行佥适的稀释，如其所公开的，稀释40 - 480倍，但是，往往在初次检 测时，无法知道究竟该稀释多少倍，即在样品的初始浓度无法知道的情况下，容易产生高浓 度样品稀释倍数不够的情况，于是，检测结果可能因为HOOK效应而偏低。这样的缺陷使该 方法在定量检测中的可靠性降低，而本发明的检测试纸可适用于高浓度的样品而无需预先 确定稀释倍数，检测样品直接按固定比例稀释后，检测范围更宽。本检测试纸适用于配套的 定量检测装置，轻巧便携、灵敏度高、稳定性好且可输出检测结果，使该项检测操作简单快 捷、结果准确可靠、易于记录保存。
在本说明书中，除非有其他说明，各个优选技术方案和更优选技术方案的技术特 征可以相互组合形成新的技术方案。为了简要目的，申请人在说明书中省略了这些组合的 具体描述，然而，所有这些技术特征组合后的技术方案均应当被认为以明确的方式书面记 载于本说明书中。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如胶体金检测试 剂操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。本发明所述的“定量检测装置”为利用反射分 光光度计原理在胶体金显色的相应光谱上对光强度进行记录的装置，优选地，该装置还可 以配备计算程序对检测值(T)和对照值(C)的比值进行自动计算和记录，并且按照输入或 设定的标准曲线，对检测值所对应的CRP浓度进行直接判读。
实施例1
胶体金-CRP抗体复合物的制备
将鼠抗CRP单克隆抗体标记于制备好的20nm胶体金颗粒表面，低温离心，用硼酸缓冲 液重悬至原体积，再次离心浓缩至原体积的1/10，4°C保存。 实施例2
人C-反应蛋白(CRP)免疫层析检测卡的制备
(1)样品垫的制备选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，将其放入样品垫处理液(PBS， 含BSA，蔗糖，PVP，吐温)中浸泡，37 °C烘干备用。(2)结合垫的制备选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料，将上述制备的胶体 金-CRP抗体复合物重新分散于胶体金稀释液(Tris缓冲溶液，含蔗糖，BSA, PEG20000，吐 温)中，并喷于结合垫上，37°C烘干。(3)硝酸纤维素膜(NC膜)的点样用点膜仪在NC膜的不同位置喷点相应的抗体， 自下端至上端依次为质控线、定量线，37 °C烘干。(4)组装将吸水纸、NC膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的底板上，并切成 4cm宽的试纸条，装配成品检测卡。 实施例3
人CRP血清的定量检测
(1)将CRP抗原标准品用正常人血清作为稀释液配置系列浓度标准品0mg/mL，5mg/ mL，10mg/mL，20mg/mL，30mg/mL，50mg/mL，80mg/mL，100mg/mL，120mg/mL，160mg/mL，200mg/ mL0
7
(2)将如上各浓度的标准品按固定比例稀释，取0. 05mL滴加到检测卡的加样孔 中，IOmin后通过定量检测装置读出定量线与质控线信号强度的比值，即T/C值(每个样品 分别用3个检测卡测定3次，取平均值)，绘制相应的标准曲线。(3)利用上述标准曲线检测临床样品，将绘制的标准曲线y=ax+b中的a，b值输入 定量检测装置即可在测定实际样品时直接得出实际样品中CRP的含量。
实施例4
临床CRP样品的定量检测
(1)定量标准曲线的准备取若干个浓度的含CRP人血清作为标准抗原，并保证各浓度 在监测范围内有梯度的均勻分布。用上述CRP金标检测卡分别检测各个浓度的血清抗原， 用配套定量检测装置分别检测每个浓度的检测卡的T/C值，各检测三次。将检测的三组T/ C值分别取平均值，以所述血清样品的浓度对T/C平均值做图，得到一个曲线。结果显示，利 用本发明的检测卡所制备的标准曲线线性良好，在监测范围内没有出现HOOK效应。R2达到 0. 99以上。(2)利用标准曲线对临床CRP血清样品进行定量检测用上述检测卡检测标准抗 原，用定量检测装置读出T/C值。将所得结果绘制出标准曲线，得到相应的a，b值。将a， b值输入到定量检测装置中。取150份含CRP人血清临床抗原样品并使其浓度在5-200mg/ mL范围之内。用定量检测装置分别检测各个浓度的样品，记录定量检测装置给出的CRP浓 度数值。将定量检测装置得到的CRP浓度值跟标准曲线的浓度值进行比对，结果显示两组 数值相互一致。用SPSS13.0对两组数值进行相关性分析，结果为两组数值无明显差异。对 两组浓度数值进行误差分析，获得了实测浓度和实际浓度的误差均在0. 5%以内的结果。(3)检测卡稳定性测试将制备好的检测卡放在37°C环境中进行加速试验。7天 后取出检测卡，并用其检测实际样品中CRP的浓度。对实测浓度和实际样品浓度数值进行 误差分析，得到CV值在5%以内的结果。
权利要求
一种人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测试纸，该检测试纸包括依次在带有粘合剂的底板上相互搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述的结合垫上涂有胶体金标记的CRP抗体复合物，所述的硝酸纤维素膜上结合有定量线和质控线，所述的定量线和质控线是用CRP抗体包被的；检测时，将待测样品与所述检测试纸的下端接触并沿试纸层析，若质控线不显色为无效，若只有质控线显色则表示CRP浓度小于最低检测浓度，若质控线和定量线均出现红色，则通过一种定量检测装置判读CRP的含量；其特征在于，沿样品层析方向由该检测试纸的下端至上端分别为质控线和定量线。
2.根据权利要求1所述的定量检测试纸，其特征在于，所述的胶体金标记的CRP抗体复 合物为标记胶体金颗粒的鼠抗人CRP单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的定量检测试纸，其特征在于，所述的包被抗体为CRP抗体。
4.一种人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测试剂盒，由包含权利要求1所述的定 量检测试纸的检测卡、样品稀释液和塑料滴管组成。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测卡由权利要求1所述的定量 检测试纸和硬质塑料卡组成。
6.一种人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测卡的制备方法，依次包括以下步骤(1)将鼠抗人CRP单克隆抗体标记于胶体金颗粒表面，低温离心，用硼酸缓冲液重悬， 离心浓缩，获得胶体金-CRP抗体复合物，冷藏保存；(2)选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，将其放入含BSA、蔗糖、PVP和吐温的PBS样品 垫处理液中浸泡，烘干备用；(3)选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料，将上述的胶体金-CRP抗体复合物重新分散于 含蔗糖、BSA、PEG2000和吐温的Tris缓冲稀释液中，并喷于结合垫上烘干；(4)硝酸纤维素膜的点样用点膜仪在硝酸纤维素膜的不同位置喷点抗体，自下端至上 端依次为质控线、定量线，烘干；(5)组装将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的底板上，切 成试纸条，与硬质塑料卡一起装配成检测卡。
7.—种人C-反应蛋白胶体金免疫层析定量检测方法，依次包括如下步骤(1)用权利要求1所述的检测试纸检测系列浓度的标准抗原，利用定量检测装置读出 检测值和质控值之间的比值；(2)将所述的比值对所述的标准抗原浓度绘制标准曲线，将标准曲线输入到定量检测 装置中；(3)用权利要求1所述的检测试纸检测含CRP的待测样品，并利用定量检测装置中的标 准曲线获得所述待测样品的CRP浓度值。
8.—种人C-反应蛋白胶体金免疫层析定量检测的专用装置，包括打印机、显示屏、键 盘、固定于仪器底板上的电路板和光学部件。
9.权利要求1所述的人C-反应蛋白胶体金免疫层析法定量检测试纸在检测人血清中 C-反应蛋白中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种人C-反应蛋白(CRP)胶体金免疫层析法定量检测试纸，包括依次在带有粘合剂的底板上相互搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述的结合垫上涂有胶体金标记的CRP抗体复合物，所述的硝酸纤维素膜上结合有检测线和质控线，所述的检测线和质控线为抗体包被线；检测时，将待测样品与所述检测试纸的下端接触并沿试纸层析，若质控线和定量线不显色为无效，若只有质控线显色则表示CRP浓度小于最低检测浓度，若质控线和定量线均出现红色，则通过一种定量检测装置判读CRP的含量；其特征在于，沿样品层析方向由该检测试纸的下端至上端分别为质控线和定量线。
文档编号G01N33/577GK101887063SQ20101023607
公开日2010年11月17日 申请日期2010年7月26日 优先权日2010年7月26日
发明者沈鹤柏, 邢国杰 申请人:沈鹤柏