小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法

专利名称：小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法
技术领域：
本专利属于生物制药领域，具体涉及小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法及所得产苦马豆素菌株。
背景技术：
苦马豆素属多羟基吲哚里西啶类生物碱，是一种极强的a -甘露糖苷酶竞争性抑制剂，导致糖蛋白合成异常及部分合成的低聚糖在 溶酶体内聚积，引起细胞空泡变性，造成器官组织损害和功能障碍而中毒。但苦马豆素有增强机体免疫功能、抗病毒、抗癌抗肿瘤、抗菌等药理作用。值得一提的是，苦马豆素的抗肿瘤活性已经是近年来肿瘤后备药物筛选的热点。然而制约国内苦马豆素抗肿瘤药物研发进程的主要问题是苦马豆素来源十分困难，远远不能满足人们研究的需要。内生菌是指在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显病害症状的微生物。内生菌与寄主之间为互利共生关系，一方面内生菌为植物生长提供养料，促进植物生长，另一方面使得宿主植物对环境表现适应性，对环境胁迫表现出一定的抗性(如抗干旱、抗病虫害等)，有的还对食草动物表现出毒性，以维持其生存的需要。目前苦马豆素的来源有三种途径，第一种是从豆科黄芪属、棘豆属植物和苦马豆属植物，以及旋花科番薯属、锦葵科黄花稔属植物中提取。由于植物本身含苦马豆素的量很低，提取率低，产量有限，难以满足需求；第二种是通过人工合成途径得到，合成产物存在同分异构和手性结构现象，使得分离很困难，产率低，并不适宜大规模的工业化生产；第三种方法是从真菌菌丝体或发酵液中提取即生物合成。在目前获取苦马豆素的三种途径中，人工合成途径是人们研究的重点。自美国化学家Yasuda(1984)、Bennett (1989)等先后报道人工合成苦马豆素以来，人们采用了不同的方法合成苦马豆素，可分为以下四种①MOOtOO(2001)的合成方法，关键步骤是使用氨水使二乙醒酮(keto-bisaldehyde)的氨基化降低了 3倍，以保证目标物质只有一种对映异构体。该法以2，3，5，6_ 二-0-甘露呋喃糖(2，3 :5，6-di-0-mannofuranose)为起始物，共需13步，产率为15%。②Trost (1999)和Katsuki (2000)报道的不对称合成法，以二元醇为起始物，分别需要17步和11步，产率为13%和10%。③Pearson (2002)报道的改进后的方法。以异抗坏血酸(D-isoascorbic acid)为起点，共需10步，产率为12 %。④Blechert (2002), Carretero (2000), Pyne (2002)等报道的以卩引哚里西唳顺二轻基亮氨酸(syn-dihydroxylation)衍生物开始，分别需要15步，18步和16步，产率分别为38%(以内消旋二元醇开始计算)，6. 5%和4.5%。中国科学院院士周维善等(1993)人工合成苦马豆素也获成功，但产率很低。从植物(主要是疯草)中分离是目前提取苦马豆素所常用的方法，但这种方法有很大的局限性，对草原植被造成破坏，且疯草中苦马豆素含量较低，不能作为大规模提取苦马豆素的方法。前两种方法(从植物中提取和化学合成)，由于产量低，不能满足人们对苦马豆素抗肿瘤活性研究及其产品开发的需要。因此，探索通过产量高、提取成本低且对环境没有危害的微生物发酵途径获取苦马豆素，就成为目前人们关注的热点。这就是第三种方法从真菌菌丝体或发酵液中提取即生物合成。关于苦马豆素的生物合成，目前国内已经申请的专利有6项即“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”(02114591. I)、“绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺”(200610043120. 5)、“白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺”(200710199249. X)、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌及其制备方法和应用”(200910021082. 7)、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1和应用”(200910021858. 5)、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2及其应用”(200910021861. 7)，其存在的不足和缺陷是①“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”是由杨凌大农生物技术有限公司申请，中国专利公开号CN1396263，
公开日2003年2月12日，发明创造的名称为“生物发酵提纯苦马豆素的工艺”，其所采用的微生物菌株是自行从自然界豆科植物中分离、筛选的可产生苦马豆素的豆类丝核菌7-3菌株(代号)。其存在的不足和缺陷是，在专利中没有公开豆类丝核菌7-3菌株的具体获得方法和途径，也没有公开该豆类丝核菌7-3菌株的具体生物学特性、标准、以及品质鉴定方法。这样使得同领域的普通技术人员无法按说明书的内容重复实现。②“绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺”是由西北农林科技大学申请，专利申请号 200610043120. 5，所提供的菌种是从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)。该专利保护的主要内容是苦马豆素的提取技术工艺,而不涉及绿僵菌本身的分离方法。绿僵菌在自然界中分布比较广泛，目前可以从多种植物，包括土壤中分离得到，仅中国农业科学院微生物菌种保存中心保存的标准绿僵菌菌株就有几十种之多，具体是哪一种专利中不清楚。③“白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺”是由杨凌天力生物技术有限公司申请，专利申请号200710199249. X，所提供的菌种是从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准白僵菌(Beauveria bassiana Vuill)，编号为ACCC30112，也可以是其它渠道获得的白僵菌。该专利保护的主要内容也是苦马豆素的提取技术工艺，而不涉及白僵菌本身的分离方法。白僵菌在自然界中分布比较广泛，目前可以从多种植物，包括土壤中分离得到，仅中国农业科学院微生物菌种保存中心保存的标准绿僵菌菌株也有几十种。④“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌及其制备方法和应用”、“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL5-AS1和应用”和“一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL6-AS2及其应用”3个专利共同的不足是没有公开菌株的种类，且所公开的编号菌株苦马豆素产量偏低。

发明内容
本专利具体涉及小花棘豆中产苦马豆素的内生真菌的分离方法及所得产苦马豆素菌株层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。下面对本发明进行详细说明。I)内生真菌分离用去离子水洗去小花棘豆(采自内蒙古阿拉善盟)表面的尘土，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、花分离，然后将叶、茎、花分别用纱布包扎，进行表面消毒，表面消毒的程序为首先用75%的乙醇浸泡30s，再用有效氯含量为I %的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用灭菌的去离子水冲洗2次，每次lmin，将该去离子水接种于新制的PDA琼脂培养基表面，观察3d，看该培养基表面是否有真菌生长，以此来检验表面消毒的效果；用灭菌滤纸吸去经表面消毒的植物组织上的水分，然后用灭菌的剪刀将叶、茎、花等分别剪成3mm大小的组织块，然后将各组织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18°C培养；待组织块周围长出适当大小的菌落时，挑取边缘菌丝接种于PDA琼脂培养基表面，置培养箱中18°C培养；若在PDA培养基上生长的菌落仍未纯化时，将其再次接种于新制的PDA培养基表面，重复此操作过程，直至得到纯化的菌株。将分离得到的6株内生真菌编号，分别接种于PDA试管斜面，于4°C中保存，24h后转入-20°C长期保存。2)薄层色谱法定性筛选产苦马豆素内生真菌将分离得到的内生真菌菌株接种于PDA培养基上，采用I号培养液配方置20°C 25°C通气发酵培养10 14天，收集菌丝体，干燥保存备用。内生真菌菌丝体中苦马豆素定 性检测将干燥的内生真菌菌丝用研钵研磨成粉末，用滤纸包裹，放入索氏抽提器中，用乙醇75°C回流提取4小时，重复提取3次，合并乙醇提取液；乙醇提取液分别浓缩挥干，用去离子水将其溶解，加入5cm长的DlOl大孔树脂柱。先用去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，并将其浓缩挥干。然后用甲醇将其溶解，制成待检液；内生真菌发酵液中苦马豆素定性检测回收并浓缩发酵液，用去离子水将其溶解，余下步骤同菌丝体苦马豆素定性检测。用毛细管将苦马豆素标准品、内生真菌菌丝待检液和发酵待检液分别点样于GF254硅胶薄层板上，用￥_: Vw V水=70 26 2 2展开剂上行法展开。待展开剂到达薄层板前沿时，将其取出挥干溶剂，在薄层板表面喷洒H202置110°C加热lOmin，再将醋酐喷洒于娃胶板表面，置110°C加热IOmin,最后喷洒Ehrlich’s试剂,置110°C加热IOmin,然后观察待检样品是否具有与苦马豆素标准品的颜色和Rf值相同的斑点。初步判断发酵液和菌丝体中是否含有苦马豆素。XJ-H-I薄层色谱结果见表I。3)气相色谱法定量测量苦马豆素含量气相色谱仪日本岛津公司生产的GC-14C气相色谱仪,威玛龙色谱工作站。色谱条件SE30石英毛细管柱(30mX0. 25mm，0. 33iim)，柱温280°C,进样口温度300°C，氢火焰离子化检测器(FID)温度280°C，载气为氮气，流速为2mL/min，进样量I y L，分流比30 I。标准曲线绘制称取一定量的苦马豆素标准品用吡啶配制成0. 0016 5. 102g/L系列质量浓度的标准品溶液，量取100 u L各标准品溶液，分别加入20 i! L lmg/mL的内标(甲基化-a -D-甘露糖苷)溶液，混匀，最后加入40 ii L硅烷化(BSTFA+TMCS)试剂，置干燥器中室温进行硅烷化反应30min，进行气相色谱测定。以苦马豆素标准样品的峰面积和内标峰面积之比为横坐标X、以苦马豆素的质量浓度(mg/mL)为纵坐标y，绘制标准曲线，得回归方程y = 2E-05x+0. 0054，(R2 = 0. 9977)，表示线性关系良好(图I)。苦马豆素标准品气相色谱峰保留时间为4. 83min(图2)。苦马豆素的质量浓度在0. 013 I. 563g/L范围内呈良好的线性关系。内生真菌发酵液中苦马豆素含量测定回收薄层色谱技术初步筛选出的产生苦马豆素的内生真菌(代号为XJ-H-1)的发酵待检液离心，除去不溶物后挥干，用吡啶溶解，分别依次加入内标溶液和硅烷化试剂，置干燥器中室温进行硅烷化反应30min，然后I y L进样，进行气相色谱分析。内生真菌菌丝体中苦马豆素含量测定将经薄层色谱技术初步筛选出的产生苦马豆素的XJ-H-I内生真菌菌丝体待检液离心，除去不溶物后挥干，余下步骤同上。样品溶液中苦马豆素峰面积与内标峰峰面积的比值代入标准曲线方程，计算出样品溶液中苦马豆素的含量。XJ-H-I发酵液在该保留时间有色谱峰出现，出峰时间4. 86min，在说明该菌可产生苦马豆素(图3)。将其峰面积值分别代入回归方程计算得出苦马豆素产量，XJ-H-I菌株发酵液为16. 7338mg/L。XJ-H-I菌丝体未检测出与标准品相近峰，提示菌丝体中没有苦马豆素或含量极低。4)产苦马豆素内生真菌的鉴定形态学鉴定将菌种接种于PDA培养基,待菌落长至合适大小，肉眼观察菌落、菌丝、产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等特征。在PDA培养基采用插片法提取自然生长态菌丝，中性树胶封片，置400倍显微镜下观察菌丝和孢子形态，并拍照记录。根据菌落、菌丝和孢子形态等特性参考《真菌鉴定手册》进行初步分类鉴定。XJ-H-I菌落菌 丝形态学鉴定见图4。分子生物学鉴定在核糖体rDNA基因中，16SrDNA和28SrDNA基因间隔序列称为ITS序列(内部转录间隔区)，具有中度保守性，它的长度和序列变化较大，将其扩增物进行序列分析，可用于对细菌、真菌、植物等不同生物型、种属分类鉴定，是目前真菌分子系统学研究的理想序列。因此，提取内生真菌基因组DNA，采用ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )和ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )扩增ITS序列，进行ITS测定和比对，鉴定内生真菌种属。①内生真菌总DNA提取采用真菌DNA提取试剂盒，按照说明提取真菌基因组DNA。②PCR扩增条件95°C预变性3min，94°C变性30S，55°C退火30S，72°C延伸45S，35个循环；72°C保持10min，12°C保温。③PCR产物回收用胶回收试剂盒进行目的片段的回收纯化。④载体连接及转化按照PEASY-T3载体连接试剂盒，将PCR产物片段连接在pEASY_T3载体上，导入Trarnsl-Tl型感受态细胞。将转化后的感受态细胞涂布于含有Amp的LB培养基平板上，置37°C培养12 16h，挑取单个菌落进行菌液PCR，PCR反应体系和条件同上。⑤目的基因测序将菌液PCR结果为阳性的菌液送交测序公司测序。⑥目的序列比对及构建真菌系统发育树将测序公司发回的序列人工剪切后于NCBI上进行BLAST，结合形态学鉴定结果选取同源性高的菌种，然后采用Mega4. 0软件N-J法进行聚类分析，自展次数1000次，构建内生真菌系统发育树进行种属归类。采用ITSl和ITS4通用引物扩增出的目的片段长度为500_750bp，包括部分的18SrDNA、28SrDNA序列和全部的ITSl、5. 8SrDNA和ITS4序列。扩增出XJ-H-1的目的片段为558bp(图5)。在NCBI上进行Blast比对，结果显示XJ-H-I为层出镰刀菌(Fusariumproliferatum),同源性高达99%。从XJ-H-1系统发育树(图6)可以看出，XJ-H-1与Fusarium proliferatum亲缘关系较近，自检支持率高达90 而与其他几属真菌的关系较远。结合《真菌鉴定手册》的形态学描述，提示XJ-H-I为层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)。XJ-H-1的系统进化树,见图6。


图I为薄层色谱定性鉴定图；图2为苦马豆素浓度-峰面积标准曲线及苦马豆素标准品气相色谱图；图3为XJ-J-I发酵液在苦马豆素标准品出峰保留时段(4.83±0.05min)出峰图4为XJ-H-I菌落和显微形态图；图5为XJ-H-I的5. 8S rDNA-ITS扩增片段琼脂糖凝胶电泳图；图6为用NJ法构建出小花棘豆中分离出的产苦马豆素层出镰刀菌的5. 8SrDNA-ITS序列的系统发育树。5附图表说明I)薄层色谱定性鉴定从图I可以发现XJ-H-1与苦马豆素标准品斑点Rf和颜色一致，即可初步确定待检样品中含有苦马豆素，说明这种内生真菌可产生苦马豆素。2)气相色谱检测图2为苦马豆素浓度-峰面积标准曲线及苦马豆素标准品气相色谱图，回归方程y = 2E-05x+0. 0054，(R2 = 0. 9977)，苦马豆素标准品气相色谱峰保留时间4. 83min。XJ-J-I发酵液在苦马豆素标准品出峰保留时段(4. 83 土0. 05min)出峰
4.85min(图 3)。 3) XJ-H-I菌落及显微结构图XJ-H-I菌落和显微形态(图4A，4B):该菌在PDA培养基上的平均生长速度为7mm/d, 12天长满整个平板。培养基基质反面为深黄色，菌落呈白色，蓬松凸起，棉絮状，密集。菌丝显微图显示XJ-H-I菌丝分隔清楚且多，直径4-6 u m,其分生孢子梗较直，顶端呈腊肠形，未见明显孢子。发酵液中形态学发酵液呈淡黄色，略浑浊，液面未见明显气泡。白色菌体云雾状悬浮，后期菌体密实。4)图5为XJ-H-I的5. 8S rDNA-ITS扩增片段琼脂糖凝胶电泳图。5)小花棘豆中分离出的层出镰刀菌5.8SrDNA_ITS序列，下划线为引物序列TCCGTAGGTGAACCTGCGG.hCATATCATThCCCAGTTThCAhCTCCCAhhCCCCTGTCAhCAThCCAhTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGTACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA GCATATCAATAAGCGGAGGA6) XJ-H-I系统发育树构建图6是用NJ法构建出小花棘豆中分离出的产苦马豆素层出镰刀菌的
5.8SrDNA-ITS序列的系统发育树。从XJ-H-I系统发育树(图6)可以看出，XJ-H-I与层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)亲缘关系较近，自检支持率高达90%,而与其他几属真菌的关系较远。结合《真菌鉴定手册》的形态学描述，提示XJ-H-I为层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)。5本发明所得技术效果I)目前苦马豆素的来源主要是从疯草中提取，研究证实内生菌可以产生与寄主相同的次生代谢产物，这在自然界并非个别现象，疯草中活性物质-苦马豆素的产生是由其内的内生真菌所致。据不完全统计,我国西部草地疯草类植物约有45种，主要分布于内蒙古、甘肃、青海、新疆、西藏、陕西、宁夏、四川等西部省区，分布面积已超过1100万hm2，植物资源十分丰富。从我国众多的疯草品种中很可能分离到苦马豆素高产菌株，这将为苦马豆素的生物发酵提供丰富的菌种来源，本发明将推动植物内生真菌多样性的研究及其发酵产物的开发。 2)本发明从疯草(小花棘豆)中分离的产苦马豆素的内生真菌，其产生苦马豆素的量远高于其他来源的菌株，且菌株分离比较容易。即使在保存菌种的过程中发生菌株变异，也可以重新从自然界疯草中分离得到，保证了所得内生真菌产苦马豆素的持续性与稳定性。3)本专利的优点是从疯草(小花棘豆)中分离出一种产苦马豆素的内生真菌，可以产生与寄主相同的此生代谢产物，苦马豆素经检测，其生物发酵液中的苦马豆素产量较高，为16. 7338mg/L。与现有产苦马豆素菌种相比，其苦马豆素产量较高，将为今后苦马豆素工业化生产的奠定理论基础，其发展前景广阔。
具体实施例方式I)内生真菌分离用去离子水洗去小花棘豆(采自内蒙古阿拉善盟)表面的尘土，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、花分离，然后将叶、茎、花分别用纱布包扎，进行表面消毒，表面消毒的程序为首先用75%的乙醇浸泡30s，再用有效氯含量为I %的次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用灭菌的去离子水冲洗2次，每次lmin，将该去离子水接种于新制的PDA琼脂培养基表面，观察3d，看该培养基表面是否有真菌生长，以此来检验表面消毒的效果；用灭菌滤纸吸去经表面消毒的植物组织上的水分，然后用灭菌的剪刀将叶、茎、花等分别剪成3mm大小的组织块，然后将各组织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18°C培养；待组织块周围长出适当大小的菌落时，挑取边缘菌丝接种于PDA琼脂培养基表面，置培养箱中18°C培养；若在PDA培养基上生长的菌落仍未纯化时，将其再次接种于新制的PDA培养基表面，重复此操作过程，直至得到纯化的菌株。将分离得到的6株内生真菌编号，分别接种于PDA试管斜面，于4°C中保存，24h后转入-20°C长期保存。2)薄层色谱法定性筛选产苦马豆素内生真菌将分离得到的内生真菌菌株接种于PDA培养基上，采用I号培养液配方置20°C 25°C通气发酵培养10 14天，收集菌丝体，干燥保存备用。内生真菌菌丝体中苦马豆素定性检测将干燥的内生真菌菌丝用研钵研磨成粉末，用滤纸包裹，放入索氏抽提器中，用乙醇75°C回流提取4小时，重复提取3次，合并乙醇提取液；乙醇提取液分别浓缩挥干，用去离子水将其溶解，加入5cm长的DlOl大孔树脂柱。先用去离子水洗脱树脂柱，收集水洗脱液，并将其浓缩挥干。然后用甲醇将其溶解，制成待检液；内生真菌发酵液中苦马豆素定性检测回收并浓缩发酵液，用去离子水将其溶解，余下步骤同菌丝体苦马豆素定性检测。用毛细管将苦马豆素标准品、内生真菌菌丝待检液和发酵待检液分别点样于GF254硅胶薄层板上，用乂_: Vm V水=70 26 2 2展开剂上行法展开。待展开剂到达薄层板前沿时，将其取出挥干溶剂，在薄层板表面喷洒H202置110°C加热lOmin，再将醋酐喷洒于娃胶板表面，置110°C加热IOmin,最后喷洒Ehrlich’S试剂，置110°C加热IOmin,然后观察待检样品是否具有与苦马豆素标准品的颜色和Rf值相同的斑点。初步判断发酵液和菌丝体中是否含有苦马豆素。XJ-H-I薄层色谱结果见表I。3)气相色谱法定量测量苦马豆素含量气相色谱仪日本岛津公司生产的GC-14C气相色谱仪，威玛龙色谱工作站。色谱条件SE30石英毛细管柱(30mX0. 25mm，0. 33iim)，柱温280°C,进样口温度300°C，氢火焰离子化检测器(FID)温度280°C，载气为氮气，流速为2mL/min，进样量I y L，分流比30 I。标准曲线绘制称取一定量的苦马豆素标准品用吡啶配制成0. 0016 5. 102g/L系列质量浓度的标准品溶液，量取100 u L各标准品溶液，分别加入20 i! L lmg/mL的内标(甲基化-a -D-甘露糖苷)溶液，混匀，最后加入40 ii L硅烷化(BSTFA+TMCS)试剂，置干燥器中室温进行硅烷化反应30min，进行气相色谱测定。 以苦马豆素标准样品的峰面积和内标峰面积之比为横坐标X、以苦马豆素的质量浓度(mg/mL)为纵坐标y，绘制标准曲线，得回归方程y = 2E-05x+0. 0054，(R2 = 0. 9977)，表示线性关系良好(图I)。苦马豆素标准品气相色谱峰保留时间为4. 83min(图2)。苦马豆素的质量浓度在0. 013 I. 563g/L范围内呈良好的线性关系。内生真菌发酵液中苦马豆素含量测定回收薄层色谱技术初步筛选出的产生苦马豆素的内生真菌(代号为XJ-H-1)的发酵待检液离心，除去不溶物后挥干，用吡啶溶解，分别依次加入内标溶液和硅烷化试剂，置干燥器中室温进行硅烷化反应30min，然后I y L进样，进行气相色谱分析。内生真菌菌丝体中苦马豆素含量测定将经薄层色谱技术初步筛选出的产生苦马 豆素的XJ-H-I内生真菌菌丝体待检液离心，除去不溶物后挥干，余下步骤同上。样品溶液中苦马豆素峰面积与内标峰峰面积的比值代入标准曲线方程，计算出样品溶液中苦马豆素的含量。XJ-H-I发酵液在该保留时间有色谱峰出现，出峰时间4. 86min，在说明该菌可产生苦马豆素(图3)。将其峰面积值分别代入回归方程计算得出苦马豆素产量，XJ-H-I菌株发酵液为16. 7338mg/L。XJ-H-I菌丝体未检测出与标准品相近峰，提示菌丝体中没有苦马豆素或含量极低。4)产苦马豆素内生真菌的鉴定形态学鉴定将菌种接种于PDA培养基,待菌落长至合适大小，肉眼观察菌落、菌丝、产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等特征。在PDA培养基采用插片法提取自然生长态菌丝，中性树胶封片，置400倍显微镜下观察菌丝和孢子形态，并拍照记录。根据菌落、菌丝和孢子形态等特性参考《真菌鉴定手册》进行初步分类鉴定。XJ-H-I菌落菌丝形态学鉴定见图4。分子生物学鉴定在核糖体rDNA基因中，16SrDNA和28SrDNA基因间隔序列称为ITS序列(内部转录间隔区)，具有中度保守性，它的长度和序列变化较大，将其扩增物进行序列分析，可用于对细菌、真菌、植物等不同生物型、种属分类鉴定，是目前真菌分子系统学研究的理想序列。因此，提取内生真菌基因组DNA，采用ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )和ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )扩增ITS序列，进行ITS测定和比对，鉴定内生真菌种属。①内生真菌总DNA提取采用真菌DNA提取试剂盒，按照说明提取真菌基因组DNA。②PCR扩增条件95°C预变性31^11，941变性303，551退火30S，72°C延伸45S，35个循环；72°C保持10min，12°C保温。③PCR产物回收用胶回收试剂盒进行目的片段的回收纯化。④载体连接及转化按照PEASY-T3载体连接试剂盒，将PCR产物片段连接在pEASY_T3载体上，导入Transl-Tl型感受态细胞。将转化后的感受态细胞涂布于含有Amp的LB培养基平板上，置37°C培养12 16h，挑取单个菌落进行菌液PCR，PCR反应体系和条件同上。⑤目的基因测序将菌液PCR结果为阳性的菌液送交测序公司测序。⑥目的序列比对及构建真菌系统发育树将测序公司发回的序列人工剪切后于NCBI上进行BLAST，结合形态学鉴定结果选取同源性高的菌种，然后采用Mega4. O软件N-J法进行聚类分析，自展次数1000次，构建内生真菌系统发育树进行种属归类。 采用ITSl和ITS4通用引物扩增出的目的片段长度为500_750bp，包括部分的18SrDNA、28SrDNA序列和全部的ITSl、5. 8SrDNA和ITS4序列。扩增出XJ-H-1的目的片段为558bp(图5)。在NCBI上进行Blast比对，结果显示XJ-H-I为层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)，同源性高达99%。从XJ-H-1系统发育树(图6)可以看出，XJ-H-1与Fusarium proliferatum亲缘关系较近，自检支持率高达90 而与其他几属真菌的关系较远。结合《真菌鉴定手册》的形态学描述，提示XJ-H-I为层出镰刀菌(Fusariumproliferatum)。XJ-H-1的系统进化树,见图6。
权利要求
1.小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法，其特征在于，包括步骤 .1)小花棘豆中内生真菌的分离 将小花棘豆表面灭菌，灭菌程序先用75%乙醇漂洗30 60s，无菌水清洗3次，0. 1%升汞溶液漂洗2 5min，无菌水冲洗，取最后一次冲洗所得无菌水滴入PDA培养基平板，.25°C培养48h，观察培养基表面有无菌落生长，以此验证植物表面消毒是否彻底。将表面消毒彻底的样品剪成0. 5cmX0. 5cm组织块，植于PDA培养基，25°C培养3 5d，待组织创缘菌丝长出时，用接种针挑出菌丝并接入新的PDA培养基，纯化培养3 4次，得到纯化菌株，并予以编号。按照上述方法分离纯化得到的菌株，在弃除常见的青霉、黄曲霉、黑曲霉等杂菌后，分别接种于PDA试管斜面培养，于-20°C冰箱作长期保存， PDA固体培养基配方马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水IOOOmL ； . 2)内生真菌生物发酵 取上述分离纯化得到的菌株接种于PDA培养基平板，25°C培养至处于对数生长期时，采用打孔计量法分别接入I号液体培养液，25°C发酵培养14d。I号液体培养液配方蔗糖.26g，磷酸氢二钾3g，硝酸钠3g，硫酸镁0. 5g，氯化钾0. 5g，硫酸亚铁0. Olg，酵母浸膏3g，水IOOOmL ； .3)发酵液及菌丝体中苦马豆素定性、定量检测 定性检测采用薄层色谱法，收集发酵液，减压浓缩至膏状，酸碱处理，水饱和正丁醇萃取6 7次，收集正丁醇萃取液，减压浓缩后用95%无水乙醇溶解制成待检液备用，超声协助乙醇萃取菌丝体中此生代谢产物，收集萃取液，余下步骤同发酵液，制成待检液备用，采用薄层层析技术，用苦马豆素标准品作对照，待检液用毛细管点于自制硅胶GF254薄层板上，置于V氣仿V_: V水=70 26 2 2展开剂上行展开，展开结束后取出挥干，双氧水/醋酐乙醇/对二甲氨基苯甲醛“三步显色法”显色，观察待检样品在薄层板上的位置和斑点颜色，记录颜色并计算Rf值； 定量检测采用气相色谱法，用吡啶溶解苦马豆素标准品并做梯度稀释，加硅烷化试剂混合，室温下作用20min，取样进行气相色谱测定，色谱条件为柱温200°C，进样口温度.3000C，FID检测器温度280°C，载气为氮气，载气压力200kPa，流速为2mL/min，进样量2 y L，分流比60 I (AT. SE-54型毛细管色谱柱，30mX0. 25mmX0. 25 u m,中科院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心)。以苦马豆素对应峰面积为横坐标，苦马豆素浓度为纵坐标制作标准曲线，然后根据标准曲线方程，计算出样品中苦马豆素含量； .4)产苦马豆素内生真菌鉴定 形态学鉴定将菌种接种于PDA培养基，待菌落长至合适大小，观察菌落、菌丝、产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等特征，采用插片法提取PDA培养基中自然生长态菌丝，中性树胶封片，置400倍显微镜下观察菌丝和孢子形态，并拍照记录。根据菌落、菌丝和孢子形态等特征参考《真菌鉴定手册》进行初步分类鉴定； 分子生物学鉴定提取内生真菌基因组DNA，采用真菌鉴定通用引物ITSl(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3，)和 ITS4 (5，-TCCTCCGCTTAITGATATGC-3，)扩增核糖体rDNA基因中的ITS序列，将目的序列于NCBI上进行BLAST，结合形态学鉴定结果选取同源性高的菌种，然后采用Mega4. 0软件N-J法进行聚类分析，自展次数1000次，构建内生真菌系统发育树进行种属归类，结合上述两种方法鉴定内生真菌种属关系； 5)得出产苦 马豆素内生真菌通过上述方法鉴定出一株产苦马豆素内生真菌，该菌为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum),其发酵液中苦马豆素产量为16. 7338mg/L。
全文摘要
小花棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离方法。通过生物发酵法获得本菌的菌丝体和发酵液，经超声萃取，溶剂萃取后采用薄层色谱和气象色谱技术定量、定性检测苦马豆素。并通过形态学和分子生物学方法鉴定产苦马豆素内生真菌。结果显示，分离出的6株内生真菌中有一株内生真菌可产生苦马豆素，产量为16.7338mg/L。经鉴定，该菌为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。本发明与现有产苦马豆素菌种相比，其苦马豆素产量较高，生物发酵生产苦马豆素不影响草地生态环境，为解决苦马豆素来源问题，并提供菌种支持，从而为今后苦马豆素的工业化生产奠定理论基础，其发展前景广阔。
文档编号G01N30/02GK102732427SQ20101029590
公开日2012年10月17日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者刘媛, 刘彤, 刘生武, 卢围, 胡波, 苏东, 赵宝玉, 陈基萍, 陈燕 申请人:鄂尔多斯市普众生物技术有限公司