肺病的miRNA生物标志物的制作方法

专利名称：肺病的miRNA生物标志物的制作方法
肺病的m i RNA生物标志物本发明要求于2009年8月28日提交的美国临时申请No. 61/237，972的优先权，所述文件通过提述并入本文。本申请所述工作部分由联邦政府根据美国癌症研究所/NIH GrantNo. 1R43CA141786-01资助。因此，联邦政府对本发明可享有一定权利。
在美国，肺癌在所有癌症中具有最高的发生率和致死率(http://seer, cancer,gov/statistics/)。肺癌分为两个主要类型小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，前者感染20%的患者而后者感染80%的患者。NSCLC由三种主要亚型组成腺癌、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌，其中腺癌和鳞状细胞癌占大多数(Sekido等，Biochim BiophysActa，1378 :F21-59 ;Forgacs 等，Pathol Oncol Res, 7 :6-13 (2001))。据估计 2008 年美国发生215，000例肺癌新病例，肺癌患者死亡约162，000人(Jemal等，J Natl CancerInstaOO :1672-94(2008))。肺癌的高致死率一部分是由于超过75 %的肺癌患者在刚刚出现症状时即诊断为局部或远端转移，还有一部分是由于缺乏针对肺癌的高效治疗方法。尽管目前对于肺癌的治疗选择有限，但是已经显示，最早期得到诊断的患者的5年存活率(50 % )优于晚期诊断的患者(< 10 % )(参见，例如，http: //seer, cancer, gov/statistics Horner 等(编) SEER Cancer Statistics Review,1975-2006, NationalCancer Institute. Bethesda, MD)。因此，已经有更多研究致力于检测早期肺癌,使医疗干预可以提闻存活率。肺癌的风险因素包括年龄和通过吸烟(一手和二手)的烟草消耗。全部肺癌案例中约90%出现在吸烟者中。此外，男性和女性之间肺癌的发病率和致死率存在显著差异，表明两种性别之间存在遗传生物过程的可能性。肺癌中的最一贯报道的显著风险因素中都存在这些差异(Visbal 等，Ann Thorac Surg，78 :209-15 (2004))。已经进行了几项筛选研究，所述研究经设计用于检测早期肺癌。这些研究中很多使用两种主要的成像技术胸部X-射线和计算机断层扫描(CT)。胸部X-射线可以显示肺内块状物质(mass)，其可以通过活检而对肺癌进行确证和分类。成像技术的改进，最明显的是螺旋计算机断层扫描(螺旋CT)的发展，使临床医生可以检测未出现症状的个体中的较小肺部肿瘤。早期肺癌行动项目(ELCAP)，使用胸部X-射线和低剂量CT，设计用于筛选无症状高风险吸烟者，这显示CT大大改进了对较小的、潜在可治愈损伤的检测(Henschke等，Lancet, 354 :99-105 (1999))。然而，主要的缺点是假阳性率和高成本(平均600美元)，难以证明其可作为筛选范例(也参见Henschke等，N Engl J Med，255 :1763-71 (2006))。这些研究在科学界引发了激烈的讨论，讨论集中于研究的设计上，特别是研究设计缺乏随机性，和考虑到高成本和高假阳性率而得出的结论(Henschke等，1999 ;Gould等，N Engl J Med，356 :743-747 (2007))。吸烟者和曾经的吸烟者的螺旋CT扫描中25-60%表现出良性的异常(Swensen 等，Am J Respir Crit Care Med，165 :508-13 (2002))。无症状患者的成像筛选不能将良性与早期恶性损伤相区别。也有报道称重复暴露于低剂量CT扫描可使患者暴露于潜在的有害水平的辐射(Brenner等，Radiology, 231 :440-5 (2004)) 0目前，仍然需要用于肺病(包括癌症)的非侵入性检测，监测对疗法的响应，或者检测肺癌复发的临床相关标志物。同样明确的是，这种试验必须具备高度特异性和合理的灵敏度，并且以合理的成本容易使用。循环的生物标志物提供了一种成像的替换方案，其具有下述优势1)它们在最小侵入、易于收集的样品类型(血液或血液来源流体)中发现，2)它们可在受试者中随时间频繁监测以建立精确的基线，使其易于检测随时间的变化，3)它们能以合理的低成本提供，4)它们可以限制正在进行重复的昂贵并且可能有害的CT扫描的患者的数目，和/或5)不同于CT扫描，生物标志物可能区别无害的肺部损伤和更具侵略性的肺部损伤(参见，例如，Greenberg 和 Lee, Opin Pulm Med, 13 :249-55 (2007))。现有的生物标志物测定法包括几种血清蛋白标志物如CEA (Okada等，Ann ThoracSurg,78 :216-21 (2004)), CYFRA 21-1 (Schneider, Adv Clin Chem,42 1-41 (2006)),CRP(Siemes 等，J Clin Oncol，24 :5216-22 (2006))，CA-125 (Schneider，2006)和神经元特异性烯醇化酶和鳞状细胞癌抗原(Siemes等，2006)。低灵敏度和特异性，以及由于良性肺病产生的显著数量的假阳性结果限制了这些测定法的应用。 也已经评价了循环的核酸如DNA和mRNA作为肺癌的可能的诊断标志物的作用。这些研究基于这样的观察循环的核酸显示出可指示癌症的差异表达(参见，例如，Bremnes等，Lung Cancer, 49 1-12 (2005) ；Johnson 等，Cell, 120 :635-47 (2005) ；Yanaihara 等，Cancer Cell，9 :189-98 (2006) ；Chen 等，Cell Res, 18 :997-1006 (2008) ；Fabbri 等，Cancer J, 14 :1-6(2008) ；Garofalo 等，Oncogene, 27 :3845-55(2008) ；Mitchell 等，ProcNatl Acad Sci,105 :10513-8(2008) ；Schickel 等，Oncogene,27 :5959-74(2008) ；ffeiss等，Ann Oncol，19 :1053-9(2008);和 Yu 等，Cancer Cell，13 :48-57 (2008))。循环中游离DNA的来源还未完全了解，但是认为它们代表来自受损(凋亡、坏死)肿瘤细胞的稳定残余部分(Jahr 等,Cancer Res, 61 1659-65 (2001) ；Bianchi, Placenta, 25 Suppl A:S93-S101(2004))o我们在本文描述了通过测量血清或血浆中的miRNA而检测、诊断或监测肺病的方法。在一些实施方案中，本发明涉及通过检测血清或血浆中的miRNA而检测或监测肺病如小细胞肺癌或非小细胞肺癌。本发明的方法包括生物标志物的检测，所述生物标志物能用于诊断疾病和/或评价肺病的预后或侵略性。进一步地，所述方法可以用于表征肺病的进程。在某些实施方案中，本发明的方法可以用于确定患者中的肺部肿瘤或损伤是否为癌或良性。使用本发明的方法进行测试的患者也可以使用本领域其它已知方法进行测试。在本发明的某些实施方案中，可以通过测量患肺病的受试者血清或血浆中以上升或下降的水平存在的miRNA量而实现诊断或预后。在一些实例中，可以检测(例如，扩增并测量)一种血清或血浆miRNA以表征肺病，而在其它实施方案中，检测来自血清或血浆的两种或多种miRNA。一些实施方案包括检测miRNA对。在一些实例中，对中的一个miRNA在肺病或肺癌患者的血清或血浆中上升，而对中的另一个miRNA下降。在其它实例中，对中的两个miRNA均上升或下降。在某些实施方案中，也可以检测非miRNA生物标志物如蛋白标志物。本发明的一些实施方案涉及肺癌的诊断或预后，或者确定患者中的肺癌的类型。在一些实施方案中，所述患者先前进行了肺病的筛选。本申请中讨论了本发明的其它实施方案。本发明的其它目的、特性和优势由下述详细描述显而易见。关于本发明的一个方面讨论的任何实施方案也适用于本发明的其它方面，反之亦然。实施例部分的实施方案应理解为可应用于本发明所有方面的本发明的实施方案。然而，应理解的是，详细描述和特定的实施例，虽然指示了本发明的特定实施方案，仅通过阐述方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰由本申请对于本领域的技术人员显 而易见。附图
简述下述图形成本说明书的一部分，并且包括在本文中进一步说明本发明的某些方面。通过提述这些图中的一个或多个，结合本文所述的特定实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。图I是用于肺癌小鼠模型研究设计的示意概图。对一百一十五只A/J小鼠在时间(0)和第一次强饲后10周以所示剂量口服强饲苯并芘。十只对照小鼠在第0周/天接受不含致癌物的200 棉籽油的口服强饲。每个时间点处死的小鼠数量示于箭头下方。剩余的小鼠每两周取血一次，直至18周，之后每四周取血一次。在34周末期，处死所有剩余小鼠。图2A和图2B显示在发生肺部肿瘤的小鼠和对照小鼠中miR-183和miR-182(图2A)和miR-365和miR-141 (图2B)血浆miRNA表达的瞬时变化。图3显示线性判别分析(LDA)分类器的曲线下面积(AUC)数值的分布作为生物标志物数量的函数，如实施例5中所述。这个过程确定了用于分类器的生物标志物的最优数量。实心黑色圆形代表来自训练组的结果；空心三角形代表来自测试组的结果。垂直虚线是性能水平降低处。最大平均AUC为特征数=9处。图4显示实施例5的线性判别分析中训练和测试数据的性能估计。SENS，灵敏度；SPEC,特异性；NPV，阴性预测值；PPV，阳性预测值。使用六对不同的miRNA对miR-142_5p和 miR181d ;miR-142_3p 和 miR181d ;miR-142_3p 和 miR_422a ;miR-142_5p 和 miR_422a ；miR-92 和 miR-27b ;和 miR-24 和 miR_27a。图5显示人类前体miRNA(前-miRNA)序列(按照出现的顺序，分别为SEQID NO1-323),由 miRBase:: Sequences Database 的 13.0 版(http://microrna. sanger. ac. uk ；Griffiths-Jones 等，Nucleic Acids Research, 2008,36, Database Issue, D154-D158 ；Griffiths-Jones 等，Nucleic Acids Research,2006,34, Database Issue, D140-D144 ;Griffiths-Jones,Nucleic Acids Research, 2004, 32,Database Issue,D109-D111)提供。也提供了表1-5中成熟miRNA的名称。示例实施方案在某些方面，本发明的方法提供扩增并测量血清或血浆样本中miRNA量的测定法，从而表征肺病。为了帮助理解本发明，首先定义某些术语。其它定义在本申请全文中提供。如本文所使用的，术语“microRNA”(miRNA或miR)包括人miRNA、成熟单链miRNA、前体miRNA(前-miR)和它们的变体，所述miRNA可以天然存在。在一些实例中，术语“miRNA”还包括初级miRNA转录物和双链体miRNA。除非另外指出，否则在本文中使用时，特定miRNA的名称指前体miRNA的成熟miRNA。例如，miR-122a指源自前-miR-122的成熟 miRNA 序列。miRBase: : Sequences Database (http://microrna. sanger. ac. uk (2010 年4 月发布的版本 15) ;Griffiths_Jones 等，Nucleic Acids Research、2008、36、DatabaseIssue、D154-D158 ；Gr iff iths-Jones 等，Nucleic Acids Research、2006、34、DatabaseIssue、D140-D144 ；Griffiths-Jones> Nucleic Acids Research、2004、32、DatabaseIssue,D109-D111)中报道了特定miRNA的序列，包括人成熟和前体序列。对于某些miRNA，单个前体包含多于一个成熟miRNA序列。在其它实例中，多个前体miRNA包含相同的成熟序列。在一些实例中，已经根据新的科学一致性重新命名了成熟miRNA。例如，如本文所使用的，miR-213指来自前-miR-181a-l的成熟miRNA，也称作miR_181a*。已经重新命名的其它miRNA 包括 miR-189 (也称作 miR-24*)，其来自前-miR-24-l ；miR-368 (也称作 miR_376c)；和miR-422b (也称作miR-378*)。技术人员理解对于给定miRNA，特别是对于miRNA的成熟形式，关于精确核苷酸序列的科学一致性可以随时间改变。通过本申请的测定法检测的miRNA包括miRNA的天然存在的序列。术语“表征”在本文中使用以涵盖检测和预后，并且包括检测miRNA以做出诊断或预后确定或疾病预测。在一些实例中，表征将鉴定受试者是否有肺病如癌症，或者确定疾病状态。此外，根据本文方法检测miRNA包括测量miRNA的量,所述miRNA可以用于区分肺癌 患者和其它肺部疾病患者，或者确定有肺部肿瘤的患者是否患癌症。在其它实例中，“表征”包括检测miRNA以确定疾病状态如肺癌的阶段或侵略性，或者确定肺病的适当治疗方法。在权利要求和/或正文中与术语“包含”组合使用时，“一个”或“这个”可以表示“一个”，但是也可以与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意义一致。I.样本血清通常为凝结血液的流体、非细胞部分。血浆也是非细胞血液样本，但是不同于血清，血浆包含凝血因子。在一些实施方案中，血清或血浆样本获得自先前使用另一种诊断方法进行肺病筛选的人类患者。在多个实施方案中，血清或血浆样本获得自经测试对肿瘤或肺部损伤呈阳性的患者。在某些实施方案中，患者进行成像检测，例如，通过胸部X-射线或CT扫描。在其它实施方案中，所述方法涉及检测肺病成像结果为阳性的患者中的miRNA。在一些实例中，样本获得自有肺部肿瘤或损伤的患者。可以通过胸部X-射线或CT扫描，或者通过本领域已知的其它成像或检测方法检测肿瘤或损伤。其它实施方案包括测量来自先前或目前正进行肺病治疗的患者的样本中的miRNA。在其它实施方案中,所述样本来自怀疑患有肺癌或有发生肺癌的风险的患者。获得并用于所述测定法的血浆或血清的体积可以根据临床目的而变化。本领域的技术人员将可以识别现有用于获得和制备血清样本的很多方法。通常地，使用标准方法将血液引入收集管并使其凝结。然后由凝结血液的细胞部分分离血清。在一些方法中，向血液收集管中加入凝结激活剂如二氧化硅颗粒。在其它方法中，不对血液进行处理以加速凝结。血液收集管可由很多来源商业上得到，并且有多种形式(例如，BectonDickenson Vacutainer 管-SST 、玻璃血清管或塑料血清管)。在一些方法中，通过静脉穿刺收集血液并在抽血后三小时内处理以将溶血现象降至最低，并将miRNA由完整细胞到血液的释放降至最低。在一些方法中，在冰上保存血液直至使用。可以通过离心将血液分级以去除细胞成分。在一些实施方案中，制备血清的离心可以在至少500、1000、2000、3000、4000或5000X G的速度进行。在某些实施方案中，可以将血液温育至少10、20、30、40、50、60、90、120或150分钟以使其凝结。在其它实施方案中，血液温育至多3小时。在使用血浆时，分离细胞和非细胞成分之前不使血液凝结。可以在从血液的细胞部分分离之后冷冻血清或血浆，直至进一步试验。分析前，可以从血清或血浆提取RNA并使用本领域已知的方法纯化。已知很多方法用于分离总RNA，或者专门提取小RNA，包括miRNA。可以使用商业上可得到的试剂盒(例如 Perfect RNA Total RNA Isolation Kit,FivePrime-Three Prime,Inc. ；mir Vana 试剂盒，Ambion、Inc.)提取RNA。可替换地，可以改编用于提取哺乳动物胞内RNA或病毒RNA的RNA提取方法，按照发表的方法或者经过修改，用于从血浆或血清提取RNA。可以使用二氧化硅颗粒、玻璃珠或硅藻(diatom)从血浆或血清提取RNA，如美国公开No. 2008/0057502中所述的方法或其改编形式。II.肺病的miRNA标志物本发明的某些实施方案提供血清或血浆miRNA作为肺病的标志物。在一些实施方案中，使用肺病患者的血清和/或血浆中以上升水平存在的miRNA作为标志物。在其它实施方案中，使用水平下降的miRNA作为标志物。在一些实施方案中，使用来自血清或血浆的 多于一个miRNA作为标志物。当使用多于一个miRNA生物标志物时，miRNA可全部具有上升的水平，全部具有下降的水平，或者可以使用水平上升和下降的miRNA的混合物。术语“下降水平”或“上升水平”指患者血清或血浆样本中miRNA的量与未患有测试患者所患肺病的群体的血清或血衆中miRNA的量相比较。例如，肺癌患者血清中水平下降的miRNA在肺癌患者中存在的量低于未患肺癌供体(例如有良性肿瘤的患者或正常患者)的血清中的量。对于某些miRNA，患者血清或血浆样本中水平的上升表明肺病的存在或预后。其它miRNA以下降的水平存在于肺病患者中。肺病包括癌症和良性病症。肺癌指肺部的恶性肿瘤，并且可以分为小细胞或非小细胞肺癌。在一些实施方案中，非小细胞肺癌可以进一步表征为腺癌、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌。此外，可以根据X-射线或CT扫描结果、侵略性、病理学和非miRNA生物标志物的检测，以及本领域已知的其它方法将癌症分类。在某些方面，通过 !原理(T-原发肿瘤、N-局部淋巴结、M-远端转移)和/或O、IA、IB、IIA、IIB、IIIA、IIIB或IV期将肺癌分类(参见，例如，Lababede等，Chest、115 :233_235 (1999))。在一些实施方案中，本文所述方法可以用于以至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%灵敏度表征患者中的肺病。灵敏度的程度指示阳性表征为患有疾病的患病患者的百分比。在其它实施方案中，所述方法具有至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的特异性(例如，正确表征的非患病患者的百分比)。可以调整测定参数以同时优化灵敏度和特异性。在一些实例中，将miRNA标志物的水平与对照相比较以确定水平是否下降或上升。对照可以是外部对照，如来自已知没有肺病的受试者的血清或血浆样本中的miRNA。外部对照可以是来自正常(非患病)受试者或者患有良性肺病的患者的样本。在其它情况中，外部对照可以是来自非血清样本如组织样本的miRNA或已知量的合成RNA。外部对照可以是汇集的、平均或个体样本；可以与测量的miRNA相同或不同。内部对照是来自与测试样本相同的血浆或血清样本的标志物，如miRNA对照。参见，例如，美国公开No. US2009/0075258，其通过提述全文并入本文。表I列出了肺病患者血清中水平上升或下降的miRNA。可以根据本发明使用这些miRNA。一些miRNA可用于表征肺癌，包括区别癌症类型和/或区分癌症与良性肺病。此外，一些miRNA可以用于预测肺癌的侵略性或结果。

表I.肺癌患者血清中水平上升或下降的miRNA。水平为肺癌患者中miRNA与良性 肿瘤或损伤患者相比较的结果。
权利要求
1.用于表征有肺部肿瘤或损伤的患者中的肺癌的方法，所述方法包括如下步骤 a.测量血清样本中miRNA的水平，其中所述miRNA选自let_7b、let_7c、let_7d、let_7e、miR-10a、miR-10b、miR_130b、miR-132、miR_133b、miR-139、miR-143、miR-152、miR-155、miR-15b、miR-17-5p、miR-193、miR-194、miR-195、miR-196b、miR-199a*、miR-19b、miR-202、miR-204、miR-205、miR-206、miR_20b、miR-21、miR-210、miR-214、miR-221、miR_27a、miR_27b、miR-296、miR_29a、miR-301、miR-324_3p、miR-324_5p、miR-339、miR-346、miR-365、miR-378、miR-422a、miR-432、miR-485-3p、miR-496、miR-497、miR-505、miR-518b、miR-525、miR-566、miR-605、miR-638、miR-660 和 miR-93 ;和 b.确定样本中miRNA下降或上升的水平，从而表征所述患者中的肺癌。
2.根据权利要求I的方法，其中所述肺癌是小细胞或非小细胞肺癌。
3.根据权利要求I的方法，其中所述患者先前经过肺病的筛选。
4.根据权利要求I的方法，其中所述患者怀疑患有肺癌或者有发生肺癌的风险。
5.根据权利要求3的方法，其中所述筛选通过CT扫描或胸部X-射线进行。
6.根据权利要求I的方法，其进一步包括扩增所述miRNA。
7.根据权利要求6的方法，其中所述扩增通过定量反转录酶聚合酶链式反应进行。
8.根据权利要求I的方法，其进一步包括扩增、测量并确定第二miRNA下降或上升的水平。
9.用于表征患者中的肺病的方法，所述方法包括如下步骤 a.测量血清样本中第一miRNA和第二 miRNA的水平,其中第一 miRNA选自let_7a、let_7b、let_7d、let_7f、let_7g、let_7i、miR-101、miR_106a、miR-106b> miR_125a、miR-126、miR-126*、miR_130b、miR-132、miR_133b、miR-140、miR-142_3p、miR-142_5p、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-148b、miR-150、miR-151、miR-15a、miR-15b、miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-185、miR-186、miR-190、miR-191、miR-193a、miR-199a*、miR-202、miR-210、miR-214、miR-222、miR_23a、miR-24、miR_26a、miR_26b、miR_27a、miR_27b、miR_29b、miR-301、miR-30a_5p、miR_30b、miR_30c、miR_30d、miR-30e_5p、miR-320、miR-324_3p、miR-326、miR-335、miR-340、miR-342、miR-345、miR-346、miR_34a、miR-374、miR-375、miR-378、miR_422a、miR_422b、miR-425、miR-486、miR-496、miR_518b、miR-660、miR-7、miR-92、miR-93、miR-98、miR-99a 和 miR_99b ;和。
b.检测所述样本中第一和第二miRNA下降或上升的水平，从而表征患者中的肺病。
10.根据权利要求9的方法，其中所述第一miRNA选自let_7g、miR_106b、miR-126、miR-126*、miR-132、miR-140、miR-142_3p、miR_146a、miR-150、miR_15a、miR_15b、miR-18la、miR-18Ib、miR_18Id、miR-214、miR-24、miR-30a_5p、miR-320、miR-342、miR-345、miR-374、miR-422a、miR-422b、miR-486 和 miR-92。
11.根据权利要求9的方法,其中所述第一和第二miRNA是选自表3的对。
12.根据权利要求9的方法，其中所述肺病是癌症。
13.根据权利要求9的方法，其中所述患者有肺部肿瘤或损伤。
14.根据权利要求9的方法，其中所述患者先前经过肺病的筛选。
15.根据权利要求12的方法，其中所述癌症是小细胞或非小细胞肺癌。
16.根据权利要求9的方法，其进一步包括扩增第一miRNA和第二 miRNA。
17.根据权利要求16的方法，其中所述扩增通过定量反转录酶聚合酶链式反应进行。
18.根据权利要求9的方法，其中所述患者为男性。
19.根据权利要求9的方法，其中所述患者为女性。
全文摘要
本发明描述可用作表征患者肺部疾病的血清或血浆生物标志物的miRNA。这些miRNA生物标志物可以单独使用或者与其它用于疾病如肺癌的诊断、预后或监测的其它标志物组合使用。在一个实施方案中，用于表征有肺部肿瘤或损伤的患者中的肺癌的方法，所述方法包括如下步骤测量血清样本中miRNA的水平，和确定样本中miRNA下降或上升的水平，从而表征所述患者中的肺癌。
文档编号G01N33/48GK102725632SQ201080048520
公开日2012年10月10日 申请日期2010年8月27日 优先权日2009年8月28日
发明者A.T.阿达伊, A.乔达里, D.布朗, E.马姆博, S.沃尔兹, T.桑福德 申请人:奥斯瑞根公司