专利名称：筛选促进皮肤屏障功能恢复的物质的方法
技术领域：
本发明涉及以胱天蛋白酶(caspase)-14对鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的分解为指标，筛选促进皮肤屏障功能恢复的物质的方法。
背景技术：
角质细胞由于终末分化，对有害环境形成被称为“角质层”的保护屏障、角质层细胞间隙的脂类在该保护屏障中发挥重要的作用。角质层细胞间隙的脂类，在表皮角质细胞中与分化同时生物合成，积累在角质小体中。角质 层细胞间隙的脂类的主要成分神经鞘胺醇，是通过葡糖脑苷脂酶切断由角质小体的胞吐作用释放到角质层细胞间隙中的葡糖神经鞘胺醇的糖链而生成的。此外，已知在其他途径中，由鞘磷脂酶将鞘髓磷脂分解为神经鞘胺醇。作为鞘脂类活化蛋白质的鞘脂激活蛋白(saposin)是水解鞘脂类必需的蛋白质，已知存在4种鞘脂激活蛋白(鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白D)。由于鞘脂激活蛋白是作为产生角质层细胞间隙脂类必需的神经鞘胺醇合成酶(例如葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶等)的辅酶作用的因子，所以认为鞘脂激活蛋白对皮肤屏障功能而言是重要的。迄今为止，已确认鞘脂激活蛋白A、C、D如果在内脏中积累，则产生溶酶体忙积症(例如，Gaucher氏病、Niemann-Pick病)，鞘脂激活蛋白原(prosaposin)基因的突变造成神经损伤性的表型。已报道了在患有与皮肤相关的特应性皮炎或牛皮癣的患者中，鞘脂激活蛋白原降低(分别参见Tezuka等人，Journal of InvestigativeDermatology(1997) 109, 319-323 和 Alessandrini 等人，Journal of InvestigativeDermatology(2001) 116, 394-400)。已知在各种皮肤疾病(例如特应性皮炎、牛皮癣、接触性皮炎等)中可见的皮肤粗糙症状中，水分从皮肤的丧失比健康皮肤更旺盛。所谓的水分透皮蒸发量(TEWL)的增加可以认为与承担保持皮肤内的水分或作为屏障功能的成分减少相关。迄今为止，已报道了伴随着皮肤屏障功能降低，皮肤的皮肤功能降低，其结果是出现皮肤增殖性异常的情况。特别是在高龄对象的情况下，由于恢复已降低的皮肤屏障功能花费长的时间，因而需要新型皮肤屏障功能恢复剂，所述新型皮肤屏障功能恢复剂对于阻止随年龄增加而导致皮肤的皮肤功能降低所造成的皮肤增殖性异常等有效。对所研究的包括促进皮肤屏障功能恢复的制剂等化妆品在内的物质，必须在动物实验中确认其效果。然而，近年来，在化妆品研发的实际情况中，具有出于伦理的观点限制动物实验的倾向，对不用动物而筛选候选物质的方法需求变高。现有技术文献非专利文献非专利文献l:Tezuka 等人，Journal of InvestigativeDermatology(1997) 109, 319-323
非专利文献2 Alessandrini 等人，Journal of InvestigativeDermatology(2001) 116, 394-400
发明内容
发明要解决的课题本发明的课题是提供使用新型指标的恢复皮肤屏障功能的物质的筛选方法。解决课题的手段胱天蛋白酶(caspase) -14是胱天蛋白酶(caspase)家族的最新成员，主要在分化的角质细胞中表达。胱天蛋白酶-14鉴定出了胱天 蛋白酶家族成员间相同的EST。根据最近的研究显示，角质化细胞中的胱天蛋白酶-14加工变成异二聚体，之后表现出对与胱天蛋酶-I对应的合成底物Trp-Glu-His-Asp-AFC的酶的活性(MikolajczykJ.等人，Biochemistry 43，10560-9 (2004))。这一水解活性对蛋白质分解切割和亲液盐的存在是必需的。胱天蛋白酶-14的一级结构与炎性胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶(caspase) -I、_4和-5)非常相似，但胱天蛋白酶(caspase) -14仅限于分化的角质细胞中表达，提示与角质细胞终末分化中的其他形态相关(Lippens S.等人，Cell DeathDiffer. 7，1218-24(2000))。然而，尚未了解胱天蛋白酶_14的活化机制、天然底物或调节因子。在本文中，本发明人从分化的培养人表皮角质化细胞(NHEK )提取物中分离与胱天蛋白酶-14结合的蛋白质，进行LC/MS/MS分析，从结合胱天蛋白酶-14的蛋白质中鉴别出鞘脂激活蛋白原(prosaposin)。本发明人发现了鞘脂激活蛋白原在从基底层至颗粒层中表达，而鞘脂激活蛋白A在颗粒层最上层部分中表达，此外，胱天蛋白酶-14参与鞘脂激活蛋白原的加工，产生鞘脂激活蛋白的中间体和鞘脂激活蛋白A，从而完成了本发明。因而，本申请包括以下发明(I)筛选促进皮肤屏障功能恢复的物质的方法，该方法包括在存在促进皮肤屏障功能恢复的物质的候选物的情况下，孵育胱天蛋白酶(caspase)-14和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的步骤,和与对照物质相比，显著促进鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解为鞘脂激活蛋白(saposin) A时，选择该候选化合物为促进皮肤屏障功能恢复的物质的步骤。(2)在(I)中记载的方法,通过使用抗鞘脂激活蛋白(saposin) A抗体的蛋白质印迹方法评估上述分解。发明的效果一直以来，已知在体外实验中，胱天蛋白酶-14仅在存在高浓度的亲液盐(例如柠檬酸)的条件下表现出活化作用。因此，一直不清楚胱天蛋白酶-14在体内实现的功能。此次，本发明人首次明确了在不添加亲液盐的条件下胱天蛋白酶-14限定分解鞘脂激活蛋白原，产生鞘脂激活蛋白的中间体和鞘脂激活蛋白A(图I)。本发明人通过免疫染色进一步明确了鞘脂激活蛋白原(prosaposin)在从基底层至颗粒层中表达，此外，鞘脂激活蛋白A存在于皮肤的颗粒层上部(图2)。根据以上结果，认为胱天蛋白酶-14在生物体内有利于鞘脂激活蛋白原的加工。
鞘脂激活蛋白原的分解产物鞘脂激活蛋白作为生成角质层间隙的脂类所必需的神经鞘胺醇合成酶的辅助因子发挥作用，是形成表皮屏障所必需的，根据本发明的方法，以胱天蛋白酶-14分解成鞘脂激活蛋白A为指标，可以不进行动物实验，而研究新型的促进皮肤屏障功能恢复的物质。
图I :在存在或不存在胱天蛋白酶(caspase) -14的条件下，显示鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的加工的示意图。图2 :显示人正常皮肤中的鞘脂激活蛋白原(prosaposin)和鞘脂激活蛋白A的局部分布的免疫染色图。
具体实施方式
本发明提供了筛选促进皮肤屏障功能恢复的物质的方法，该方法包括在存在促进皮肤屏障功能恢复的物质的候选物的情况下，孵育胱天蛋白酶(caspase)-14和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的步骤，和与对照物质相比，显著促进鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解为鞘脂激活蛋白(saposin) A时,选择该候选化合物为促进皮肤屏障功能恢复的物质的步骤。本发明方法中使用的候选物没有限制，可以考虑例如活化胱天蛋白酶(caspase) -14,由此促进鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解的物质。胱天蛋白酶-14是半胱氨酸蛋白酶，因此，还原剂或具有还原作用的物质，例如巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等试剂、谷胱甘肽等生物体内的物质、具有还原作用的植物提取液可以成为该候选物。在存在该候选物的条件下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原，当与对照相比显著促进鞘脂激活蛋白原分解为鞘脂激活蛋白A时，可以选择该候选物作为促进皮肤屏障功能恢复的物质。作为其评价标准，例如对于鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解为鞘脂激活蛋白(saposin)A，与使用对照物作用的情况相比，如果增加了 10%以上、或20%以上、或30%以上、或50%以上、或70%以上、或100%以上，则可以判断为“显著促进鞘脂激活蛋白原分解为鞘脂激活蛋白A”。可以通过使用抗鞘脂激活蛋白A抗体的蛋白质印迹方法评估鞘脂激活蛋白原向鞘脂激活蛋白A的分解。该抗体优选是抗鞘脂激活蛋白A特异性的抗体。然而，本发明不限于该方法。可认为通过本发明的筛选方法选择出的试剂，对于需要恢复皮肤屏障功能的皮肤，例如由于皮肤病、各种压力和皮肤粗糙等造成皮肤屏障功能降低的肌肤、由于植皮造成没有充分形成皮肤屏障层的皮肤屏障功能低下的肌肤，或者由于移植造成皮肤屏障功能降低的肌肤等的改善是有效的。本说明书中使用的术语“皮肤屏障功能”指通过皮肤特别是表皮将体内的水分保持，以及阻止病毒、细菌等进入等。在本文中，可以通过测量不出汗的条件下的水分透皮蒸发量(TEWL)(单位g/m2*h)，评估该功能。因此，通过在皮肤上适用通过本发明选择出的作为恢复皮肤屏障功能的物质的试剂，测量TEWL，可以确定该试剂实际上是否能够使皮肤屏障功能恢复。
进而，在其他形态中，提供了用于促进皮肤屏障功能恢复的方法，该方法包括活化胱天蛋白酶-14，促进鞘脂激活蛋白原分解为鞘脂激活蛋白A。本发明的促进皮肤屏障功能恢复的方法，优选作为美容方法提供。然而，该方法不限于美容方法，也根据要恢复皮肤屏障功能的皮肤症状，出于治疗目的来进行。本发明的方法是在需要该功能恢复的患者中，通过适用活化胱天蛋白酶-14的物质，例如还原剂，来实施。适用方法没有特殊的限制，例如，可以将含有该物质作为有效成分的化妆品适用于需要恢复皮肤屏障功能的皮肤上，或者也可以将含有该物质的面膜或薄片搭载或贴在皮肤上。可以考虑皮肤的症状适当地确定上述物质适用的量。进而，该方法不限于直接适用于皮肤的方法，也可以经口给药活化胱天蛋白酶-14的物质。下文列举具体实例，更详细地说明本发明。但是，本发明不限于此。实施例I、分析与胱天蛋白酶(caspase) ~14相互作用的因子
方法使胱天蛋白酶(caspase)_14与固定了抗胱天蛋白酶(caspase)_14抗体的琼脂糖珠子结合，与下述人正常表皮细胞(NHEK)提取液反应，所述人正常表皮细胞是在增殖期和融合之后，暴露在空气中，添加2mM钙后继续培养诱导分化后的细胞。用PBS洗涤后，用甘氨酸-HCl缓冲液(pH2. 3)洗脱结合蛋白。此外，使固定了抗胱天蛋白酶-14抗体的琼脂糖珠子与正常表皮角质层提取液和从牛皮癣患者提取的皮屑提取液反应，用PBS洗涤后，同样的用甘氨酸-HCl缓冲液(pH2. 3)洗脱结合蛋白。对这4种样品施加LC/MS/MS分析。LC/MS/MS 分析为了将填充剂保持在内径ΙΟΟμπκ长度120mm的未填充的毛细管柱(NewObjetive公司生产)的锥状出口侧的端部，制做了用二氧化硅制的玻璃料。在所得的毛细管柱中，填充平均粒径为5 μ m的十八烧基化的二氧化娃型填充剂Aqua C18 (Phenomenex公司生产)至高度为100mm，获得用于分析的反向毛细管柱。为了将填充剂保持在内径250 μ m、长度150mm的未填充的毛细管柱(Agilent公司生产)的出口侧的端部，制做了用二氧化硅制的玻璃料。在所得的毛细管柱的出口侧，按2:1的质量比混合平均粒径为5 μ m的阳离子交换树脂型填充剂Partisphere SCX树脂(Whatman公司生产)和平均粒径为5 μ m的阴离子交换树脂型填充剂PolyWAX LP (PolyLC公司生产)，在入口侧填充平均粒径为5μπι的十八烷基化的二氧化硅型填充剂Aqua C18(Phenomenex公司生产)。分别加至25mm高度，获得由捕获用的反向毛细管柱和SCX-WAX混合毛细管柱组成的二相毛细管柱。此外，在制备用于分析的反向毛细管柱和二相毛细管柱时，使用高压氮气和加压型填充容器，通过填浆法来填充填充剂。之后，通过6步的MudPIT型分析(二维HPLC/ESI MS/MS)，分析上述4个样品。首先，将含约4 μ g肽的上清液，通过加压法上样到二相毛细管柱中之后，使用样品溶液10倍以上体积的移动相A(水、乙腈和蚁酸的体积比为95:5:0. I的混合液；ρ!Γ2. 6)，洗漆，脱盐。将该二相毛细管柱10通过贯穿孔型接头(Upchurch Scientif ic公司生产)(图中未显示)连接到用于分析的反向毛细管柱20上。然后，连接到使用内径100 μ m的毛细管作为配管的Nanospace SI-2型HPLC装置(资生堂公司生产)上。此时，在SCX-WAX混合毛细管柱12和用于分析的反向毛细管柱20的上游侧配置有用于捕获的反向毛细管柱11。使用移动相A、移动相B(水、乙腈和蚁酸的体积比为20:80:0. I的混合液)、移动相C (含有500mM醋酸铵的移动相A;pH 6_8)作为移动相，肽的洗脱方法为在每一步中逐步矩形地增加添加的移动相C的体积％，共计6步的梯度洗脱法。步骤I的洗脱方案是流过5分钟的移动相A，之后5分钟将移动相B的比例从O体积％增加至15体积％，之后60分钟将移动相B的比例增加至45体积％，之后10分钟将移动相B的比例增加至75体积％，之后以该比例流过5分钟。步骤2-6的洗脱方案是流过I分钟的移动相A，之后4分钟流过比例为X(体积％)的移动相C，之后5分钟将移动相C的比例从O体积％增加至15体积％，之后60分钟将移动相C的比例增加至45体积％，之后10分钟将移动相C的比例增加至75体积％，之后按该 比例流过5分钟。此时，泵送液的流速为250 μ L/分钟，通过阻抗型毛细管分流，柱的流速调整为30(T400nL/分钟。此外，在测定ESI MS/MS时，使用离子讲型质谱仪LCQ-Deca (Thermo FisherScientific公司生产)。此时，将从用于分析的反向毛细管柱中洗脱出的肽，不经过分流，直接导入质谱仪中。另外，在各个步骤中反复进行质量电荷比(m/z)为40(Tl400的全扫描MS频谱测量I次，以及数据依赖型MS/MS频谱测量3次。此时，标准解离能为35%。此外，MS频谱测量和MS/MS测量都进行3次微扫描。此外，动态排除设定为重复计数1，重复周期O. 5分钟，排除列表大小25，排除周期10. 00分钟。所获得的MS/MS 频谱,通过在 Bioworks 软件(Thermo Fisher Scientific 公司生产)上运行的SEQUEST算法,检索非冗余的人数据库(ftp://ftp. ncbi. nih. gov/blast/db/FASTA/nr. gz,2007/2/8 版)。分析的结果仅在与诱导分化后的NHEK反应的样品，以及与正常表皮角质层提取液反应后的样品中一样，都确定了存在鞘脂激活蛋白原。2、胱天蛋白酶(caspase)-14对鞘脂激活蛋白原(prosaposin)的加工在通常的角质细胞单层培养体系中，鞘脂激活蛋白原没有接受加工，仅以前体形式存在。利用这一点，研究前体鞘脂激活蛋白原与胱天蛋白酶-14的反应。在有或无1.2M亲液盐(柠檬酸离子)的条件下，使含有鞘脂激活蛋白原的人正常表皮细胞(NHEK)提取液与活化的胱天蛋白酶-14在37°C反应I小时，用水透析后，冷冻干燥。将其溶解在SDS电泳样品缓冲液中，在SDS电泳后，通过蛋白质印迹，研究各自的鞘脂激活蛋白的生成。分别使用的抗体是抗鞘脂激活蛋白原抗体(PSAP多克隆抗体(AOl)=Abnova公司)、抗鞘脂激活蛋白A特异性抗体(本公司生产)、抗鞘脂激活蛋白B抗体(E-15, sc-27014 Santa Cruz公司)、抗鞘脂激活蛋白C抗体(H-81，sc-32875 =Santa Cruz公司)、抗鞘脂激活蛋白D抗体(E-14，sc-27024R =Santa Cruz公司)。稀释比例都使用1/1000。此外，除了抗鞘脂激活蛋白A特异性抗体外，任一种抗体都识别鞘脂激活蛋白原。结果显示在图I中。根据图I的结果可见，在存在胱天蛋白酶-14的条件下，鞘脂激活蛋白原(prosaposin)分解为多个中间体。其中，作为鞘脂激活蛋白原的最终分解产物之一的鞘脂激活蛋白A是通过鞘脂激活蛋白A特异性抗体识别出的，因此认为胱天蛋白酶-14实现了将鞘脂激活蛋白原分解为鞘脂激活蛋白A的效果。
3、免疫染色为了使用整形外科手术所获得的正常皮肤切片，明确鞘脂激活蛋白原和鞘脂激活蛋白A的局部分布，进行了免疫染色。通过二甲苯将石蜡切片脱石蜡，放回PBS溶液后，通过10%山羊血清进行封闭。PBS洗涤后，与抗鞘脂激活蛋白原抗体(PSAP多克隆抗体(A01):Abnova公司，稀释比例1/200)或抗鞘脂激活蛋白A特异性抗体(本公司生产)(稀释比例1/200)在室温下反应I小时。用PBS洗涤3次后，与Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(鞘脂激活蛋白原)或Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG (鞘脂激活蛋白A)在室温下反应I小时。用 PBS 洗漆 3 次后，使用 VectorShield 封固剂(DAPI) (Vector Laboratories 公司)封固，通过荧光显微镜进行观察。结果显示在图2中。
根据图2的结果可见，鞘脂激活蛋白原在正常的人表皮基底层至颗粒层中存在，而鞘脂激活蛋白A在颗粒层的最上层表达。这一结果与上述蛋白质印迹的结果同时证明专门在角质细胞中表达的胱天蛋白酶在分解人皮肤中的鞘脂激活蛋白原，在皮肤屏障功能中发挥重要的作用。
权利要求
1.筛选促进皮肤屏障功能恢复的物质的方法，该方法包括在存在促进皮肤屏障功能恢复的物质的候选物的情况下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原的步骤，和 与对照物质相比，显著促进鞘脂激活蛋白原分解为鞘脂激活蛋白A时，选择该候选化合物为促进皮肤屏障功能恢复的物质的步骤。
2.如权利要求I所述的方法，通过使用抗鞘脂激活蛋白A抗体的蛋白质印迹方法评估上述分解。
3.用于促进皮肤屏障功能恢复的方法，所述方法包括活化胱天蛋白酶-14，促进鞘脂激活蛋白原分解为鞘脂激活蛋白A。
4.如权利要求3所述的方法，包括将活化胱天蛋白酶-14的物质用于皮肤上。
全文摘要
本发明提供了筛选促进皮肤屏障功能恢复的物质的方法，该方法包括在存在促进皮肤屏障功能恢复的物质的候选物的情况下，孵育胱天蛋白酶-14和鞘脂激活蛋白原的步骤，和与对照物质相比，显著促进鞘脂激活蛋白原分解为鞘脂激活蛋白A时，选择该候选化合物为促进皮肤屏障功能恢复的物质的步骤。
文档编号G01N33/53GK102906274SQ20108005488
公开日2013年1月30日 申请日期2010年12月3日 优先权日2009年12月4日
发明者日比野利彦, 山本真实 申请人:株式会社资生堂