黄曲霉毒素m1免疫层析试纸条及其制备方法

专利名称：黄曲霉毒素m1免疫层析试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属生物检测领域，具体涉及一种黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条及其制备 方法。
背景技术：
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是一种能引起 人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素(AFT)目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素 Bl为毒性及致癌性最强的物质。黄曲霉毒素Ml是黄曲霉毒素Bl的羟基化代谢产物，也是 一种强致癌物质。当哺乳动物摄入AFBl污染的饲料后，在体内经羟基化会将AFMl分泌于乳 汁当中。奶牛经摄入黄曲霉毒素Bl污染的饲料后产出的牛奶中便含有黄曲霉毒素Ml。由 于黄曲霉毒素Ml相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉毒素Ml不仅要检 测动物饲料原料，而且要检测最终产品。为此世界各国都规定了牛乳及其制品中黄曲霉毒 素Ml的最大允许含量并将其作为强制性标准，如中国政府规定牛乳及其制品(消毒牛奶、 新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、甜炼乳、奶油)中黄曲霉毒素Ml的最高允许含量为0. 5 ng/mL0现有技术中常用的黄曲霉毒素检测技术主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱 法(HPLC)、免疫学分析法。前两者具有样品前处理步骤繁琐，耗时费力，仪器价格昂贵，需要 专业人员操作等的缺点，而免疫学分析法具有特异性强、样品前处理简单、成本低、对实验 人员和环境的污染危害小等优点。最常用的免疫学分析法有酶联免疫吸附法、纳米金免疫 层析法等。目前已有黄曲霉毒素Ml的ELISA试剂盒问世，如德国拜发R-Biopharm公司以 及美国Abraxis公司等研发的黄曲霉毒素Ml ELISA检测试剂盒。而基于纳米金的免疫层 析快速检测技术因其更短的检测时间和更简单的样品前处理而显示出更大的应用价值和 应用前景。但目前世界上还没有针对黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条问世。因此，研究建立 一种针对黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条对于监控黄曲霉毒素Ml的含量具有很重要的意义 和应用价值。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条及其制备 方法。该试纸条用于检测黄曲霉毒素M1，具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为
黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条(见图1和图2)，包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘 贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维 素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄曲 霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物(AFMl-BSA)，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标 垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗 体由保藏号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9产生。
所述的杂交瘤细胞株2C9已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201018。其具有序列 表中SEQ Gene No. 1所示的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列 表中SEQ Gene No. 2所示的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞 株2C9分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ Protein No. 1所示的氨基酸序列；轻链 可变区具有序列表中SEQ Protein No. 2所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗 体可以识别黄曲霉毒素Ml，对黄曲霉毒素Ml的50%抑制浓度IC5tl为67 pg/mL。本发明采用的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的制备方法，步骤如下
(1)采用两步筛选法获得杂交瘤细胞株2C9将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原 AFMl-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA作最 后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞第一步 采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞 争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素Ml作为竞争原，选择 吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步 筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株2C9 ；
(2)将获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收 集该小鼠的腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体。按上述方案，所述的吸水垫长16 18_，宽2 4mm ；检测垫长25 30_，宽2 4mm ；金标垫长6 9mm，宽2 4mm ；样品垫长12 18mm，宽2 4mm，相邻各垫的交叠长度 为1 3mm。按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。按上述方案，所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15 20mm，质 控线和检测线的间距为5 10mm。按上述方案，所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶 联物(AFMl-BSA)的包被量为75 375ng ；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被 量为50 500ng。
按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15 20nm ；所述金标垫上每厘 米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的用量为200 600ng。如上所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁即得吸水垫；
(2)检测垫的制备 检测线的包被
将黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物(AFMl-BSA)配制成0. 1 0. 5mg/mL的包 被液A ；于距离硝酸纤维素膜上沿为15 20mm的位置，用点喷方式将包被液A横向包被于 硝酸纤维素膜上得到检测线，每厘米检测线上所需黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物 (AFMl-BSA)的包被量为75 375ng，然后于37 40°C条件下干燥5 20分钟； 质控线的包被将兔抗鼠多克隆抗体配制成0. 1 0. 5mg/mL的包被液B ；于距检测线5 IOmm的位 置，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需 兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50 500ng，然后于37 40°C条件下干燥5 20分钟；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液A中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥4 10小时，得样 品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜放入封闭液B中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥4 10小时，于已 干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液横向 进行喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体为200 600ng， 然后真空冷冻干燥2 6h，置干燥器中室温保存；
所述的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株 2C9产生；
(5)试纸条的组装
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处 交叠连接，交叠长度为1 3mm，即得黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条。按上述方案，所述的包被液A是按照下述方法配制得到的将10 50mg市售黄 曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物(AFMl-BSA)，1 2g牛血清白蛋白，0. 02 0. 05g叠氮 化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至 IOOmL所得；
所述的包被液B是按照下述方法配制得到的将10 50mg兔抗鼠多克隆抗体，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾， 加水定容至IOOmL所得。按上述方案，所述的封闭液A是按照下述方法配置得到的将1 2g牛血清白蛋 白，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯 化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；
所述的封闭液B是按照下述方法配制得到的将1 2g牛血清白蛋白，0. 1 0. 2mL曲 拉通X-100,0. 3 05g聚乙烯吡咯烷酮，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化 钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得。按上述方案，所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液的标记方法为 取50. OmL市售质量浓度为0. 01%的纳米金溶液，调节溶液pH值为5. 5 ；在搅拌的状态下 缓慢加入2. 5mL 0. lmg/mL的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min ；加入质 量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min; 于4°C放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30 min，弃去上清液，加入50. OmL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30 min，弃去上清液， 将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5. OmL浓缩物，置4°C冰箱备用，其中纳米金标记的抗 黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液的质量浓度为0. 05mg/mL ；
所述的标记洗涤保存液是按照下述方法配制得到的2. Og聚乙二醇20000,0. 2g叠氮 钠，0. 1235克硼酸，纯水定容至1000mL，0. 22Mm滤膜过滤所得。
如上所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的应用，方法如下取ImL待测液态牛 乳及其制品，加入0. 25 0. 5mL水，混勻，得到样品溶液，取100 μ L已稀释好的样品溶液做 为检测液逐滴滴加到一黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的样品垫，将其作为检测试纸条，同 时取ImL不含黄曲霉毒素Ml的空白牛奶样品，加0. 25 0. 5mL水，混勻，得到阴性对照溶 液，取IOOyL阴性对照溶液，逐滴滴加到另一黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的样品垫，将 其作为对照试纸条，15分钟后读取结果；
检测结果(1)阳性当检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线不显色时，或 者质控线显示出红色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅时，判为阳性，表明待 测样品中黄曲霉毒素Ml的含量高于或等于0. 5ng/mL ； (2)阴性当检测试纸条的质控线和 检测线均显示出红色线条，并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，判为阴性结 果，表明待测样品中黄曲霉毒素Ml的含量低于0. 5ng/mL ； (3)无效当质控线不显色时，无 论检测试纸条的检测线显示或不显示红色线条，该试纸条判为无效。该黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的工作原理当待测样品溶液加入到试纸条下 端的样品垫上时，待测样品溶液通过毛细作用沿试纸条向吸水垫方向移动，当其移动至金 标垫时，纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体被溶解。当样品中含有黄曲霉毒素Ml 时，游离的黄曲霉毒素Ml将和金标垫上的纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体结合 并一同向上泳动，其到达固定着抗原的检测线时，抗原将和黄曲霉毒素Ml竞争结合纳米金 标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体上有限的抗原结合位点，样品中黄曲霉毒素Ml含量越 高，检测线上的抗原能够结合的纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体将越少，形成的 显色带颜色越浅。当抗原所结合的纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体少于一定的 数量时，检测线处将不会有红色线条出现。无论样品中是否含有黄曲霉毒素，未被检测线上 的抗原截获的纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体或纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml 单克隆抗体与黄曲霉毒素Ml的结合物将继续移动到质控线并与质控线上的第二抗体结合 并被富集显色，所以样品中不含黄曲霉毒素M1，即为阴性时为两条红色条带，质控线和检测 线均为红色；含有一定量黄曲霉毒素M1，即为阳性时有两种情况1、只出现一条红色质控 线，检测线不显色；2、一条红色质控线和一条浅红色检测线；而质控线没有色带出现则表 明试纸条失效。本发明的有益效果在于
(1)检测黄曲霉毒素Ml。本发明提供的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条使用的抗体为 抗黄曲霉毒素Ml特异性单克隆抗体，用于特异性快速检测黄曲霉毒素Ml ；
(2)操作简单。用该黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条进行检测时只需将样品溶液逐滴 加到试纸条的样品垫上即可，为一步式操作，操作简单、方便；
(3)检测过程不需要黄曲霉毒素Ml标准溶液作为阳性对照。本发明提供的黄曲霉毒 素Ml免疫层析试纸条检测样品时不需要使用黄曲霉毒素Ml标准溶液作为阳性对照，而只 需用空白样品作为阴性对照即可；
(4)检测灵敏度高。本发明提供的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条对样品中黄曲霉毒 素Ml的最低检测限为0. 5ng/mL。


图1为本发明的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的正视图。图中1纸板、2吸水 垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫；6质控线；7检测线。图2为本发明的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的侧视结构示意图。图中1纸 板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫。图3为实施例2的的结果判定图。图中 4检测线。图4为实施例3的的结果判定图。图中 4检测线。图5为实施例4的的结果判定图。图中 4检测线。
具体实施例方式实施例1 抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的制备方法
抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9产 生，其制备方法，包括以下步骤
1.采用两步筛选法获得杂交瘤细胞株2C9 (1)动物免疫
购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的黄曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA。第一次 免疫将黄曲霉毒素完全抗原与等量福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第 二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等量黄曲霉毒素完全抗原乳化，于小鼠腹 腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免 疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每 鼠40 μ g/mL。前3次每次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠 血清效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效 价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应 的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的2倍。黄曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA购 于 Sigma-Aldrich 公司； 2)细胞融合
于最后一次加强免疫3天后，采用50%(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450) 作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与 鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5 : 1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用 50%PEG融合，融合1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和 鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用7aiiLRPMI-1640基础培养液重悬，将重悬起来的 细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37°C二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-1640 基础培养液为含有20% (体积百分数)胎牛血清，2% (重量百分数)生长因子和1% (重量百 分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有 限公司；RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷 即 HAT 购于 Sigma-Aldrich 公司；1对照试纸条；2检测试纸条；3质控线； 1对照试纸条；2检测试纸条；3质控线； 1对照试纸条；2检测试纸条；3质控线；3)细胞株的筛选及克隆
待细胞融合后第12天左右，细胞集落长到占孔底1/2大小，培养液变黄，即可进行抗体 检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采 用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素Ml而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞 争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素Ml作为竞争原，选择吸光值 和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏 度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC5tl值较小)，采用有限稀释法进行克隆，克隆后 10天左右采用同样的两步法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株2C9。采用如下方法测定杂交瘤细胞株2C9抗体可变区序列
(1)测定提取总RNA采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交 瘤细胞株2C9的总RNA ；
(2)合成cDNA:以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT) 15为引物，按照 SuperScript -2 II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo (dT) 15由 Invitrogen 购得；
(3)PCR法克隆可变区基因根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物， 以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为94°C 30s,55°C lmin、72°C Imin ，扩增30个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物经过(重量百分数)的琼脂糖凝胶 电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMDIS-T中，转化大肠杆菌DH5 α感 受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别 为重链可变区引物为 5’-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3’(22mer)和 5’_TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中 S、M、R 和 W 为兼并碱基，M=A/C，R=A/G， S=C/G, W=A/T，轻链可变区引物为 5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3'(24mer) 和 5'-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3'(24mer)；
得到的基因序列结果重链可变区编码基因序列长354bp，序列如SEQ ID NO: 1所示， 根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由117个氨基酸组成，序列 如SEQ ID N0:3所示。轻链可变区编码基因序列长332bp，序列如SEQ ID N0:2所示，根据所 获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由110个氨基酸组成，序列如SEQ ID N0:4 所示。2.抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的纯化
将步骤1获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠， 收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为用双层滤纸过滤小鼠腹 水，4°C，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混 合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μ L，室温混合30min，4°C 静置2h，然后4°C，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加 入1/10滤液体积的摩尔浓度为0. lmol/L和pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的 氢氧化钠溶液调节该混合液的PH值至7. 4,4 °C预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为 0. 277g/mL，4°C静置浊，然后4°C，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体 积1/10的0. Olmol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶 液置-70°C冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，将抗体置-20°C冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0. 29g醋酸钠，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的 0. lmol/L的磷酸盐缓冲液为0. Sg氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，磷酸二 氢钾0. 02g加水定容至IOOmL所得。用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株2C9分泌的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗 体的亚型为IgGh。用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得2C9的鼠腹水抗体的 效价可达4. 26 X IO6,即鼠腹水抗体稀释4. 26 X IO6倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间 接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素Ml的灵敏度为67 pg/mL，与黄曲霉毒素Bi，B2, Gl, G2交叉反应率均小于0. 1%。实施例2-4 黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备及应用
下述实施例2-4使用的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体为实施例1制备得到的抗黄曲霉 毒素Ml单克隆抗体。实施例2
黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤 (1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长16mm宽3mm的规格，即得吸水垫； (2检测垫的制备 检测线的包被
将黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物AFMl-BSA配制成0. lmg/mL的包被液A ；于 距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上，得 到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物的包被量为75ng，然 后于37°C条件下干燥15分钟；
所述的包被液A为10mg市售黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物AFM1-BSA，Ig牛血 清白蛋白，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷 酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得； 质控线的包被
将兔抗鼠多克隆抗体配成0. 2mg/mL的包被液B ；于距检测线5mm的位置，用点喷方式 将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗 体的包被量为lOOng，然后于37°C条件下干燥15分钟；
所述的包被液B为将20mg兔抗鼠多克隆抗体，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0. 29g 十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得； 所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽3mm ；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长13mm宽3mm的规格，放入封闭液A中浸湿，取出，于37°C条件下 干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
所述的封闭液A为Ig牛血清白蛋白，2g蔗糖，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二 水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；
(4)金标垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长9mm宽3mm的规格，放入封闭液B中浸湿，取出，于37°C条件下干燥16小时，于干燥好的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克 隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体为 600ng，然后真空冷冻干燥6h，置干燥器中室温保存；
所述的封闭液B为Ig牛血清白蛋白，0. ImL曲拉通X-100，0. 3g聚乙烯吡咯烷酮，2g蔗 糖，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢 钾，加水定容至IOOmL所得；
所述的纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液的具体标记方法为量取 50. OmL质量浓度为0. 01%的纳米金溶液，用0. 1 mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为 5. 5 ；在搅拌的状态下缓慢加入2. 5mL 0. lmg/mL的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体水溶液，继 续搅拌30min ；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为 1%，继续搅拌30min ；于4°C放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液 12000r/min离心30 min，弃去上清液，加入50. OmL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心 30 min,弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5. OmL浓缩物，置4°C冰箱备用， 其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液的质量浓度为0. 05mg/mL ； 所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm ；
所述的0. 1 mol/L碳酸钾水溶液为13. 8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0. 22Mm滤 膜过滤所得；所述的0. lmg/mL抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体水溶液为Img抗黄曲霉毒素Ml 单克隆抗体溶解在10 mL纯水中制成；所述的10%牛血清白蛋白水溶液为IOg牛血清白 蛋白溶解在IOOmL纯水中，0. 22ΜΠ1滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为2. Og聚乙二 醇-20000,0. 2g叠氮钠，0. 1235克硼酸，纯水定容至1000mL，0. 22Mm滤膜过滤所得；
(5)试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品 垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条，见 图1和图2。上述黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的应用
吸取1#和2#待测牛奶样品各lmL，加入0. 25mL水，混勻，得到样品溶液，取100 μ L已 稀释好的样品溶液分别做为检测液逐滴加入一黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的样品垫， 将其作为检测试纸条；同时取ImL不含黄曲霉毒素Ml的空白牛奶样品，加入0. 25mL水，混 勻，得到阴性对照溶液，取100 μ L阴性对照溶液，逐滴加到另一黄曲霉毒素Ml免疫层析试 纸条的样品垫，将其作为对照试纸条，15分钟后读取结果；
检测结果1#检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线不显色，则判为阳性结 果，表明待测样品中的黄曲霉毒素Ml的含量高于0. 5ng/mL，见图3-1 ；2#检测试纸条的质 控线显示出红色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅，则判为阳性结果，表明待 测样品中的黄曲霉毒素Ml的含量高于或等于0. 5ng/mL,见图3_2。实施例3
黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长18mm宽4mm的规格，即得吸水垫；
(2)检测垫的制备 检测线的包被将黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物AFMl-BSA配制成0. 2mg/mL的包被液A ；于 距硝酸纤维素膜上沿18mm的位置，用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上，得 到检测线，每厘米检测线所需的黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物的包被量为150ng， 然后于38°C条件下干燥10分钟；
所述的包被液A为20mg市售黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物AFMl-BSA，1.5g牛 血清白蛋白，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g 磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得； 质控线的包被
将兔抗鼠多克隆抗体配成0. 2mg/mL的包被液B ；于距检测线8mm的位置，用点喷方式 将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆 抗体的包被量为200ng，然后于38°C条件下干燥10分钟；
所述的包被液B为将20mg兔抗鼠多克隆抗体，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0. 29g 十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得； 所述的硝酸纤维素膜长^mm,宽4mm ；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽4mm的规格，放入封闭液A中浸湿，取出，于38°C条件下 干燥5小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
所述的封闭液A为1. 5g牛血清白蛋白，2. 5g蔗糖，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g 十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；
(4)金标垫的制备将玻璃纤维膜剪裁成长8mm宽4mm的规格，放入封闭液B中浸湿， 取出，于38°C条件下干燥5小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗 黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒 素Ml单克隆抗体为450ng，然后真空冷冻干燥4h，置干燥器中室温保存；
所述的封闭液B为1.5g牛血清白蛋白，0. ImL曲拉通X-100，0.4g聚乙烯吡咯烷酮， 2. 5g蔗糖，0. 02g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷 酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；
所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液的具体标记方法为量取50. OmL 质量浓度为0. 01%的纳米金溶液，用0. 1 mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为5. 5 ；在搅 拌的状态下缓慢加入2. 5mL 0. lmg/mL的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体水溶液，继续搅拌 30min ；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续 搅拌30min ；于4°C放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/ min离心30 min，弃去上清液，加入50. OmL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30 min， 弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5. OmL浓缩物，置4°C冰箱备用，其中纳米 金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液的质量浓度为0. 05mg/mL ； 所述纳米金溶液中纳米金的粒径为17nm ；
所述的0. 1 mol/L碳酸钾溶液为13. 8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0. 22Mm滤膜 过滤所得；所述的0. lmg/mL抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液为Img抗黄曲霉毒素Ml单克 隆抗体溶解在10 mL纯水中制成；所述的10%牛血清白蛋白溶液为IOg牛血清白蛋白溶解 在IOOmL纯水中，0. 22ΜΠ1滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为2. Og聚乙二醇-20000，0. 2g叠氮钠，0. 1235克硼酸，纯水定容至1000mL，0. 22Mm滤膜过滤所得；
(5)试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品 垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条，见 图1和图2。如上所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的应用
吸取待测牛奶样品lmL，加入0. 3mL水，混勻，得到样品溶液，取100μ L稀释好的样品溶 液做为检测液逐滴加入一黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的样品垫，将其作为检测试纸条， 同时取ImL空白牛奶样品，加入0. 3mL水，混勻，得到阴性对照溶液，取100 μ L阴性对照溶 液，逐滴加入另一黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的样品垫，将其作为对照试纸条，15分钟 后读取结果；
检测结果检测试纸条的质控线和检测线均显示出红色线条，并且检测线颜色与对 照试纸条检测线颜色接近，判为阴性结果，表明待测样品中的黄曲霉毒素Ml的含量低于 0. 5ng/mL，见图 4。实施例4
黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤
(1)吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长17mm宽2mm的规格，即得吸水垫；
(2)检测垫的制备 检测线的包被
将黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物AFMl-BSA配制成0. 5mg/mL的包被液A ；于 距硝酸纤维素膜上沿20mm的位置，用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上，得 到检测线，每厘米检测线所需的黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物的包被量为375ng，然 后于39°C条件下干燥8分钟；
所述的包被液A为50mg市售黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物AFM1-BSA，2g牛血 清白蛋白，0. 04g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷 酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得； 质控线的包被
将兔抗鼠多克隆抗体配成0. 5mg/mL的包被液B ；于距检测线IOmm的位置，用点喷方式 将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆 抗体的包被量为500ng，然后于39°C条件下干燥8分钟；
所述的包被液B为将50mg兔抗鼠多克隆抗体，0. 04g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g 十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得； 所述的硝酸纤维素膜长30mm，宽2mm ；
(3)样品垫的制备
将玻璃纤维膜剪裁成长17mm宽2mm的规格，放入封闭液A中浸湿，取出，于39°C条件下 干燥10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
所述的封闭液A为2g牛血清白蛋白，5g蔗糖，0. 04g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0.29g十二 水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；
(4)金标垫的制备将玻璃纤维膜剪裁成长6mm宽2mm的规格，放入封闭液B中浸湿，取出，于39°C条件下 干燥10小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克 隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体为 200ng，然后真空冷冻干燥池，置干燥器中室温保存；
所述的封闭液B为2g牛血清白蛋白，0. 15mL曲拉通X_100，05g聚乙烯吡咯烷酮，5g 蔗糖，0. 04g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二 氢钾，加水定容至IOOmL所得；
所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液的具体标记方法为量取50. OmL 质量浓度为0. 0. 1%的纳米金溶液，用0. 1 mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值为5. 5 ；在 搅拌的状态下缓慢加入2. 5mL 0. lmg/mL的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体水溶液，继续搅拌 30min ；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续 搅拌30min ；于4°C放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/ min离心30 min，弃去上清液，加入50. OmL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30 min， 弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5. OmL浓缩物，置4°C冰箱备用，其中纳米 金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液的质量浓度为0. 05mg/mL ； 所述纳米金溶液中纳米金的粒径为20nm ；
所述的0. 1 mol/L碳酸钾水溶液为13. 8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0. 22Mm滤 膜过滤所得；所述的0. lmg/mL抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体水溶液为Img抗黄曲霉毒素Ml 单克隆抗体溶解在10 mL纯水中制成；所述的10%牛血清白蛋白水溶液为IOg牛血清白 蛋白溶解在IOOmL纯水中，0. 22ΜΠ1滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为2. Og聚乙二 醇-20000,0. 2g叠氮钠，0. 1235克硼酸，纯水定容至1000mL，0. 22Mm滤膜过滤所得；
(5)试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品 垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为3mm，即得黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条，见 图1和图2。 如上所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的应用
吸取1#和2#待测牛奶样品各lmL，加入0. 4mL水，混勻，得到样品溶液，取100 μ L已稀 释好的样品溶液分别做为检测液逐滴滴加到一黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的样品垫， 将其作为检测试纸条，同时取ImL空白牛奶样品，加入0. 4mL水，混勻，得到阴性对照溶液， 取100 μ L阴性对照溶液，逐滴加入另一黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的样品垫，将其作为 对照试纸条，15分钟后读取结果；
检测结果1#检测试纸条的质控线不显色，检测试纸条的检测线显示红色线条，则判 为无效，见图5-1 ；姊检测试纸条的质控线不显色，检测试纸条的检测线亦不显示红色线 条，则判为无效，见图5-2。
权利要求
1.黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条，其特征在于包括纸板，纸板的一面从上到下依次 粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤 维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄 曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷 涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体由保藏 号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9产生。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条，其特征在于所述的吸水垫 长16 18mm，宽2 4mm ；检测垫长25 30mm，宽2 4mm ；金标垫长6 9mm，宽2 4mm ； 样品垫长12 18mm，宽2 4mm，相邻各垫的交叠长度为1 3mm。
3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条，其特征在于所述检测垫上 的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15 20mm，质控线和检测线的间距为5 10mm。
4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条，其特征在于所述检测垫上 每厘米检测线所需的黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶联物的包被量为75 375ng ；每厘米 质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50 500ng。
5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条，其特征在于所述金标垫中 所用的纳米金的粒径为15 20nm ；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗 黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的用量为200 600ng。
6.根据权利要求1或2所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备方法，其特征在 于包括以下步骤(1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁即得吸水垫；(2)检测垫的制备检测线的包被将黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物配制成0. 1 0. 5mg/mL的包被液A ；于距离 硝酸纤维素膜上沿为15 20mm的位置，用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜 上得到检测线，每厘米检测线上所需黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶联物(AFMl-BSA)的 包被量为75 375ng，然后于37 40°C条件下干燥5 20分钟；质控线的包被将兔抗鼠多克隆抗体配制成0. 1 0. 5mg/mL的包被液B ；于距检测线5 IOmm的位 置，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需 兔抗鼠多克隆抗体的包被量为50 500ng，然后于37 40°C条件下干燥5 20分钟；(3)样品垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液A中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥4 10小时，得样 品垫，然后置干燥器中室温保存；(4)金标垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液B中浸湿，取出，于37 40°C条件下干燥4 10小时，于已 干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液横向 进行喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体为200 600ng， 然后真空冷冻干燥2 6h，置干燥器中室温保存；所述的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株 2C9产生；(5)试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处 交叠连接，交叠长度为1 3mm，即得黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条。
7.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所 述的包被液A是按照下述方法配制得到的将10 50mg市售黄曲霉毒素Ml-牛血清白蛋 白偶联物(AFMl-BSA)，1 2g牛血清白蛋白，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g 十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得；所述的包被液B是按照下述方法配制得到的将10 50mg兔抗鼠多克隆抗体，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾， 加水定容至IOOmL所得。
8.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所 述的封闭液A是按照下述方法配置得到的将1 2g牛血清白蛋白，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾， 加水定容至IOOmL所得；所述的封闭液B是按照下述方法配制得到的将1 2g牛血清白蛋白，0. 1 0. 2mL曲 拉通X-100,0. 3 05g聚乙烯吡咯烷酮，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g叠氮化钠，0. 8g氯化 钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，0. 02g磷酸二氢钾，加水定容至IOOmL所得。
9.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所 述纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体溶液的标记方法为取50. OmL市售质量浓度 为0. 01%的纳米金溶液，调节溶液pH值为5. 5 ；在搅拌的状态下缓慢加入2. 5mL 0. lmg/mL 的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min ；加入质量浓度为10%牛血清白蛋 白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min ；于4°C放置池后，1500r/ min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30 min,弃去上清液，加入 50. OmL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30 min,弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保 存液重悬，得到5. OmL浓缩物，置4°C冰箱备用，其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素Ml单克隆 抗体溶液的质量浓度为0. 05mg/mL ；所述的标记洗涤保存液是按照下述方法配制得到的2. Og聚乙二醇20000,0. 2g叠氮 钠，0. 1235克硼酸，纯水定容至1000mL，0. 22Mm滤膜过滤所得。
10.一种权利要求1或2所述的黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的应用，其特征在于取 ImL待测液态牛乳及其制品，加入0. 25 0. 5mL水，混勻，得到样品溶液，取100 μ L已稀释 好的样品溶液做为检测液逐滴滴加到一黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸条的样品垫，将其作 为检测试纸条，同时取ImL不含黄曲霉毒素Ml的空白牛奶样品，加0. 25 0. 5mL水，混勻， 得到阴性对照溶液，取100 μ L阴性对照溶液，逐滴滴加到另一黄曲霉毒素Ml免疫层析试纸 条的样品垫，将其作为对照试纸条，15分钟后读取结果；检测结果(1)阳性当检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线不显色时，或 者质控线显示出红色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅时，判为阳性，表明待 测样品中黄曲霉毒素Ml的含量高于或等于0. 5ng/mL ； (2)阴性当检测试纸条的质控线和检测线均显示出红色线条，并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，判为阴性结 果，表明待测样品中黄曲霉毒素Ml的含量低于0. 5ng/mL ； (3)无效当质控线不显色时，无 论检测试纸条的检测线显示或不显示红色线条，该试纸条判为无效。
全文摘要
本发明属生物检测领域。黄曲霉毒素M1免疫层析试纸条，其特征在于包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶联物(AFM1-BSA)，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO.C201018的杂交瘤细胞株2C9产生。该试纸条用于检测黄曲霉毒素M1，具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。
文档编号G01N33/532GK102109518SQ20111006294
公开日2011年6月29日 申请日期2011年3月16日 优先权日2010年12月21日
发明者丁小霞, 姜俊, 张奇, 张文, 张道宏, 李培武, 管笛 申请人:中国农业科学院油料作物研究所