专利名称：一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基于酶传感的细胞内过氧化氢的电化学检测方法，特别是涉及一 种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法，属于生物传 感和细胞电化学技术领域。
背景技术：
细胞在代谢过程中不断产生各种活性氧(reactive oxygen species，R0S)，例如 超氧阴离子自由基(02_‘)、羟自由基(·0Η)、脂自由基(R00·)、过氧化氢(H2O2)等。过氧 化氢是其中最为稳定的一种，并且其浓度和0厂、· OH等其他ROS分子密切相关，最新的研 究发现过氧化氢在生命体系的细胞代谢过程中扮演着重要的调节作用。过氧化氢可作为信 号分子或第二信使参与多种因子细胞生物学效应的启动，但同时也可与细胞内的生物大分 子反应，从而直接引起细胞膜脂质过氧化、细胞内蛋白质和酶类变性、核酸DNA损伤等，最 终导致细胞死亡、组织损伤、心血管疾病、肿瘤及神经元退变等多种疾病的发生。因此，发展 一种可靠的、灵敏的检测细胞中过氧化氢的方法在生理学和病理生理学领域有着极其重要 的意义。目前检测过氧化氢的方法主要有荧光法、化学发光法、高效液相色谱法、电子顺磁 共振法和基于酶传感的电化学方法等。然而，细胞水平的H2O2检测仍然受到较多因素制约， 如细胞尺度小、胞内超氧自由基的半衰期非常短、稳态浓度极低以及缺少对H2A有效捕获 的探针等，而且一些传统的分析方法存在取样体积大、质量检测限高、分析时间长、仪器价 格昂贵等不足。在众多的检测方法中，基于酶传感的电化学方法由于其具有灵敏度高、响应 快、样品消耗量小、专一性强、易于制备和小型化等优点而倍受人们关注。基于酶传感的电化学方法是将具有氧化还原特性的蛋白质(酶)固载到某种材料 上并将其修饰到电极表面构建成电化学传感器，通过蛋白质(酶)的电催化性能对底物过氧 化氢进行检测。辣根过氧化物酶由于其结构已知、来源广泛而成为研究催化H2A氧化还原 反应的重要模型酶分子之一。然而，目前所选用的蛋白质载体大都为各类碳材料(如石墨、 碳纳米管、碳纳米纤维、有序碳介孔材料以及石墨烯等)、金属氧化物(多孔氧化铝、氧化锆、 四氧化三铁等)、高分子(如壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、聚苯乙烯、聚乙烯及甲基丙烯酸甲酯 MMA)等。这些固定载体都存在一些不足之处，如虽然碳材料具有良好的导电性能、较强的吸 附能力等优点，但其是否对生物大分子会产生毒害作用从而影响到生物大分子的生物活性 目前仍不是太清楚；而金属氧化物虽具有稳定性好、机械强度高、成本低等优点，但是生物 大分子在其表面已失去原有构象，产生变性，导致固定在其表面的蛋白质(酶)失去生物活 性；天然高分子载体最大的特点是无毒性作用，但是它们存在强度较低、导电性能差、在厌 氧条件下易被微生物分解及使用寿命低等缺点；合成的有机高分子材料由于其化学、物理 性能都有很大的可变性，理论上可以担当任何一种酶的载体，而且比天然高分子化合物的 强度高，但是却存在导电性能差的缺点，这是电化学研究的最大不利因素之一。
凹土 (全称凹凸棒石粘土)是一种纳米尺寸的天然化合物，具有表面吸附效应、 浓集效应、吸附定向效应和化学活泼性效应等；凹土表面含有大量能和蛋白质(酶)反应 的-OH基团，可以大大提高和蛋白质(酶)之间的结合力；由于凹土的“沸石型的孔道”结 构，凹土具有大的比表面积和多孔结构，易于和蛋白质(酶)交联提高固定的稳定性；凹土具 有良好的生物相容性与电化学稳定性、良好的机械强度、热稳定性、耐生物降解性以及对蛋 白质(酶)的高度亲和性等特性，这些都是凹土作为蛋白质(酶)的载体并研究它们的电化学 特性的有利条件。以凹土为载体固定辣根过氧化物酶制备辣根过氧化物酶-凹土复合纳米材料，能 保持辣根过氧化物酶的天然结构和生物活性，将所得到的纳米复合材料修饰到玻碳电极表 面得到生物传感器，对过氧化氢有良好的电催化活性；本发明建立了一种基于辣根过氧化 物酶-凹土复合材料的检测细胞内H2O2的新方法，在生物电分析化学、细胞学和生理病理
学等领域有着重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内 H2O2的检测方法，以克服现有细胞水平H2O2检测方法存在的缺陷；通过对纯化凹土进行功能 化处理，得到具有生物传感功能的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料，并将其构建成生 物传感器应用于过氧化氢的检测，建立一种基于酶传感的电化学检测巨噬细胞中的H2O2的 新方法。完成上述发明任务的技术方案是
一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内H2O2的检测方法，包括以下步
骤
1)制备辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料将纯化的凹土超声分散，控制分散液的 PH值使其表面带负电荷，将凹土分散液与辣根过氧化物酶(HRP)混合，利用静电作用将表 面带正电荷的辣根过氧化物酶分子吸附到凹土表面，形成辣根过氧化物酶-凹土纳米复 合材料(HRP -Attapulgite)；
2)制备生物传感器将步骤1)制得的纳米复合材料分散成均相溶液，利用滴涂法修饰 到玻碳电极表面，制备成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器；
3)以所述的传感器为工作电极，使用计时电流法检测细胞中H202。所述的步骤1)中，辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的制备方法包括以下步 骤
1)将提纯过后的凹土加入到0.1 mol/LPBS (磷酸盐缓冲液)溶液中，控制pH值范围在 7 - 7. 5间，超声分散0. 5 - 2小时，得到0. 5 - 5 mg/mL的凹土分散液；
2)将凹土分散液与1- 10 mg/mL辣根过氧化物酶PBS溶液(pH 7-7.5)混合，在4 ° C连续搅拌0. 5 - 2小时，通过正负电荷的静电吸引作用，辣根过氧化物酶吸附到凹土表 面，形成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的悬浊液；
3)将辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料悬浊液离心处理15-30分钟，并用去离子 水洗涤，除去表面松散的酶分子，在真空干燥器中晾干，得到辣根过氧化物酶-凹土纳米 复合材料(HRP - Attapulgite)。
所述的步骤2)中，辣根过氧化物酶-凹土复合材料生物传感器的制备方法是将 玻碳电极抛光至镜面，然后在超纯水中超声清洗后晾干；将所述的辣根过氧化物酶-凹土 纳米复合材料放入0.1 mol/L的PBS溶液中(pH 7-7. 5)，得到1 mg HRP-Attapulgite / mL均相分散液，将2-10 μ L的该分散液滴加到玻碳电极表面，待溶剂挥发后即得到基于 辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器，标记为HRP-Attapulgite/GC电极。所 得到的电极不用时在4° C下保存。按照以上方法制得的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料，经红外光谱(FTIR)、 紫外光谱(Uv-vis)和圆二色谱(CD)表征证明，吸附后的酶分子仍能保持其天然的二级结 构和生物活性。在辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的红外光谱上(图1)，可以观察到固 定在凹土表面的辣根过氧化物酶，其特征峰酰胺I (1653 cnf1)和酰胺II (1640 cnf1)的 形状和位置与纯的辣根过氧化物酶(酰胺I 1653 cnf1和酰胺II 1640 cnf1)—致，说明辣 根过氧化物酶在吸附过程中没有变性，仍很好的维持了其天然的空间构象和酶催化活性。采用循环伏安法考察所述的生物传感器即HRP-Attapulgite/GC电极的电化学 性能，实验结果表明，基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的传感器具有良好的电化 学特性、电催化性能及稳定性。将HRP - Attapulgite/GC电极作为工作电极浸入0. 1 mol/L 的PBS溶液(pH 7. 4)中，以饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，螺旋Pt丝作为对电极，进行 循环伏安扫描，研究HRP分子在凹土表面的直接电化学特性及电极的稳定性。在扫描得到 的循环伏安曲线上，出现了一对峰形良好的可逆的氧化还原峰，说明负载在凹土表面的HRP 能够实现其直接电子转移；将HRP - attapulgite/GC电极在上述条件下连续扫描，氧化还 原峰的形状保持不变，该电极在4° C下保存至少二个星期后，峰电流大小几乎没有变化， 说明HRP - attapulgite/GC电极具有较好的稳定性。采用循环伏安扫描考察所述传感器对H2A的响应，将该电极放入含有0. 2 mmol/L H2O2的PBS溶液中(0. 1 mol/L, pH 7. 4)作为工作电极，以饱和甘汞电极(SCE)作为参比电 极，螺旋Pt丝作为对电极进行循环伏安扫描，出现明显的电催化还原峰，说明辣根过氧化 物酶-凹土纳米复合材料对H2O2的电化学还原具备良好的电催化性能，基于所述纳米复合 材料的传感器可有效的应用于H2A的电化学传感。细胞内H2A检测可采用计时电流法，以HRP - attapulgite/GC电极为工作电极， 首先建立辣根过氧化物酶-凹土复合材料生物传感器检测H2A浓度的工作曲线；再检测细 胞内的过氧化氢含量将细胞溶解，利用计时电流法(I -1)进行检测，根据建立的工作曲 线，得到细胞中H2O2含量。本发明具有以下优点本发明的基于酶传感的电化学检测细胞内H2A的方法，所 采用的基于辣根过氧化物酶-凹土复合材料的生物传感器具有良好的电化学特性、电催 化性能及稳定性，酶分子能保持其天然的二级结构和生物活性，对过氧化氢有良好的电催 化活性，能有效检测溶液中的H2O2，并且具备响应快、检测限低、线性范围宽、重现性好和稳 定性高等优点；该传感器能应用于细胞中H2A的检测。本发明建立了检测细胞中H2A的一 种新的基于酶传感电化学方法，在生理学、病理学的研究中具有重要意义。
图1 辣根过氧化物酶(曲线a)、凹土(曲线b)和辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材 料(曲线c)的红外光谱图。
图2 辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料对H2O2的电催化图HRP-attapulgite/GC电极在不含有H2A的PBS溶液中的循环伏安图(曲线a) ；HRP -attapulgite/GC电极在含有H2O2 (0. 2 mmol/L)的PBS溶液中的循环伏安图(曲线b);PBS 溶液(0.1 mol/L, pH 7. 4)，扫描速率100 mV/s。图3基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的电化学传感器检测H2O2的I_t 工作曲线。图4由Ι-t工作曲线得到的电流i与H2O2浓度c的线性关系。图5 基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的电化学传感器(HRP-Attapulgite/GC电极)检测细胞中H2O2浓度的I - t曲线，曲线a 无细胞时的电流信号；曲 线b 有细胞时的电流响应。
具体实施例方式实施例一
将10 g凹土在研磨机中研磨2小时，转速为800转/分；称取Ig研磨过的凹土，将其 放入100 mL超纯水中超声分散2小时后用高速离心机离心(5000转/分)，用去离子水洗 净沉降的凹土；重复超声分散、离心操作三次，将洗涤干净的凹土在80 ° C烘干12 h，得 到提纯的凹土。将0.5 mg提纯过的凹土加入到1 mL 0.1 mo 1/LPBS (pH 7. 4)溶液中，超声分散 0.5-2小时，得到0. 5 mg/mL的凹土分散液；将该凹土悬浮液与等体积的HRP的PBS溶液 (1 mg/mL, pH 7. 4)混合，在4° C连续搅拌0.5小时。将混合液在18000 rpm下离心30 min,并用二次水彻底洗涤3次，除去吸附不牢固的HRP分子，将该物质在真空干燥器中晾干 得到 HRP - Attapulgite 复合物。将玻碳电极(GC，直径为3 mm)分别用6号砂纸、0. 3 μ m和0. 05 μ m Al2O3抛 光至镜面，然后在超纯水中超声清洗30秒，晾干待用。称取Img HRP-Attapulgite复合 物分散于1 mL 0.1 mol/L的PBS CpH 7. 4)溶液中，用微量进样器取2 μ L分散液滴涂 在预处理过的玻碳电极表面，将电极放入干燥器中干燥，待电极表面的溶剂挥发后即得到 HRP - Attapulgite/GC 电极。实施例二
凹土纯化方法同实施例一。将2 mg提纯过的凹土加入1 mL 0.1 mol/LPBS(pH 7. 4)溶 液中，超声分散0. 5 - 2小时，得到ang/mL的凹土分散液；将该凹土悬浮液与等体积的HRP 的PBS溶液(5 mg/mL, pH 7. 4)混合，在4° C连续搅拌1小时。将混合液在10000 rpm下 离心20 min,并用二次水彻底洗涤3次，除去吸附不牢固的HRP分子，将该物质在真空干燥 器中晾干得到HRP - Attapulgite复合物。将玻碳电极(GC，直径为3 mm)分别用6号砂纸、0. 3 μ m和0. 05 μ m Al2O3抛 光至镜面，然后在超纯水中超声清洗30秒，晾干待用。称取Img HRP-Attapulgite复合 物分散于1 mL 0. lmol/L的PBS CpH 7. 4)溶液中，用微量进样器取2 μ L分散液滴涂在 预处理过的玻碳电极表面，将电极放入干燥器中干燥，待电极表面的溶剂挥发后即得到 HRP - Attapulgite/GC 电极。实施例三凹土纯化方法同实施例一。将5 mg提纯过的凹土加入1 mL 0. 1 mol/L PBSCpH 7.4) 溶液中，超声分散0. 5 - 2小时，得到5mg/mL的凹土分散液；将该凹土悬浮液与等体积的 HRP的PBS溶液(10 mg/mL, pH 7. 4)混合，在4 ° C连续搅拌1小时。将混合液在5000 rpm下离心15 min，并用二次水彻底洗涤3次，除去吸附不牢固的HRP分子，将该物质在真 空干燥器中晾干得到HRP - Attapulgite复合物。将玻碳电极(GC，直径为3 mm)分别用6号砂纸、0. 3 μ m和0. 05 μ m Al2O3抛 光至镜面，然后在超纯水中超声清洗30秒，晾干待用。称取Img HRP-Attapulgite复合 物分散于1 mL 0. lmol/L的PBS CpH 7. 4)溶液中，用微量进样器取2 μ L分散液滴涂在 预处理过的玻碳电极表面，将电极放入干燥器中干燥，待电极表面的溶剂挥发后即得到 HRP - Attapulgite/GC 电极。实施例四
实施例四中，除用微量进样器取5 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，其他操 作均与实例一相同。实施例五
实施例五中，除用微量进样器取10 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，其他 操作均与实例三相同。实施例六
实施例六中，除用微量进样器取5 μ L分散液滴涂在预处理过的玻碳电极表面，其他操 作均与实例二相同。实施例七
将实施例六制备的HRP - Attapulgite/GC电极放入0. 1 mol/L的PBS溶液中(pH 7.4) 进行循环伏安扫描，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为螺旋Pt丝，扫描得到循环伏安曲 线。图2中曲线a出现了一对峰形良好的可逆的氧化还原峰，其氧化峰和还原峰电位分 别为-300和-350 mV，这是由HRP分子活性中心的血红素的铁卟啉发生氧化还原反应 引起的，说明负载在凹土表面的HRP能够实现其直接电子转移；将HRP-attapulgite/GC 电极在上述条件下连续扫描(10 mV/s) 50圈，考察其稳定性，实验结果表明氧化还原峰的 形状保持不变，并且该电极在4° C下保存二个星期后，峰电流大小几乎没有变化，说明 HRP - attapulgite/GC电极具有较好的稳定性。同样，实施例1-5中制备得到的电极进行循环伏安扫描，在各自的循环伏安图上 都出现了对应于HRP分子直接电子转移的氧化还原峰，考察其稳定性也基本相似。实施例八
用0. 1 mol/L的PBS溶液(pH 7. 4)稀释30 %的H2A并用标准KMNO4溶液标定浓度为 0. 2 mmol/L ；将实施例六制备的HRP - Attapulgite/GC电极浸入到H2A溶液中作为工作电 极，以饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极，螺旋Pt丝作为对电极，在CHI 660B工作站上进 行循环伏安扫描考察该传感器对H2A的响应。扫描得到的循环伏安曲线发生巨大变化，图2中曲线b在-400 mV处出现了一个 大的还原峰，且氧化峰完全消失，这是典型的电催化反应特征，说明辣根过氧化物酶-凹 土复合材料对H2A的电化学还原具备良好的电催化性能，基于此复合物制备的传感器可有 效的应用于H2A的电化学传感。
实施例九
使用HRP - Attapulgite/GC电极通过计时电流法定量检测溶液中H2A的浓度。将实施 例六制备的HRP - Attapulgite/GC电极作为工作电极，以饱和甘汞电极(SCE)作为参比电 极，螺旋Pt丝作为对电极，在CHI 660B工作站上采集电流-时间(I-t)数据。分别将工作 电位设定为0、-100、- 200、- 300、- 400和-500 mV进行I_t扫描，实验结果表明随电位 的负移，催化电流逐渐增大，在-400 mV处出现最大值，之后噪声明显增大，信噪比降低，因 此选择-400 mV作为工作电位。在-400 mV下，连续向溶液中加入H2O2，得到I_t曲线(图 3)，以电流数值为纵坐标，H2O2浓度为横坐标，建立电流和浓度的线性关系图(图4)，实验结 果表明该传感器具有响应灵敏(2秒)、检测范围宽(0. 2到150 ymol/L)、检测限低((0. 10 士 0. 05) μ mol/L)和重现性好(2. 1%)等优点。实施例十
采用实施例六制备的HRP - Attapulgite/GC电极通过计时电流法检测巨噬细胞内 的H2O2，工作电位设为-400 mV。将IXlO6个RAW.沈4. 7细胞分散在溶液中并用100 μ L0. 2mol/L的NaOH溶液对细胞进行溶解，将传感器贴近细胞分散液液面进行检测，I --t 图(图5)上出现一个明显的还原电流，根据实施例九建立的工作曲线，得到细胞中的H2O2含 量约为4 X KTmol/cell，与文献报道的其他方法检测到的数值一致。
权利要求
1.一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内H2A的检测方法，包括以下 步骤1)制备辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料将纯化的凹土超声分散，控制分散液的 PH值使其表面带负电荷，将凹土分散液与辣根过氧化物酶混合，表面带正电荷的辣根过氧 化物酶分子吸附到凹土表面，形成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料；2)制备生物传感器将步骤1)制得的纳米复合材料分散成均相溶液，利用滴涂法修饰 到玻碳电极表面，制备成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器；3)以所述的传感器为工作电极，使用计时电流法检测细胞中H202。
2.根据权利要求1所述的细胞内H2A的检测方法，其特征在于所述的步骤1)中，辣根 过氧化物酶-凹土纳米复合材料按以下方法制备1)将提纯过后的凹土加入到0.1 mol/L PBS溶液中，控制pH值范围在7-7.5间，超 声分散0. 5 - 2小时，得到0. 5 - 5 mg/mL的凹土分散液；2)将凹土分散液与pH值7- 7. 5的1 - 10 mg/mL辣根过氧化物酶PBS溶液混合，在4 ° C连续搅拌0. 5 - 2小时，通过正负电荷的静电吸引作用，辣根过氧化物酶吸附到凹土表 面，形成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的悬浊液；3)将辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料悬浊液离心处理15-30分钟，并用去离子水 洗涤，除去表面松散的酶分子，在真空干燥器中晾干，得到辣根过氧化物酶-凹土纳米复合 材料。
3.根据权利要求1所述的细胞内H2A的检测方法，其特征在于所述的步骤2)中，辣根 过氧化物酶-凹土复合材料生物传感器的制备方法是将玻碳电极抛光至镜面，在超纯水 中超声清洗后晾干；将所述的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料加入0.1 mol/L pH值 7 - 7. 5的PBS溶液中，得到1 mg /mL均相分散液，将2 - 10 μ L的该分散液滴加到玻碳电 极表面，待溶剂挥发后即得到基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器。
4.根据权利要求1所述的细胞内H2A的检测方法，其特征在于所述的步骤3)中，首先 建立辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器检测H2A浓度的工作曲线；再利用计 时电流法采集样品的Ι-t数据，根据建立的工作曲线，得到细胞中H2O2含量。
5.根据权利要求5所述的细胞内H2A的检测方法，其特征在于所述计时电流法的工作 电位为-400 mVo
全文摘要
一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法，将辣根过氧化物酶吸附在纯化凹土表面，制备成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料；利用滴涂法将该复合材料修饰到玻碳电极表面，构建成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器；以所述的传感器为工作电极，使用计时电流法检测细胞中H2O2。本发明所采用的生物传感器对过氧化氢有良好的电催化活性，能应用于细胞中H2O2的检测，且具有响应快、线性范围宽、检测限低及重现性好等优点，建立了检测细胞中H2O2的一种新的基于酶传感的电化学方法。
文档编号G01N27/26GK102147389SQ20111006405
公开日2011年8月10日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者吴萍, 屠蕴秋, 张卉, 蔡称心 申请人:南京师范大学