专利名称：应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法
技术领域：
本发明涉及辣根过氧化物酶提取纯化的方法，尤其涉及一种应用单克隆抗 体亲和吸附技术从辣根中提取纯化辣根过氧化物酶的方法。
背景技术：
过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP， EC 1.11. 1.7)，通常来 源于辣根C4r膨racia rustica朋)(生长于欧洲和亚洲部分地区的多年生草本植 物)，因此称辣根过氧化物酶，该酶是临床检验试剂中的常用酶，不但用于 多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类实验检测等，过氧化物酶作为免疫 类显色体系的关键成分，对实验结果和相关产品质量的影响至关重要。
辣根过氧化物酶服P比活性高，性质稳定，分子量小，所以被广泛地应 用于生命科学的各个领域。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由 无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。 HRP由至少 15同功酶(A1-A3， B1-B3， Cl， C2， D， El-E6)组成，其中以辣根过氧化物酶 C (HRPC)含量最高；HRP分子量为40，000，等电点为PH3 9 (酸性(A型)， 中性(B和C型)，碱性(D和E型))，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍 有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP 的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm， 一般以0D403nm / 0D275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值 应在3.0左右(最高可达3.4)。 RZ值越小，非酶蛋白就越多。
早在80年前，HRP已经被纯化，并且被广泛应用在生物学各个领域；传统 的生产HRP的方法多是用硫酸铵和乙醇沉淀，这种方法不但产生大量废料污染 环境，酶的回收率低，纯度低，而且酶的活性在纯化过程也大大降低；在很多情况下，HRP需要通过亲和吸附或者色谱分离技术进一步纯化，曾经有学者分别
用刀豆蛋白A (Con A)和苯氧肟酸(BHA )色谱技术纯化服P，但是不能有效 避免蛋白质的非特异性结合问题(HRP是一种糖蛋白)，生产的HRP纯度不高。
发明内容
为了解决现有的HRP生产方法存在的回收率、纯度和酶活性低的技术缺陷， 本发明的目的是提供应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方 法，该方法通过单克隆抗体亲和吸附技术提取纯化辣根过氧化物酶，具有节约 时间，节约成本，不污染环境，而且纯化的辣根过氧化物酶纯度高的特点。
为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案
应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法，该方法采用针 对辣根过氧化物酶具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体与载体填料的藕联 物，通过亲和层析的方法从辣根中提取、纯化辣根过氧化物酶。
作为优选，上述的方法的步骤如下
① 采用上样缓冲液匀浆辣根，离心去除沉淀；
② 将上清夜加入到单克隆抗体与载体填料的藕联物亲和填料，室温孵育10 60分钟；
③ 采用上样缓冲液洗掉非结合杂蛋白；
采用酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物酶HRP，并迅速用中和缓 冲液中和，得到所述的辣根过氧化物酶服P。 作为再优选，上述的上样缓冲液采用PBS7.2;洗脱缓冲液采用0. 05M甘氨 酸-盐酸缓冲液，PH2.7;中和缓冲液采用lMTris-Cl， PH8. 0。作为最优选，上 述的步骤④采用酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物酶HRP的温度为20 。C。作为优选，上述的载体填料采用琼脂糖凝胶4B、琼脂糖或免疫磁珠。作为
最优选，上述的载体填料采用琼脂糖凝胶4B。
本发明由于采用单克隆抗体亲和吸附纯化HRP，不但节约时间，节约成本，
而且不会产生很多废弃物，而且，与传统方法相比，酶的活性将大大提高，符
合环境友好型和社会节约型社会建设需求。经此技术提取纯化的HRP产品质优 价廉，将具有更强的市场竞争力，也符合技术发展对HRP越来越高的品质要求， 因此，本发明将取代传统的沉淀纯化方法。
具体实施方式
实施例1 高特异性高亲和力单抗的筛选
从市场上购买针对HRP的特异性单抗，分别编号01-13，按照以下步
骤筛选
Q髙亲和力单抗筛选
单抗捕获HRP的能力测试在96孔酶标板中进行首先，用包被缓冲液 (50mM碳酸盐，PH 9.6 )将特异性单抗按照不同浓度，100yL/孔，包被 于96孔酶标板中，4 。C过夜。用PBS/Tween-20 (0.05%)洗板后，将HRP 溶液分别加入包被特异性单抗孔和空白孔，100yL/孔，37。C孵育30分钟； 再次洗涤后，加入即用型3， 3' ，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液II (Biopanda)，室温反应10分钟，每孔加100uL终止液(2M H2S04)终止反 应，通过酶标仪读取450 nm吸光值(0D4s。)，比较不同的特异性单抗的0D45。， 选取相同实验条件下，OD，较高的单抗进行抗体对酶封闭活性测试。 ②单抗对酶封闭活性测试
首先，用包被缓冲液(50mM碳酸盐，PH9.6 )将特异性单抗按照不同 浓度，10(^L/孔，包被于96孔酶标板中，4。C过夜。抗体对酶封闭活性测试也在96孔酶标板中进行，分别在包被特异性单抗和空白酶标孔中滴加
服P溶液，然后滴加100 Hl即用型TMB显色液II (Biopanda)，室温反应
10分钟，终止液(2M H2S04)终止反应，通过酶标仪读取450 nm吸光值(0045。)。
选取相同实验条件下OD，较高的的单克隆抗体，与不同载体填料藕联，进
行载体填料的筛选实验。
实施例2 单抗藕联用载体填料的筛选
本发明筛选范围主要包括琼脂糖凝胶4B，琼脂糖和免疫磁珠，筛选主要考
虑如下因素载体的藕联效率，稳定性，可循环利用次数和载体填料成本，筛 选程序如下
① 单克隆抗体与载体藕联按照各个产品说明书进行操作，单抗与载体藕联后 简称单抗藕联物。
② 藕联物吸附效力测试此项测试所选取的样品为市售HRP，主要测试单抗藕联 物吸附服P的能力。
用3倍藕联物体积的缓冲液平衡藕联物填料，取足量的HRP(溶于PBS溶液， 10mg/ml)与藕联物室温孵育1小时(或者4° C过夜)或者上藕联物层析柱； 本实验按照层析柱实验流程(柱床体积为2ml)进行上柱流速为1.0ml/min， 上样完毕，然后以同样的流速用PBS缓冲液冲洗层析柱直到PBS冲洗液不再含 有蛋白质成分，洗脱缓冲液(0. 05M甘氨酸-盐酸缓冲液，PH2. 7)洗脱HRP蛋白， 分管收集，每管lml，立即用1/10体积的中和缓冲液(lMTris-Cl， PH8. 0)中 和。分别测每管0D280吸收值，计算总蛋白量。蛋白量总量最高的为采用组
③ 稳定性测试将藕联物分别放在4 。C和37 。C四个星期，每周检测其吸附 服P能力，按照②藕联物吸附效力测试方法进行；④可循环利用次数测试本藕联物可被反复多次重复使用，用标准HRP测试其
可以有效使用次数，测试按照②藕联物吸附效力测试方法进行。
经过以上各项测试，综合成本考虑，本发明优选琼脂糖凝胶4B和单抗5 (Biopanda)藕联为最佳组合。 实施例3纯化条件的优化
通过改变洗脱液的不同离子浓度(NaCl浓度分别为0， 50mM， 100mM， 200mM， 500 mM) ， pH值(2.7， 3.0， 4.0， 5.0)和实验温度(4 。C， 20 。C， 37 。C)， 以上各项条件做正交实验，实验方案按照②藕联物吸附效力测试方法进行。并
测试比较纯化前后酶活性变化情况，酶活力测试按照以下实验方案进行
用包被缓冲液(50mM碳酸盐，PH 9.6 )将特异性单抗按照不同浓度， 100pL/ L，包被于96孔酶标板中，4 。C过夜。将上述各项条件纯化的HRP， 稀释到相同浓度，分别在包被特异性单抗和空白酶标孔中滴加5^1 HRP溶 液，然后滴加100 W即用型TMB显色液II (Biopanda)，室温反应10分 钟，终止液(2M H2S04)终止反应，通过酶标仪读取450 nm吸光值(0D45。)。 相同实验条件下，0D45。最高的实验组为条件最优实验组。
选取对酶活性影响最小的作为纯化的标准条件，标准条件为洗脱液的离 子浓度(NaCl浓度分别为50mM) ， pH值(2.7)，实验温度20 。C。 实施例4从辣根中纯化HRP的操作流程
应用是以上筛选的实验材料和优化的实验条件小规模地从辣根中纯化HRP
的基本操作流程如下
① 用上样缓冲液(PBS 7.2)匀浆样品；
② 1000rpm ， 10min离心去除沉淀；
③ 将上清夜加入到亲和填料室温孵育30分钟；④ 用上样缓冲液(PBS 7.2)洗掉非结合杂蛋白；
⑤ 洗脱缓冲液(0. 05M甘氨酸-盐酸缓冲液，PH2. 7)解离被捕获的HRP，并迅 速用中和缓冲液(1M Tris-Cl， PH8. 0)中和;
⑥ 纯化得到的HRP的质量分析 HRP酶的活性检测分析；
用包被缓冲液(50mM碳酸盐，PH9.6 )将特异性单抗按照1 u g/ml浓 度，100uL/孔，包被于96孔酶标板中，4。C过夜。将HRP (SHINGENE)与 以上步骤纯化的HRP，稀释到不同浓度，分别在包被特异性单抗和空白酶标 孔中滴加5WHRP溶液，然后滴加100 W即用型TMB显色液II (Biopanda)， 室温反应10分钟，终止液(2M H2S04)终止反应，通过酶标仪读取450 nm吸 光值(0D45。)。相同实验条件下，以上纯化的HRP的0D45。高于HRP(SHINGENE)。
HRP产物的RZ值(OD403/OD275)测定；
RZ值(0D403/0D275) 二3. 15。
权利要求
1. 应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法，其特征在于该方法采用针对辣根过氧化物酶具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体与载体填料的藕联物，通过亲和层析的方法从辣根中提取纯化辣根过氧化物酶。
2. 根据权利要求1所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法，其特征在于该方法的步骤如下① 采用上样缓冲液匀浆辣根，离心去除沉淀；② 将上清夜加入到单克隆抗体与载体填料的藕联物亲和填料，室温孵育10 60分钟；③ 采用上样缓冲液洗掉非结合杂蛋白；④ 采用酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物酶HRP，并迅速用中和缓 冲液中和，得到所述的辣根过氧化物酶服P。
3. 根据权利要求2所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法，其特征在于上样缓冲液采用PBS 7.2;洗脱缓冲液采用0. 05M甘氨 酸-盐酸缓冲液，PH2.7;中和缓冲液采用1M Tris-Cl， PH8.0。
4. 根据权利要求3所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法，其特征在于步骤④采用酸性洗脱缓冲液解离被捕获的辣根过氧化物 酶HRP的温度为20°C。
5. 根据权利要求1或2所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物 酶的方法，其特征在于载体填料采用琼脂糖凝胶4B、琼脂糖或免疫磁珠。
6. 根据权利要求5所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法，其特征在于载体填料采用琼脂糖凝胶4B。
7. 根据权利要求1或2所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物 酶的方法，其特征在于针对辣根过氧化物酶具有高特异性和高亲和力单克隆抗体的选取方法由高亲和力单抗筛选和单抗对酶封闭活性测试组成。
8. 根据权利要求7所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法，其特征在于高亲和力单抗筛选方法如下① 市场采购针对HRP的特异性单抗；② 用包被缓冲液50mM碳酸盐，PH 9.6，将特异性单抗按照不同浓度， 100uL/孔，包被于96孔酶标板中，4"过夜；③ 用PBS/Tween-20，洗板后，将HRP溶液分别加入包被特异性单抗孔和 空白孔，100uL/孔，37 。C孵育30分钟；④ 再次洗涤后，加入即用型3， 3， ，5， 5，-四甲基联苯胺TMB，显色液 II，室温反应10分钟，每孔加100uL终止液2M H2S04终止反应，通 过酶标仪读取450 nm吸光值0D45。；⑤ 比较不同的特异性单抗的0D4s。，选取相同实验条件下，0D45。较高的单 抗进行抗体对酶封闭活性测试。
9. 根据权利要求7所述的应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的 方法，其特征在于单抗对酶封闭活性测试方法如下① 用包被缓冲液50mM碳酸盐，PH 9.6，将特异性单抗按照不同浓度， 100uL/孔，包被于96孔酶标板中，4。C过夜；② 抗体对酶封闭活性测试也在96孔酶标板中进行，分别在包被特异性 单抗和空白酶标孔中滴加HRP溶液；(D然后滴加IOO W即用型TMB显色液II，室温反应10分钟，终止液2M H2S04终止反应，通过酶标仪读取450 nm吸光值0D45。； ④选取相同实验条件下0D45。较高的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及辣根过氧化物酶提取纯化的方法，尤其涉及一种应用单克隆抗体亲和吸附技术从辣根中提取纯化辣根过氧化物酶的方法。应用单克隆抗体亲和吸附技术提取辣根过氧化物酶的方法，该方法采用针对辣根过氧化物酶具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体与载体填料的藕联物，通过亲和层析的方法从辣根中提取、纯化辣根过氧化物酶。本发明采用单克隆抗体亲和吸附纯化HRP，不但节约时间，节约成本，而且不会产生很多废弃物，而且，与传统方法相比，酶的活性将大大提高，符合环境友好型和社会节约型社会建设需求。经此技术提取纯化的HRP产品质优价廉，将具有更强的市场竞争力，也符合技术发展对HRP越来越高的品质要求，因此，本发明将取代传统的沉淀纯化方法。
文档编号C12N9/08GK101531998SQ20091009790
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月23日 优先权日2009年4月23日
发明者关义海, 费小战, 阎可廷 申请人:湖州英创生物科技有限公司