专利名称：一种检测体液中多肽的方法
技术领域：
本发明涉及多肽的检测方法，具体地说是一种利用质谱对体液中多肽进行检测的方法。
背景技术：
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted Iaserdesorption lionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术，是近年来飞速发展的蛋白质组学技术之一，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学研究与临床重大疾病预警和辅助诊断等提供快速、高同量的分析测试手段，同时也是一种很好的筛选疾病的分子标记方法。目前的相关研究大多是多维色谱分离与电喷雾离子化源(ESI源)质谱分析联用的应用研究，而对于基质辅助激光解析电离(MALDI)源质谱而言，由于每次实验中样本分离程度、样品在靶上的结晶状况和肽段离子化效率等因素的不同导致实验结果的重现性差，限制了本技术在临床医学实验室的广泛应用。马里兰大学Catherine Fens Lau博士在研究报告中指出“质谱是一个定性的技术，不是一个定量的技术。”因为不管是ESI或MALDI离子源，由于分子结构的差异，导致质谱的峰高并不和蛋白量有绝对的关系，同等量不同的蛋白分子，在质谱上的响应是不同的。到目前为止，还没有能够有效定量检测血清多肽技术的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述不足提供一种检测体液中多肽的方法。本发明的另一个目的在于提供用于上述检测体液中多肽的内标。本发明检测体液中多肽的方法是在体液样本中加入已知浓度和质荷比峰的同位素标记多肽作为内标，利用质谱仪检测样本，根据内标检测目标多肽的浓度。所述体液可以是血清、尿液或者是组织液等等。所述质谱仪优选为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。尽管生物质谱具有较高的检测灵敏度，但是其检测能力受复杂环境中高丰度的干扰物质所限制。为此，本发明方法优选还包括采用SPE-C磁珠对血清进行富集。上述内标可以加入到经SPE-C磁珠富集处理后的样本中，或者直接加入到血清中，然后在经SPE-C磁珠富集处理。前一种方式相对于后一种方式简单更容易实现，并且更容易实现内标和血肽谱峰共同存在，且强度合适。内标实际上可用两种方式来修饰，同位素修饰或者基团修饰，在样本中肽与内标肽重合的情况下，同位素修饰的内标对血清多肽的定性和定量起到指导性作用。内标肽加基团化修饰也可以，但是基团修饰内标打质谱后可能出现不稳定的因素。相比来说，同位素修饰更加稳定一些，因此在本发明中方法中采用了同位素标记。上述同位素标记可以是13C或者是1N或者是两者的结合，同位素标记的位点可以
3是多肽上的任何氨基酸。内标可以是一个或几个经同位素标记的多肽，具体可以与血清中待检的多肽相适应。进而，本发明还提供一种用于上述体液多肽检测的内标，其是由一个或几个同位素标记的多肽组成，这些多肽的浓度和质荷比峰是已知的。优选所述多肽为血清中固有多肽的同位素标记多肽，其质荷比峰位于待检样本多肽指纹图谱无干扰区域。例如，根据待检多肽设计的其同位素标记多肽。内标的设计，可以采用如下方式进行1、插空式，即在已有多肽数据基础上，查看哪些区域没有固有多肽影响，则设计该分子量区间的内标(即内标多肽位于体液多肽指纹图谱的无干扰区域)。2、血肽里本身存在的肽，且已经鉴定成功的肽(即用血清多肽中的多肽经同位素标记后作为内标)。在本发明一个实施例中，选择血肽中存在并已经鉴定的多肽NLGHGHKHERDQGHGHQ 作为内标肽，同位素标记在四个直链氨基酸G。进一步还可以将上述内标制备成各种检测试剂盒，以方便使用。本发明通过在体液样本中添加同位素标记内标，在MALDI-T0F线性采集数据时， 外标校正后，用内标再次校正，使得肽谱中各个峰值更加准确，避免分子量的漂移；同时，可以对肽谱中各个峰进行相对定量，解决了体液多肽难以定量检测的问题。
图1是经标准品外标校正后的质谱图，其平均分子量偏差小于IOOppm ；图2是Mr = 1943. 65Da内标自检质谱图；图3是血清+内标检测质谱图；图4多肽1943. 65的相对强度与浓度的关系。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1实验目的把1943. 65作为内标进行校正，优化系统重复性和稳定性。实验材料(1) ^S^ifil^ BD Vacutainer SST ( ‘tiger—top，)tube (Becton Dickinsoncat. no. 367988)(2)聚丙烯EP管(适用于_80°C )(3)枪头 Eppendorf standard tips(4)排管 Eppendorf safe-lock(5)分装瓶或管 Eppendorf safe-look, Biozym PCR tubes (#710950)
(6)溶剂瓶 Nalgene FEP (Teflon) bottles(7)MTPs Greiner PP，natural，MTP(8) 0. 1% TFA (色谱级)！强腐蚀性IulTFA加入到IOOOul Milli-Q水中，混合均勻(9) 100% 丙酮 Acetone (色谱级)J. K. Baker LOT NO. E32E11(10) 100 % 乙醇 Ethanol (色谱级)J. K. Baker LOT NO. E39B24(11) 100% 乙腈 Acetonitrile(12) IOmM 醋酸铵 Ammonium acetate (色谱级)(13) 77mg 醋酸铵溶解于 100ml Milli-Q 水中(14)Peptide Calibration Standard(夕卜 +示)Bruker Daltonik ；cat. no. 206195 ； Protein Calibration Standard I (夕卜f示)BrukerDaltoriik ;cat· no· 206355(15) Human serum(人血清)(Sigma ；cat. no. S7023)(16)磁珠SPE-C弱阳离子磁珠试剂盒毅新兴业(北京)科技有限公司(17) α -Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA)Bruker Daltonik ；lg#201344， 5g#203072(18)AnchorChip 600um #209514仪器和设备(1)离心机(Bioyong)(2)移液器(Eppendorf)(3)磁架 Robotic separation device for 96 microtiter flate formatMagnetseparator(Bruker Daltonik)(4)质谱仪autoflexTMII (Bruker Daltonik)(5) ^ $ JiE zF l/l labconco Centrivap Centrifugal Concentratots andCold Traps(6)相关软件数据采集FlexControl 2. 2 ；看图软件FlexAnalysis3. O ；分析软件 ClinPro^Tools 2. 1 (Bruker DALT0NICS 公司)实验条件(1)样品类型合成多肽 1943. 65Da NLGHGHKHERDQGHGHQ(2)质谱仪microflex，德国 Bruker(3)分析软件FlexAnalysis3. 0，德国 Bruker(4)采集参数采样激光在10% 20%，每50shots采一张图共累加4张图， 200shots，采集范围 800-10000Da实验步骤(1)缓慢地上下振荡采血管5次，使血液中的凝结块混勻。室温(25°C )垂直放置 1小时，使血液凝结。(血液必须精确凝结1小时，否则，样品凝结时间不同会人为地导致肽谱不同。)室温下，用临床离心机以1. 400-2. OOOg离心SST管10分钟。吸取上清液(血清)到对应的已标记样品管中。立即冻存血清样品于-80°C冰箱。避免反复冻融。(2)从4°C冰箱中取出SPE-CM磁珠悬浮液一管，反复倒置，使磁珠完全、均勻的悬浮于液相中。在200ul样品管中加入2ul SPE-CM磁珠混悬液，95ul SPE_CB、5ul血清(步骤1血清)，反复吸打数次，使磁珠与SPE-CB、血清混合均勻，室温静置5min。将样品管置于磁珠分离器上，使磁珠贴壁lmin，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体。将上步中的样品管从磁珠分离器上移走，并在上述样品管中加入IOOul SPE-CW，反复吸打数次，使磁珠与SPE-CW混合均勻，室温静置aiiin。将样品管转移到磁珠分离器上，使磁珠贴壁lmin， 磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体。将样品管从磁珠分离器上移走，并在上述样品管中加入IOul SPE-CE (由SPE-CE 1、SPE-CE2组成)，反复吸打10次之上，使磁珠与SPE-CE 混合均勻，室温静置5min，得样品洗脱液。(3)取5. Oul的0. 4mg/ml HCCA基质于200ul样品管，加入1. Oul的样品洗脱液和 l.Oul lOOfmol/ul内标(可根据样品、结晶、温湿度等适当调节洗脱液量)，用加样枪反复吸打10次以上混合均勻，取Iul上述混合液体，点在600umAnchOrchip样品位置上，室温放置至干燥无液体残留。实验结果如图1所示，通过标准品外表校正，平均分子量偏差小于lOOppm。如图2所示， 1943. 65Da的内标自检结果的荷质比为1943. 55，与理论结果基本相符。如图3所示，将内标添加到血清中，其在1943. 5处形成了一个显著的峰。实施例2实验目的及原理合成1943. 65的同位素峰1947. 65，利用内标进行多肽定量。f = (As/ms) / (Ar/mr)其中As和Ar分别为内标物和其同位素的峰强度，ms和mr 分别为加入内标物和其同位素的量。再取各品种项下含有内标物的待测组分溶液进样，记录质谱图，再根据含内标物的待测组分溶液峰强度，计算含量(mi) :mi = fXAi/(As/ms), 其中Ai和As分别为供试品和内标物的峰强度，ms为加入内标物的量。实验步骤(1)缓慢地上下振荡采血管5次，使血液中的凝结块混勻。室温(25°C )垂直放置 1小时，使血液凝结。(血液必须精确凝结1小时，否则，样品凝结时间不同会人为地导致肽谱不同。)室温下，用临床离心机以1. 400-2. OOOg离心SST管10分钟。吸取上清液(血清)到对应的已标记样品管中。立即冻存血清样品于-80°C冰箱。避免反复冻融。(2)从4°C冰箱中取出SPE-CM磁珠悬浮液一管，反复倒置，使磁珠完全、均勻的悬浮于液相中。在200ul样品管中加入2ul SPE-CM磁珠混悬液，95ul SPE-CB、5ul血清，反复吸打数次，使磁珠与SPE-CB、血清混合均勻，室温静置5min。将样品管置于磁珠分离器上，使磁珠贴壁lmin，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体。将上步中的样品管从磁珠分离器上移走，并在上述样品管中加入IOOul SPE-CW，反复吸打数次，使磁珠与SPE-CW 混合均勻，室温静置anin。将样品管转移到磁珠分离器上，使磁珠贴壁lmin，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体。将样品管从磁珠分离器上移走，并在上述样品管中加入IOul SPE-CE (由SPE-CE 1、SPE-CE2组成)，反复吸打10次之上，使磁珠与SPE-CE混合均勻，室温静置5min，得到样品洗脱液。(3)取5. Oul的0. 4mg/ml HCCA基质于200ul样品管，加入1. Oul的样品洗脱液和 0. 5ul 200fmol/ul 的同位素内标多肽 1947. 65，以及 0. 5ul50fmol/ul 的 1943. 65 得到样品1，并按此方法分别配置加入0. 5ul浓度为100fmol/ul、200fmol/ul、400fmol/ul和800fmol/ulU600fmol/ul的1943. 65的样品2 6，用加样枪反复吸打10次以上混合均勻， 取Iul上述混合液体，点在600um Anchorchip样品位置上，室温放置至干燥无液体残留，分别对样品1 6进行测定。实验条件可用的同位素标记包括C13/m5，标记位点可以是多肽序列中的任何氨基酸。综合成本以及合成的难易程度，选择15N作为标记以及较易合成的直链氨基酸(G、L)为添加位点较佳。NLGHGHKHERDQGHGHQ中，有4个G位点1个L位点，选作4个G位点来合成普肽以及同位素肽。最终，合成的内标多肽序列为NLGHGHKHERDQGHGHQ，在4个G位点分别添加 15N同位素标记，该内标多肽的m/z为1943. 65Da和1947. 65Da。(1)样品类型合成多肽 1943. 65Da 和 1947. 65Da(2)质谱仪microflex，德国 Bruker(3)分析软件FlexAnalysis3. 0，德国 Bruker(4)采集参数采样激光在10% 20%，每50shots采一张图共累加4张图， 200shots，采集范围 800-10000Da实验结果结果表明，1943Da和1947Da可以清晰的分别检测到，说明灵敏度和分辨率可以达到内标的基本要求。如图4所示，通过本发明方法可以检测到低至2pmol/Ul的多肽。
权利要求
1.一种检测体液中多肽的方法，其特征在于，在体液样本中加入已知浓度和质荷比峰的同位素标记多肽作为内标，利用质谱仪检测样本，根据内标检测目标多肽的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述体液为血清、尿液或组织液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体液为血清时还包括采用SPE-C磁珠对血清进行富集。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱仪为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同位素标记多肽是根据待检目标多肽添加同位素标记得到。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述同位素标记为13C或15N。
7.一种用于权利要求1 6任一项所述方法的内标，其为1个或几个已知浓度和质荷比峰的同位素标记多肽。
8.如权利要求7所述的内标，其特征在于，所述多肽为血清中固有多肽的同位素标记多肽，其质荷比峰位于待检样本多肽指纹图谱无干扰区域。
9.如权利要求7或8所述的内标，其特征在于，所述同位素标记为13C或％。
10.含有权利要求7 9任一项所述内标的检测试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种检测体液中多肽的方法，其在体液样本中加入已知浓度和质荷比峰的多肽作为内标，利用质谱仪检测样本，根据内标检测目标多肽的浓度。本发明还提供了用于该方法的内标以及含有该内标的检测试剂盒。本发明通过在体液样本中添加同位素标记内标，在MALDI-TOF线性采集数据时，外标校正后，用内标再次校正，使得肽谱中各个峰值更加准确，避免分子量的漂移；同时，可以对肽谱中各个峰进行相对定量，解决了体液多肽难以定量检测的问题。
文档编号G01N27/64GK102331453SQ201110095778
公开日2012年1月25日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者侯玲玲, 卓国银, 张海燕, 张燕, 李燕, 赵艳梅, 邢双艳, 马庆伟 申请人:毅新兴业(北京)科技有限公司