专利名称：一种基于气相色谱-质谱技术进行血清代谢组学研究的方法
技术领域：
本专利涉及一种在适用于气相色谱-质谱技术进行血清代谢组学研究的方法，可以进行非目标性的代谢组学仪器分析；对实验样本进行代谢组学数据分析。
背景技术：
代谢组学是通过比较对照组和实验组的代谢组(metabolomes，某一生物的所有代谢物组分)，以寻找其它代谢谱差异的研究方法。这些差异可能与临床生物标志物发现中研究的某些疾病相关，也可能与药物研发毒理研究中候选药物摄入后的代谢改变有夫。环境代谢组学在研究化学品接触对野生生物和环境的影响方面日益受到重视。在农业/化工领域，代谢组学可用于除草剂和杀虫剂的开发。代谢组学谱型分析与基因表达研究或蛋白质组学分析这些只掲示细胞中发生的·一部分行为的研究不同，它能描述某ー时刻细胞的完整生理状态。更重要的是，如果能把蛋白质组学、转录组学和代谢组学的数据整合在一起(ー种称为系统生物学的整合性研究思路和方法)，将获得生命有机体生物学更完整的图像。质谱(MS)因具有广泛的动态范围、能进行可重现的定量分析，而且能够分析非常复杂的生理体液，已被用于代谢组学的研究中。由于这类样品的复杂性，为了尽可能多地检测代谢物，在质谱分析之前常常还要进行分离(气相色谱、液相色谱或毛细管电泳)。气相色谱和质谱(GC/MS)是分析挥发性化学物质的有效组合。气相色谱使用运载气推动分析物通过涂溃的熔融石英毛细管。基于分析物在气相和毛细管内涂层之间的不同分配实现分离。GC/MS要求分析物能够挥发，以便在毛细管中进行迁移。因此，分析物必须具有挥发性，或能够经过化学衍生具有挥发性。例如植物萜烯和精油。游离脂肪酸经过衍生后，也可以用GC/MS进行分析。气相色谱具有高色谱分离度，对于游离脂肪酸的分析，GC/MS比别的方法灵敏度更高。
发明内容
本发明的目的是适用于气相色谱-质谱技术进行血清代谢组学研究的方法，可以进行非目标性的代谢组学仪器分析；对实验样本进行代谢组学数据分析，并且由于对步骤进行了合并，减小了样本处理过程带来的误差。本发明采用的技术方案是样本制备准确移取40 μ I冰水解冻的血清样本至EP管，加入120 μ I色谱甲醇，涡旋30s后静置30min(4°C )，20000g离心15min(4°C )，取120 μ I上清液至高回收率样品瓶中，温和氮气吹干，加入80 μ I的15mg/ml甲氧胺吡啶溶液，涡旋震荡30s，于37°C反应90min，然后加入80 μ I BSTFA试剂(含I % TMCS)，70°C下反应60分钟后进行GC/MS分析。GC/MS分析本实验的仪器分析平台为Agilent 7890A GC/5975C MS系统，毛细管色谱柱为 Agilent J& W Scientif ic 公司的 HP-5MS (30mX 250 μ m i.cL)。仪器參数设定为进样ロ温度270°C，EI离子源温度230°C，四极杆温度150°C，载气为氦气，不分流进样，进样量I. O μ I。升温程序为初始温度70°C，维持2min，10°C/min的速度升至140°C，4°C/min的速度升至240°C，最后以10°C /min的速度升至300°C并保持8min。采用全扫描形式进行质谱检测，质谱检测范围为50-600 (m/z)。数据分析内容⑴提取代谢组学原始数据；⑵通过多维统计分析可视化地显示不同组之间的代谢谱差异；(3)不同组分之间的代谢谱差异及造成差异的特征性代谢物；
(4)不同组分之间的代谢谱差异及造成差异的特征性代谢物。本发明与现有技术相比的优点是I.非目标性地对所有代谢物进行研究，避免了传统分析研究的片面性，体现了系统性和整体性特征；2.独创了微量检测技术，仅需要当前代谢组学样本需求量的20%甚至更低，填补·了国内空白，在国际上居于领先地位；3.开发了处理大样本代谢组学复杂数据处理技术，去除了噪音干扰；实施方式具体方法描述如下I.准确移取40 μ I冰水解冻的血清样本至EP管，加入120 μ I色谱甲醇2.涡旋 30s 后静置 30min(4°C )，2OOOOg 离心 15min(4°C )3.取120 μ I上清液至高回收率样品瓶中，温和氮气吹干，加入80μ I的15mg/ml甲氧胺吡啶溶液，涡旋震荡30s，于37で反应90min4.加入80 μ I BSTFA试剂(含I % TMCS)，70°C下反应60分钟后进行GC/MS分析。5.GC/MS仪器參数为进样ロ温度270°C，EI离子源温度230°C，四极杆温度150°C，载气为氦气，不分流进样，进样量I. O μ I。升温程序为初始温度70°C，維持2min，IO0C /min的速度升至140°C，4°C /min的速度升至240°C，最后以10°C /min的速度升至300°C并保持8min。采用全扫描形式进行质谱检测，质谱检测范围为50-600 (m/z)。6.对仪器产生的数据进行数据分析,在R软件(www. r-project. org/)平台下采用自写的程序代码提取原始数据信号，然后导入TagFinder软件进行质谱碎片的保留时间校正、峰对齐和反卷积分析，所有參数均为缺省设置，最后在EXCEL软件中进行后期编辑，将结果组织为ニ维数据矩阵，包括变量(rt_mz)、观察量(样本)和积分面积。在进行正式统计分析前，对样本的质谱信号总积分面积进行归ー化，即每个样本的总积分面积均归一化到1000。最后，将归ー化的数据导入Simca-P软件(版本11. 5)分别进行主成分分析(PCA)、偏最小ニ乘方判别分析(PLS-DA)和正交偏最小ニ乘方判别分析(OPLS-DA)。以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。
权利要求
1.一种适用于相色谱-质谱技术的血清代谢组学研究的方法，其特征在于 步骤I :样本制备准确移取40 μ I冰水解冻的血清样本至EP管，加入120 μ I色谱甲醇，涡旋30s后静置30min (4°C )，20000g离心15min (4°C )，取120 μ I上清液至高回收率样品瓶中，温和氮气吹干，加入80 μ I的15mg/ml甲氧胺吡啶溶液，涡旋震荡30s，于37 V反应90min，然后加入80 μ I BSTFA试剂(含I % TMCS)，70°C下反应60分钟后进行GC/MS分析。
步骤2 :本实验的仪器分析平台为Agilent 7890A GC/5975C MS系统，毛细管色谱柱为 Agilent J& W Scientific 公司的 HP-5MS (30mX 250 μ m i. cL )。仪器参数设定为进样口温度270°C，EI离子源温度230°C，四极杆温度150°C，载气为氦气，不分流进样，进样量I.O μ I。升温程序为初始温度70°C，维持2min，10°C /min的速度升至140°C，4°C /min的速度升至240°C，最后以10°C /min的速度升至300°C并保持8min。采用全扫描形式进行质谱检测，质谱检测范围为50-600 (m/z)。
步骤3 :进数据分析内容(I)提取代谢组学原始数据；(2)通过多维统计分析可视化地显示不同组之间的代谢谱差异；(3)不同组分之间的代谢谱差异及造成差异的特征性代谢物；(4)不同组分之间的代谢谱差异及造成差异的特征性代谢物。
2.数据分析方法流程 在R软件平台下采用自写的程序代码提取原始数据信号，然后导入TagFinder软件进行质谱碎片的保留时间校正、峰对齐和反卷积分析，所有参数均为缺省设置，最后在EXCEL软件中进行后期编辑，将结果组织为二维数据矩阵，包括变量(rt_mz)、观察量(样本)和积分面积。在进行正式统计分析前，对样本的质谱信号总积分面积进行归一化，即每个样本的总积分面积均归一化到1000。最后，将归一化的数据导入Simca-P软件(版本11. 5)分别进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘方判别分析(OPLS-DA)。
全文摘要
一种适用于相色谱-质谱技术的血清代谢组学研究的方法，可以根据不同要求，采用气相色谱-质谱代谢组学平台对实验样本进行非目标性的代谢组学分析，并对产出的数据代谢组学数据分析。数据分析内容主要包括(1)提取代谢组学原始数据；(2)通过多维统计分析可视化地显示不同组之间的代谢谱差异；(3)不同组分之间的代谢谱差异及造成差异的特征性代谢物；(4)不同组分之间的代谢谱差异及造成差异的特征性代谢物。
文档编号G01N30/88GK102830193SQ20111016289
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者曾华宗 申请人:上海聚类生物科技有限公司