专利名称：一种检测单胺氧化酶含量的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检验测定技术领域，具体的说是涉及一种检测单胺氧化酶含量的方法和试剂盒。
背景技术：
单胺氧化酶(monoamine oxidase, ΜΑΟ)为催化单胺氧化脱氨反应的酶。也称为含黄素胺氧化酶，可使儿茶胺类神经递质失活的酶，可用作抗抑郁症药物。血清单胺氧化酶的活性高低能反映肝纤维化的程度，是诊断肝硬化的重要指标。肝硬化患者血清单胺氧化酶活性升高的阳性率在80%以上，最高值可超过对照参考值的两倍，而且血清单胺氧化酶活性升高与肝表面结节形成的进程相平行。各型肝炎急性期患者血清单胺氧化酶活性不增高，但暴发性重症肝炎或急性肝炎中有肝坏死时，由于线粒体破坏，血清单胺氧化酶活性可升高。单胺氧化酶活性升高还可见于甲亢、糖尿病合并脂肪肝、充血性心衰、肢端肥大症等疾病。目前，血清单胺氧化酶的测定方法有很多，包括荧光法、免疫抑制法和化学光度法。荧光测定法是以色胺作为底物，经MAO催化脱氨生成吲哚乙酸，后者经醛脱氢酶作用生产吲哚乙醛，并使其辅酶NAD+还原为NADH，用280nm的激发波长于370nm处测定荧光度。 免疫抑制法是用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，向包被抗MAO抗体的微孔中依次加入样品或标准品、生物素化的抗MAO抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的MAO呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，计算样品浓度。化学光度法是以无色苄胺为底物，经MAO氧化生成苄醛，再与2，4- 二硝基苯胼生成醛苯腙，后者在碱性环境下呈棕红色，且颜色的深浅和样品中的MAO呈正相关。然而，上述方法操作步骤繁琐、检测仪器和试剂昂贵，不适合作为常规生化检验项目在临床上应用。随着各种半、全自动生化分析仪的普遍应用，近年来研制出酶比色法测定单胺氧化酶，它的反应原理为胺类化合物+水+氧单絲化豸_相应醛类产物+氨+过氧化氢过氧化氢+二氧化碳+乙酸磷酸丙嗣酸氧化酶,磷酸根+丙酉同酸+氧+水
WX)8]丙酮酸+还原型辅酵+曱胺N-甲基丙氣酸脱氣酵,N-曱基丙氨酸+水+辅酵 然后，在340nm波长下测定还原型辅酶NADH吸光度每分钟的下降速度，计算出单胺氧化酶的浓度。这种测定单胺氧化酶的方法广泛适用于各种半、全自动生化分析仪的普遍应用被广泛应用。然而上述测定方法需经过氧化氢路线测定丙酮酸的浓度，过氧化氢稳定性差，致使检测结果准确性降低
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种准确性高的检测单胺氧化酶含量的方法和试剂
品.O为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种检测单胺氧化酶的方法，为在pH8. 8 9. 0缓冲液中，胺类化合物在待测样品中的单胺氧化酶的作用下发生氧化反应生成氨，生成的氨在谷氨酸脱氢酶作用下与α-酮戊二酸反应消耗还原型辅酶；在340nm波长下检测并记录反应液中还原型辅酶吸光度变化速率，计算待测样品中单胺氧化酶的含量。本发明所述检测方法胺类化合物在待测样品中的单胺氧化酶的作用下发生氧化反应生成氨，生成的氨在谷氨酸脱氢酶作用下与α “酮戊二酸反应消耗还原型辅酶，生成谷氨酸和氧化型辅酶。反应式为
权利要求
1.一种检测单胺氧化酶含量的方法，其特征在于，在pH8. 8 9. 0的缓冲液中，胺类化合物在待测样品中的单胺氧化酶的作用下发生氧化反应生成氨，生成的氨在谷氨酸脱氢酶作用下与α -酮戊二酸反应消耗还原型辅酶；在340nm波长下检测并记录反应液中还原型辅酶吸光度变化速率，计算待测样品中单胺氧化酶的含量。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，还包括过量的乳酸脱氢酶与待测样品混合，催化内源性丙酮酸发生还原反应。
3.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述乳酸脱氢酶的浓度为3000 5000U/L。
4.根据权利要求1或2所述检测方法，其特征在于，所述胺类化合物的浓度为15 20mmol/L。
5.根据权利要求1或2所述检测方法，其特征在于，所述谷氨酸脱氢酶的浓度为 1500 3000U/L。
6.根据权利要求1或2所述检测方法，其特征在于，所述胺类化合物与α-酮戊二酸的摩尔比为1 1. 0 1 1. 2。
7.根据权利要求1或2所述检测方法，其特征在于，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
8.根据权利要求1或2所述检测方法，其特征在于，所述胺类化合物为苄胺、组胺、丁胺基、戊基胺或β-苯乙基胺。
9.一种检测单胺氧化酶含量的试剂盒，其特征在于，包括80 200mmOl/LpH8. 8 9. 0 的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、15 20mmol/L胺类化合物、1. 0 1. 5mmol/L还原型辅酶、10 20mmol/L α -酮戊二酸和1500 3000U/L谷氨酸脱氢酶。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，还包括3000 5000U/L乳酸脱氢酶。
全文摘要
本发明涉及医学检验测定技术领域，公开了一种检测单胺氧化酶的方法和试剂盒。本发明提供的检测单胺氧化酶的方法不经过氧化氢路线，利用谷氨酸脱氢酶作用测定与氨反应的还原型辅酶的下降速度计算单胺氧化酶的含量，提高检测结果的准确性。本发明所述检测方法还包括过量的乳酸脱氢酶与待测样品混合，在反应延迟期消除样品内源性丙酮酸，使还原型辅酶达到一个平衡，提高了单胺氧化酶检测的准确性。本发明所述试剂盒稳定性好，保存期长，应用本发明所述试剂盒检测结果准确性高、精密度好、线性范围宽。本发明所述试剂盒适用范围广，便于推广使用，可应用于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中单胺氧化酶含量。
文档编号G01N21/33GK102262066SQ201110162610
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月16日 优先权日2011年6月16日
发明者董理 申请人:董理