专利名称：检测玉米赤霉烯酮药物的酶联免疫试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测玉米赤霉烯酮药物的酶联免疫试剂盒及其应用。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(结构式见图I)主要由禾谷镰刀菌产生，粉红镰刀菌、窜珠镰刀菌、三线镰刀菌等多种镰刀菌也能产生这种毒素，许多农作物如小麦、大豆等植物中存在玉米赤霉烯酮，玉米赤霉烯酮是一种酚的二羟基苯酸的内酯结构，分子式为C18H22O5tl，它不溶于水、二硫化碳和四氧化碳，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯和酸类，微溶于石油醚。玉米赤霉烯酮不但可以由霉菌产生，而且在许多高等植物体内也存在，并且是 作为植物体内的一种激素来调控植物的生长，利用玉米赤霉烯酮可以提高玉米幼苗的抗旱和抗寒能力，但是玉米赤霉烯酮具有雌激素的作用，其强度为雌激素的十分之一，可造成家禽和家畜的雌激素水平提高。目前发现，猪对此毒素较为敏感，玉米赤霉烯酮作用的靶器官主要是雌性动物的生殖系统，同时对雄性动物也有一定的影响，在急性中毒的条件下，对神经系统、心脏、肾脏、肝和肺都会有一定的毒害作用，主要的机理是它会造成神经系统的亢奋，在脏器当中造成很多出血点，使动物突然死亡。一般玉米赤霉烯酮中毒的直接原因是饲料中有霉变的特别是由赤霉污染的玉米、小麦、大豆等。所以，在使用这些原料为主的饲料时就应当注意检测，目前，对动物玉米赤霉烯酮中毒尚无特效药治疗，生产中应立即停止饲喂可疑饲料，并对饲料加以检测，确定饲料中是否含有玉米赤霉烯酮。目前玉米赤霉烯酮的测定方法主要有气相色谱、高效液相色谱法等，仪器测定方法灵敏度高，但样品前处理繁琐，仪器昂贵、需要专业的操作人员，在实际应用中受到一定的限制，通常作为确定性的定量检验方法，因此急需建立一种高灵敏度，并且能够现场抽样快速筛选检验方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种检测玉米赤霉烯酮的酶联免疫试剂盒，本发明酶联免疫试剂盒操作简单，耗时少，可用于饲料样本中玉米赤霉烯酮药物的快速检测，尤其适合现场大批量样品的筛选检测。一种检测玉米赤霉烯酮的酶联免疫试剂盒，包括包被原和酶标记物,所述包被原选自玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物、玉米赤霉烯酮抗体和抗抗体；当所述包被原为玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为玉米赤霉烯酮抗体时，所述酶标记物为酶标半抗原与载体蛋白的偶联物；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物；所述玉米赤霉烯酮半抗原是将玉米赤霉烯酮和盐酸羟胺缩合反应，再与琥珀酸酐通过缩合反应得到的。本发明的另外一个目的是提供一种玉米赤霉烯酮抗体和生产制备这种抗体的方法。所述的玉米赤霉烯酮抗体对游离或蛋白等结合玉米赤霉烯酮有结合特异性。所述的玉米赤霉烯酮抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。玉米赤霉烯酮是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答。为了制备玉米赤霉烯酮特异性抗体，必须首先将其结构改造得到玉米赤霉烯酮半抗原，玉米赤霉烯酮半抗原的合成方法是针对玉米赤霉烯酮分子进行结构改造。玉米赤霉烯酮半抗原是用玉米赤霉烯酮与盐酸羟胺缩合反应，引入一个新的羟基，再与琥珀酸酐反应得到具有羧基的玉米赤霉烯酮半抗原(图2)，该玉米赤霉烯酮半抗原与大分子载体蛋白偶联得到玉米赤霉烯酮完全抗原(免疫原或包被原)，其最终制备的抗体效果在后述发明中可以体现。前述载体蛋白可为卵清蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原常用载体蛋白。本发明采用混合酸酐法或碳化二亚胺法将玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白偶联， 突出了玉米赤霉烯酮的特征结构，增加了玉米赤霉烯酮半抗原的免疫原性。经测定本发明中玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的结合摩尔比为17 20 1，适合于抗体制备。所述玉米赤霉烯酮特异性抗体可为玉米赤霉烯酮单克隆抗体或玉米赤霉烯酮多克隆抗体；它们均是前述玉米赤霉烯酮免疫原免疫动物制备得到的。所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体优选为玉米赤霉烯酮鼠单克隆抗体。所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体优选为杂交瘤细胞株D-2-3CGMCC No. 5128分泌的单克隆抗体。所述玉米赤霉烯酮单克隆杂交瘤细胞株D-2-3CGMCC No. 5128 (分类命名玉米赤霉烯酮单克隆抗体杂交瘤细胞株)已于2011年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。所述玉米赤霉烯酮多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述玉米赤霉烯酮多克隆抗体优选为玉米赤霉烯酮兔多克隆抗体。本发明过程中原材料制备过程I.半抗原的合成玉米赤霉烯酮半抗原合成技术路线如图2。2.玉米赤霉烯酮抗体的制备(I)免疫原制备将玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原。(2)玉米赤霉烯酮鼠单克隆抗体的制备a)动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原，待血清效价大于I : 4000后，取出脾脏进行细胞融合。b)细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)玉米赤霉烯酮兔多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后，测定血清抗体效价。待效价较高后，处死兔子，采集血清，得到多克隆抗体。3.抗抗体的制备(I)羊抗鼠抗抗体是以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；(2)羊抗兔抗抗体是以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。4.本发明所提供的玉米赤霉烯酮检测方法及其检测试剂盒可以用于检测饲料样品中的玉米赤霉烯酮药物。所述试剂盒主要包括包被原和酶标记物,还包括玉米赤霉烯酮标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液。 所述包被原为玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物、玉米赤霉烯酮抗体或抗抗体；包被原为玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为玉米赤霉烯酮抗体时，所述酶标记物为酶标半抗原与载体蛋白的偶联物；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物。所述玉米赤霉烯酮标准品溶液6瓶，浓度分别为0，2，6，20，60和120y g/L。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为I 2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为I 2mol/L氢氧化钠溶液。所述浓缩洗涤液为pH值为7. 2-7. 5、含有0. 8-1. 2%吐温_20、0. 3-0. 6%。叠氮化钠的0. 1-0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH值为8. 7-9. 2,0. 1-0. 2mol/L的硼酸缓冲液，所用封闭液为含有5-8%小牛血清和0. 03-0. 07%。叠氮化钠、pH值7. 2-7. 4、0. 05-0. lmol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。本发明中酶标板的制备过程为用包被缓冲液将玉米赤霉烯酮偶联抗原、抗体或抗抗体稀释成0. 10-0. 20iig/ml，每孔加入100iil，37°C温育2h或4°C过夜，倾去包被液，用稀释的浓缩洗涤液洗涤2次，每次30秒，甩掉孔中液体，以吸水纸吸除残余水分后，向每孔中加入200 Ul封闭液，37°C温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封，4°C干燥处保存备用。5.本发明的检测原理为当在酶标板上预包被玉米赤霉烯酮偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入玉米赤霉烯酮特异性抗体溶液，样本中残留的玉米赤霉烯酮药物与酶标板上包被的玉米赤霉烯酮偶联抗原竞争玉米赤霉烯酮特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与玉米赤霉烯酮药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中玉米赤霉烯酮的残留量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的玉米赤霉烯酮标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中玉米赤霉烯酮残留量的浓度范围。当在酶标板上预包被玉米赤霉烯酮特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记玉米赤霉烯酮半抗原溶液，样本中残留的玉米赤霉烯酮药物与酶标记抗原竞争包被在酶标板上的玉米赤霉烯酮特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与玉米赤霉烯酮药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中玉米赤霉烯酮的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的玉米赤霉烯酮标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中玉米赤霉烯酮残留量的浓度范围。当在酶标板上预包被玉米赤霉烯酮偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记玉米赤霉烯酮特异性抗体溶液，样本中残留的玉米赤霉烯酮药物与酶标板上包被的玉米赤霉烯酮偶联抗原竞争玉米赤霉烯酮特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与玉米赤霉烯酮药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中玉米赤霉烯酮的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的玉米赤霉烯酮标准品溶液颜色的比 较可粗略判断样品中玉米赤霉烯酮残留量的浓度范围。当在酶标板上预包被抗抗体时，加入玉米赤霉烯酮抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记玉米赤霉烯酮偶联抗原溶液，样本中残留的玉米赤霉烯酮药物与酶标记玉米赤霉烯酮偶联抗原竞争玉米赤霉烯酮特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与玉米赤霉烯酮药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中玉米赤霉烯酮的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的玉米赤霉烯酮标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中玉米赤霉烯酮残留量的浓度范围。6.本发明还提供了一种检测玉米赤霉烯酮药物的方法，它包括步骤(I)样品前处理；(2)用前述试剂盒进行检测；(3)分析检测结果。样品的前处理主要是为了从样品中获得玉米赤霉烯酮溶液，从而用于后续的检测。本发明中用试剂盒检测时当包被原为玉米赤霉烯酮偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液加入酶标二抗，再加入抗体，温育后洗涤后，甩掉孔中液体，并以吸水纸吸除残余水分，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为玉米赤霉烯酮偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记抗体，温育后洗涤，甩掉孔中液体，并以吸水纸吸除残余水分，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为玉米赤霉烯酮特异性抗体时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记玉米赤霉烯酮半抗原，温育后洗涤，甩掉孔中液体，并以吸水纸吸除残余水分，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为抗抗体时，向酶标板微孔中加入玉米赤霉烯酮抗体，再加入标准品溶液或样品溶液后加入酶标玉米赤霉烯酮半抗原，温育后洗涤，甩掉孔中液体，并以吸水纸吸除残余水分，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。本发明中检测结果分析过程为用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(Btl)再乘以100%，即百分吸光度值。计算公式为百分吸光度值(％) = (B/B0) X100%
以玉米赤霉烯酮标准品溶液的浓度(Ug/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中玉米赤霉烯酮的残留量。本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。
图I :玉米赤霉烯酮化学结构式；图2 :玉米赤霉烯酮半抗原合成技术路线；图3:试剂盒标准曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 实施例I试剂盒组分的制备I.抗原的合成a.半抗原的合成将玉米赤霉烯酮与盐酸羟胺缩合反应，引入一个新的羟基，再与琥珀酸酐反应得到具有羧基官能团的半抗原。半抗原的具体步骤159mg玉米赤霉烯酮与盐酸轻胺在5ml卩比唳溶液中室温搅拌12-24小时，旋蒸除去吡啶和未反应的羟胺，得到粗产物，加入5ml四氢呋喃和200 U I吡啶，室温搅拌半小时，滴加溶于Iml四氢呋喃溶液中的50mg琥珀酸酐，室温反应12-24小时，旋蒸除去溶剂和吡啶，柱层析纯化，得到玉米赤霉烯酮半抗原。b.免疫原合成将玉米赤霉烯酮半抗原与牛血清白蛋白进行偶联得到免疫原。具体操如下取玉米赤霉烯酮半抗原8mg用ImlDMF溶解,取氯甲酸异丁酯8 ii I加入，10°C搅拌反应30min，即可得到反应液A ;称取BSA60mg，使之充分溶解在2mL50mmol/L碳酸钠溶液中得B液；将反应液A逐滴缓慢滴加到反应液B中，10°C反应4h，然后4°C过夜；用0. Olmol/LPBS透析3d每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。c.包被原玉米赤霉烯酮偶联抗原的制备将玉米赤霉烯酮半抗原与卵清蛋白偶联得到包被原。具体操作如下取玉米赤霉烯酮半抗原5mg用ImlDMF溶解,取氯甲酸异丁酯5 ii I加入，10°C搅拌反应30min，即可得到反应液A ;称取0VA30mg，使之充分溶解在2mL50mmol/L碳酸钠溶液中得B液；将反应液A逐滴缓慢滴加到反应液B中，10°C反应4h，然后4°C过夜；用0. Olmol/LPBS透析3d每天换3次透析液。分装，于-20°C保存备用。2.单克隆抗体的制备a.动物免疫选取6-8周龄健康Balb/c小鼠，按照免疫剂量为100 U g/只进行免疫。首次免疫时取等量弗氏完全佐剂(购自Sigma公司，货号F5881)与免疫原均匀混合，后续免疫时与等量弗氏不完全佐剂(购自Sigma公司，货号F5506)混合。b.细胞融合和克隆化小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按9 I比例(数量比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经筛选得到玉米赤霉烯酮的单克隆杂交瘤细胞株D-2-3CGMCC No. 5128。其分泌的抗体特异性良好(如表I)，灵敏度能达到2 u g/L。表1D-2-3CGMCC No. 5128分泌单克隆抗体特异性测定结果
权利要求
1.一种检测玉米赤霉烯酮的酶联免疫试剂盒，包括包被原和酶标记物，所述包被原选自玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物、玉米赤霉烯酮抗体和抗抗体；当所述包被原为玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为玉米赤霉烯酮抗体时，所述酶标记物为酶标半抗原与载体蛋白的偶联物；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物；所述玉米赤霉烯酮半抗原是将玉米赤霉烯酮和盐酸羟胺缩合反应，再与琥珀酸酐通过缩合反应得到的。
2.根据权利要求I所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述玉米赤霉烯酮抗体为玉米赤霉烯酮单克隆抗体，是以玉米赤霉烯酮半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述载体蛋白为卵清蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。
3.根据权利要求I或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体由杂交瘤细胞株D-2-3CGMCC No. 5128分泌产生。
4.根据权利要求I或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。
5.根据权利要求I或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。
6.根据权利要求I或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括玉米赤霉烯酮标准溶液、显色液、浓缩洗涤液、终止液；所述浓缩洗涤液为PH值为7. 2-7. 5、含有0. 8-1. 2%吐温-20、0. 3-0. 6%。叠氮化钠的0. 1-0. 2mol/L的磷酸盐缓冲液；所述底物显色液由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲,显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止液为I 2mol/L硫酸或盐酸溶液；所述包被缓冲液为PH值为8. 7-9. 2,0. 1-0. 2mol/L的硼酸缓冲液；所述封闭液为含有5_8%小牛血清和0. 03-0. 07%。叠氮化钠、pH值7. 2-7. 4,0. 05-0. lmol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积比。
7.根据权利要求4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为I 2mol/L硫酸或盐酸溶液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色剂为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为I 2mol/L氢氧化钠溶液。
8.—种检测玉米赤霉烯酮的方法，包括以下步骤； (1)样品前处理； (2)用权利要求1-7任一项所述的酶联免疫试剂盒检测； (3)分析检测结果；
9.保藏号为CGMCCNo. 5128的玉米赤霉烯酮单克隆抗体杂交瘤细胞株D-2-3。
全文摘要
本发明提供了一种检测玉米赤霉烯酮药物的酶联免疫试剂盒及其应用，它含有包被有包被原的酶标板，酶标记物，玉米赤霉烯酮特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)，玉米赤霉烯酮标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液。利用本发明所述试剂盒检测玉米赤霉烯酮包括如下步骤首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测饲料样品中玉米赤霉烯酮的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。
文档编号G01N21/78GK102967709SQ201110256239
公开日2013年3月13日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者何方洋, 韩黎, 吴鹏, 罗晓琴, 赵正苗, 韩雪琳, 孙震, 李勇, 崔海峰, 冯静, 陈勇, 罗贵昆 申请人:北京勤邦生物技术有限公司