专利名称：家养鹧鸪(石鸡)源性成分实时荧光pcr检测引物与探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种用于检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的检测方法，尤其涉及一对用于检测家养鹧鸪(石鸡)细胞线粒体核苷酸序列的引物探针。
背景技术：
世界各国政府大多将食品安全、饲料安全视为涉及国家公共安全的问题，并纷纷加大监管力度，特别是在出入境和市场的畜禽肉类食品、饲料及其商品的检验检疫工作方面，加强了监控畜禽肉类食品及其饲料的动物源性产品安全监测技术研究，该检测技术的研究与应用越来越受到重视。实时荧光PCR扩增目的片段是线粒体DNA。线粒体DNA是高等动物唯一的核外遗传物质，是一个比较理想的用于物种鉴别检测的靶基因序列，其主要原因是(1)在所有组织细胞中均含有大量的线粒体，可以获得大量的mtDNA，mtDNA在不同的物种间具有高度的变异性；每个动物细胞中存在许多拷贝的线粒体基因组，在采取相同体积的DNA样品进行 PCR检测时，线粒体基因组的模板数大大高于细胞核基因组的模板数，这就大大提高了 PCR 检测的灵敏度。0)mtDNA主要以编码序列构成，种内的异质基因很少。(3)不同种类的动物线粒体基因组序列虽然高度同源，存在高度保守区域，但也存在一定的变异区域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的引物和探针。以解决准确、快速、可靠的用实时荧光PCR技术鉴定家养鹧鸪(石鸡)源性成分。本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现用于检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分线粒体中COI的引物和探针序列包括上游引物F 的序列为5，-CAGGCTTTACCCTACACCCC-3，；下游引物R 的序列为5，-AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3，；探针序列P 的序列为5，(FAM)-AGCACACTTCGGAGTTATGTTTGT-3，(ECLIPSE)。本发明的原理为在传统的PCR扩增体系中加入一个与靶序列特异互补的荧光标记寡核苷酸探针，探针的5’端设计了一个报告荧光基因FAM，3’端设计了一个淬灭基因 ECLIPSE。在探针完整的情况下，报告荧光基因发出荧光被淬灭基因吸收，此时检测不到荧光信号。当有特异PCR产物时，复性状态下标记探针与靶序列结合互补，形成局部双链适合于5’ -3’核酸外切活性的底物，激活Taq聚合酶的5’外切酶活性，将5’的荧光分子切除， 报告荧光基因与淬灭基因分离，淬灭作用被解除，产生荧光信号，通过荧光定量PCR仪实时检测荧光度，通过荧光度的变化来反应是否扩增。
图1家养鹧鸪(石鸡)引物和探针特异性荧光PCR图
图中A5 鸡；B5 鸭；C5 鹅；D5 火鸡；E5 鸽子；F5 鸵鸟；G5 鹌鹑；H5 牛；A6 山羊；B6 猪；C6 绵羊；D6 兔；E6 鱼；F6 鹿；G6 狗；H6 驴；D8 马E8 阴性对照；F8 石鸡图2家养鹧鸪(石鸡)引物和探针灵敏度荧光PCR检测中A :10-1纯石鸡肉样DNA ；B :1(Γ2纯石鸡肉样DNA ；C :1(Γ3纯石鸡肉样DNA ；D IO"4纯石鸡肉样DNA ；E :1(Γ5纯石鸡肉样DNA ；F :1(Γ6纯石鸡肉样DNA ；G 纯石鸡肉样 DNA ；H 阴性对照
具体实施例方式以下据所示最佳实施例对本发明作进一步详述。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。1.引物和探针的设计通过在动物分类学中相近的种如鸡和鹌鹑线粒体基因序列比较分析，选择高保守区段的COI基因设计并优化引物和探针，序列如下上游引物F 的序列为5，-CAGGCTTTACCCTACACCCC-3，；下游引物R 的序列为5，-AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3，；探针序列P 的序列为5，(FAM)-AGCACACTTCGGAGTTATGTTTGT-3，(ECLIPSE)。2.样品总DNA的提取采用氯仿抽提法或商业DNA提取试剂盒，提取鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽子、鸵鸟、鹌鹑、 牛、山羊、猪、绵羊、兔、鱼、鹿、狗、驴、马、石鸡动物的基因组DNA，提取的基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD26tZOD28tl值均为1. 8左右，说明DNA纯度较高符合 PCR扩增要求。3.家养鹧鸪(石鸡)源性成分实时荧光PCR检测利用步骤1设计的特异性引物和探针，以家养鹧鸪(石鸡)DNA为模板并设阴性对照进行PCR扩增。3. 1 实时荧光 PCR 反应体系为 20 μ L，包括 IOyL 2 X real time PCR Buffer (包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等)，上下游引物F/R各0. 4μ L(终浓度为0. 2 μ M)，探针P 0. 4 μ L (终浓度为0. 2 μ Μ)，DNA模板2 μ L，超纯水补至20 μ L0可采用商业化的实时荧光 PCR反应母液。3. 2实时荧光PCR反应程序为预变性95°C 30sec ；然后95°C 15sec，60°C 34sec 循环40次。进行PCR反应，反应结束后保存文件，打开分析软件，分析实验结果，给出Δ 1 (第 η个循环时的荧光增加值)与循环数图像，阳性样品出现明显的“S”状扩增曲线。4.引物和探针的特异性验证利用所设计鉴别检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的特异性引物和探针，分别以鸡、 鸭、鹅、火鸡、鸽子、鸵鸟、鹌鹑、牛、山羊、猪、绵羊、兔、鱼、鹿、狗、驴、马、石鸡等动物的总DNA 为模板，按上述3进行实时荧光PCR，验证引物的特异性。检测结果如图1所示，F8出现阳性扩增曲线，其它样品没有家养鹧鸪(石鸡)源性成分DNA，则没有信号，显示上述引物和探针有良好的特异性。5.实时荧光PCR的灵敏度验证
用超纯水10倍梯度稀释纯家养鹧鸪(石鸡)肉样DNA，直至10-7，按上述3进行实时荧光PCR，结果如图2。可知其检测低限至少可达0.001%纯家养鹧鸪(石鸡)肉样DNA 浓度，该引物探针的灵敏度可达0.001%纯家养鹧鸪(石鸡)肉样品。
权利要求
1.一种用于检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的引物，其特征在于所述的引物序列包括上游引物 F :5’ -CAGGCTTTACCCTACACCCC-3，，下游引物 R :5’ -AGTATCGGCGAGGTATGCCG-3，。
2.一种用于检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的探针，其特征在于所述的探针P序列为 5 ‘ FAM-AGCACACTTCGGAGTTATGTTTGT-(ECLIPSE)-3‘。
全文摘要
本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域，具体涉及一种用于检测家养鹧鸪(石鸡)源性成分的检测方法，尤其涉及一对用于检测家养鹧鸪(石鸡)细胞线粒体核苷酸序列的引物和探针。本发明旨在鉴别饲料、食品等产品中是否含有家养鹧鸪(石鸡)源性成分。通过设计特异性扩增引物和探针，采用实时荧光PCR检测方法检测遗传上相对独立，没有重复序列，生物个体内无组织特异性的线粒体DNA，以达到快速准确检测鉴定家养鹧鸪(石鸡)源性成分的目的。
文档编号G01N21/64GK102337335SQ20111029046
公开日2012年2月1日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者刘建利, 卢体康, 孙洁, 宗卉, 廖立珊, 曹琛福, 杨俊兴, 花群义 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心