专利名称：食品及饲料中貂源性成分实时荧光pcr检测方法
技术领域：
本发明属于食品质量控制领域，具体涉及一种食品及饲料中貂源性成分检测方法及其应用。
背景技术：
貂在中国主要产于东北地区，有多个品种，属珍贵毛皮动物。主要包括紫貂、黄喉貂、日本貂等。在我国的皮毛养殖场中，水貂是主要的养殖品种，水貂在动物分类学上属于哺乳纲、食肉目、鼬科、鼬属的小型珍贵毛皮动物。在野生状态下，有美洲水貂(M. vison)和欧洲水貂(M.1utreola)两种。现在世界各国人工饲养的均为美欧水貂的后代，我国主要养殖为美洲水貂的后代。近年来，很多饲养场人工饲养貂以获取其毛皮，剩下的貂肉常被不法商贩以低价收购。每年深秋貂大量上市时，一些人便收购貂肉冰存，不断有媒体曝光，一些厂家所售卖的牛羊肉卷或狗肉等，其价格明显比商场里的要低很多，甚至比成本价还低。实际上是一些不法商家由于某些食用肉类的成本较高，为了多赚钱，便会用貂肉等原料冒充成本较高的肉销售欺骗消费者，向低价肉中掺有廉价的貂肉和貂肉。由于国家没有针对羊肉卷这种食品制定生产标准，质监面临无法可依的窘境。也尚无权威的鉴定机构可以对羊肉卷进行鉴定。以貂肉冒充高成本肉，卖貂肉，使得貂被作为食物流入市场，则涉及的是食品安全的问题。由于人们对食品的安全卫生特别重视，食品卫生指标尤其是肉食品中是否掺入貂肉等原料的真伪鉴定就显得特别重要。为了尽量减轻假肉产品的不良影响，力求避免人民的合法利益受到侵害，或以貂肉冒充其他成本较高的肉类，而造成更加不利的影响。由此，急需一种食品及饲料中貂 源性成分简便、快速的检测方法。目前我国在食品及饲料中貂源性成分检测方法仍是个空白，在保证方法稳定性、特异性等方面存在很多困难，这也是制约方法建立的瓶颈。
发明内容
为了解决上述实际问题，本发明建立了一种食品中貂源性成分检测方法研究，进行肉制品掺假检测技术研究。采用TaqMan探针技术，能够对食品中掺杂的貂源性成份进行鉴定。该标准的研制成功及推广应用对提高进出口食品及饲料中的貂源性成份的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验检疫技术具有重要意义。本发明从以下几个方面研究提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用貂成分的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，直接读取实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和原料中貂源及其制品的鉴伪检测等，在此基础上，进行了特异性和稳定性检测；本发明的具体技术方案如下
本发明所述的貂，是指哺乳动物，属哺乳纲，食肉目，鼬科(Muste I i dae )，鼬亚科(Mustelinae),紹属(Martes)。包括水紹、紫紹、日本紹、黄喉紹等，体细长，色黄或紫黑。本发明的一方面在于公开貂源成分检测用引物与探针，其包括以下碱基序列线粒体细胞色素b基因cytochrome bgene (Cyt b gene)在生物细胞内高度保守并且在大多数情况下持续表达，Cyt b gene常做为物种鉴定基因。①水貂源性成分检测引物和探针的设计通过GenBank的Blast功能寻找水紹细胞色素b基因(Genebank登录号GQ153579.1)的同源基因，可见该基因具有很高的种属特异性，其他基因与该基因的同源性很小。②紫貂、日本貂、黄喉貂源性成分检测引物和探针的设计通过GenBank的Blast功能寻找三种紹的细胞色素b基因(黄喉紹Genebank登录号 NC-012141 ;紫貂Genebank 登录号 NC-011579 ;日本貂Genebank 登录号 NC-009678)的同源基因。发现与鼬的基因序列同源性很高，本方法采用LNA修饰的碱基标注与鼬的差别序列，合成LNA探针，保证所设计的探针序列可以特异性的检测出三种貂。据此设计了本发明用于检测的貂源性成分的检测引物和探针如下
权利要求
1.貂源性成分检测用引物与探针，其特征在于，包括以下碱基序列 紫貂、日本貂、黄喉貂源性成分检测引物和探针 上游引物SEQ IDNO=I 下游引物SEQ ID NO 2 探针SEQ ID NO 3 水貂源性成分检测引物和探针 上游引物SEQ IDNO :4 下游引物SEQ IDNO :5 探针SEQ ID NO :6。
2.一种貂源性成分检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述貂源性成分检测用引物与探针SEQ ID NO :1 6。
3.一种貂源性及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其特征在于利用权利要求1所述的引物与探针SEQ ID NO :1 6，对样品DNA进行实时荧光PCR方法检测。
4.根据权利要求3所述的貂源性及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其特征在于利用权利要求1所述的引物SEQ ID NO : f 6，分别对样品按下述方法进行实时荧光PCR检测 ①实时荧光PCR反应体系 反应体系总体积为25 μ L，其中
5.根据权利要求3所述的貂源性及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其特征在于所述的样品DNA的制备方法如下 ①称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液和IOyL浓度为20mg/ 4 1^蛋白酶1(,651€ 30min振荡混勻；12000r/min离心5min,吸取上清液至一新离心管中，加400 μ L的体积比为24 1的三氯甲烷异戊醇，充分混匀； ②12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入O.8倍体积异丙醇，室温下沉淀I 2h ; ③12000r/min离心IOmin,弃上清液;70%乙醇洗潘一次，晾干；加入50μ L TE,溶解DNA沉淀； ④DNA浓度和纯度的测定取步骤③获得的DNA溶液加水稀释，至浓度为1(Γ100μ g/mL, A260/A280比值1. 7 1. 9之间，备用。
全文摘要
本发明公开了一种貂源性成分检测用引物与探针、其使用方法及应用。该方法针对貂线粒体细胞色素b基因，设计了貂cytochrome b gene基因的检测用引物和探针，采用实时荧光PCR法对食品及饲料中貂成分的定性检测。本发明所研制的食品及饲料中貂成分的实时荧光PCR法定性检测方法、对提高食品中貂源性成份的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验检疫技术具有重要意义。具有广阔发展前景。
文档编号C12Q1/68GK103031382SQ20121055487
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者郑秋月, 徐君怡, 孙杰, 曹际娟 申请人:郑秋月, 徐君怡, 孙杰, 曹际娟