专利名称：一种棕榈酸辅酶a的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种酶的制备方法，尤其涉及一种采用发酵方式制备棕榈酸辅酶A的方法，属于棕榈酸辅酶A的制备领域。
背景技术：
棕榈酸辅酶A是棕榈酸与辅酶A合成的产物，可以用于生物化学等多重领域。现有的棕榈酸辅酶A的生产方法主要有化学合成法与酶转化法。化学合成法存在合成步骤多收率低等缺点，酶转化法需要用到辅酶A (CoA)、ATP，因为辅酶A (CoA)、ATP价格昂贵，故棕榈酸辅酶A的酶转化法的成本很高，有待改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有酶转化法制备棕榈酸辅酶A的所存在的成本高的缺陷，提供一种成本较低的制备棕榈酸辅酶A的方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:一种制备棕榈酸辅酶A的方法，包括以下步骤:(I)克隆编码乙酰辅酶A合成酶的基因并将其转化到大肠杆菌细胞中进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株；(2)将步骤(I)的基因工程菌株种子接入发酵初始培养基进行初始培养直至初始培养基中营养耗尽，溶氧上升至50%以上；
(3)初始培养结束后，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；(4)诱导培养结束后加入十二烷基磺酸钠(SDS)至其终浓度为0.05 0.15g/L，进行预转化培养；预转化培养完成后流加转化补料培养基继续进行转化培养，得到棕榈酸辅酶A。其中，步骤(I)中从施氏假单胞菌(ATCC 17588)中克隆得到编码乙酰辅酶A合成酶的基因，将此基因在大肠杆菌BL21 (DE3)进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株；所述的编码乙酰辅酶A合成酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。步骤(2)中所述的发酵初始培养基组成包括:磷酸氢二铵6_12g/L、磷酸二氢钾
3-6g/L、一水柠檬酸0.2-lg/L、硫酸镁0.3-2 g/L、微量元素母液l_3ml/L、葡萄糖10_20g/L、硫酸卡那霉素50mg/L ；2M硫酸与氨水做为酸碱调节pH值为6.5-7.3 ；所述微量元素的母液的按照以下方法配制得到:(1)按以下用量称取各成分:10gFeSO4.7Η20，2.25g ZnSO4.7H20, Ig CuSO4.5Η20，0.5gMnS04.5H20, 0.23g Na2B4O7.1OH2O, 2gCaCl2.2H20，0.1g (NH4)6Mo7O24 ; (2)将上述各成分溶于IL 5M盐酸中，即得。步骤(3)中初始培养结束后降温至28°C，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；所述的诱导补料培养基的组成为:甘油200_400g/L、乳糖70 _130g/L，硫酸铵100-200g/L ;pH 值为 4.5。步骤(3)中当菌液0D600的值为40-50，酶活为20KU/L时停止诱导培养转入转化
培养阶段。步骤(4)中所述的预转化培养的培养条件包括:通气量为0.5L/L发酵液/min，转速为200 300rpm，温度保持在28°C ;使用2M硫酸和氢氧化钠调节pH值为6.1 6.3 ;步骤(4)中预转化培养30min后开始流加转化补料培养基；所述的转化补料培养基的组成成分包括:甘油50-150 g/L，棕榈酸钠100_300g/L ；所述的流加转化补料培养基的方式包括:流加速度初始时设定为lml/h/L发酵液，Ih后调整为3ml /h/L发酵液，1.5h后调整为5ml/h/L发酵液，2h后调整为7ml/h/L发酵液，保持此流速。步骤(4)的补料过程中，通过调整通气量将溶解氧含量控制在30%左右。本发明是利用基因工程手段从施氏假单胞菌(ATCC 17588)中克隆得到编码乙酰辅酶A合成酶的基因、构建基因工程菌株，通过菌体培养、乙酰辅酶A合成酶诱导、棕榈酸辅酶A转化三步实现棕榈酸辅酶A的高效表达，从而摒除了 ATP与辅酶A的使用，降低了成本。本发明使用乙酰辅酶A合成酶重组菌，在比较温和的条件下，利用生物体本身所能够产生的ATP、辅酶A等物质(而不是额外添加)，转化生产高附加值的棕榈酰辅酶A，其成本远低于现有的制备棕榈酸辅酶A的酶转化方法。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。一、乙酰辅酶A合成酶酶活测定方法(I)酶活定义I个酶活单位等于在以下反应条件下I分钟内转化I μ mole棕榈酸所需要的酶量。(2)试剂配制试剂A的配制配制0.05M, pH 7.5的磷酸钾缓冲液。在800毫升去离子水中，加入11.34克HEPES，搅拌溶解，用氢氧化钠在25度下调节pH=7.9，加入0.526克甘油、0.228克苯酚、0.468克氯化镁、I克叠氮钠、6.24KU过氧化物酶搅拌溶解，用氢氧化钠调PH值到7.90 (25°C)，严格控制温度和pH。定容至I升。试剂B的配制在800ml试剂A中依次加入0.6053克ATP *Na2,0.2033克六水氯化镁，0.8216克辅酶A，调整pH7.5，用试剂A定容到I升。(可按比例配制，辅酶A不稳定，可现用现加)试剂C的配制在800ml水中加入50克Triton X-100和2mM的棕榈酸，加热使棕榈酸完全溶解，冷却到室温，用氢氧化钠调节PH至7.5 (可按比例配制)
试剂D的配制在800ml试剂A中依次加入0.1251克NEM (氮乙酰马来酰亚胺)，0.505克4-氨基安替吡啉，8KU过氧化物酶，0.25克叠氮钠，调整pH7.5，用试剂A定容到I升。(可按比例配制)试剂E的配制在800ml水中加入20克苯酚。(可按比例配制)试剂F的配制ACS稀释液:在IL的pH7.5的IOmM磷酸钾缓冲液中加入2mM ATP和Ig TritonX-100。(可按比例配制)试剂G的配制 ACOD稀释液:在IL的pH7.5的25mM磷酸钾缓冲液中加入0.02mM FAD和0.2g牛血清蛋白。(可按比例配制)试剂H的配制用试剂G配制240KU/L的ACOD (乙酰辅酶A氧化酶)酶液。(3)待测样品的配制检测前用卧氏称量管称量所需酶，酶称量时，应至少称量IOmg的酶，以保证称量的准确性。用酶稀释液(试剂F)溶解，定容到配制体积。(4)酶活检测步骤1、320 μ I试剂B与80 μ I试剂C在37 °C保温I分钟。2、加入20 μ I稀释好的ACS酶液，37°C反应10分钟。3、加入800 μ I试剂E，37°C温浴两分钟；加入20 μ I试剂H，37°C反应5分钟。记录吸光值As。4、重复第1、2、3步骤，用20 μ IACS稀释液代替20 μ I试剂ACS酶液。记录空白吸光值Ab。注意:ΛA=As-Ab ≤ 0.300此法酶的最适线性为100-200 U /L0(5)酶活力计算公式
权利要求
1.一种制备棕榈酸辅酶A的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)克隆编码乙酰辅酶A合成酶的基因并将其转化到大肠杆菌细胞中进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株； (2)将步骤(I)的基因工程菌株种子接入发酵初始培养基进行初始培养； (3)初始培养结束后，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶； (4)诱导培养结束后加入十二烷基磺酸钠至其终浓度为0.05 0.15g/L进行预转化培养；预转化培养完成后流加转化补料培养基继续进行转化培养，得到棕榈酸辅酶A。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的编码乙酰辅酶A合成酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的发酵初始培养基组成包括:磷酸氢二铵6-12g/L、磷酸二氢钾3-6g/L、一水柠檬酸0.2_lg/L、硫酸镁0.3-2 g/L、微量元素母液l_3ml/L、葡萄糖10-20g/L、硫酸卡那霉素50mg/L ;pH值为6.5-7.3; 所述微量元素的母液的按照以下方法配制得到: (I)按以下用量称取各成分:10g FeSO4.7H20,2.25g ZnSO4.7H20, Ig CuSO4.5H20,0.5gMnS04.5H20, 0.23g Na2B4O7.1OH2O, 2g CaCl2.2H20，0.1g (NH4)6Mo7O24 ；(2)将上述各成分溶于IL 5M盐酸中，即得。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中初始培养结束后降温至28°C，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；当菌液0D600的值为40-50，酶活为20KU/L时停止诱导培养转入转化培养阶段。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的诱导补料培养基的组成为:甘油200-400g/L、乳糖 70 _130g/L，硫酸铵 100_200g/L ;pH 值为 4.5。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的预转化培养的培养条件包括:通气量为0.5L/L发酵液/min，转速为200 300rpm，温度保持在28°C ；pH值为6.1 6.3。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中预转化培养30min后开始流加转化补料培养基。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的转化补料培养基的组成成分包括:甘油 50-150 g/L，棕榈酸钠 100-300g/L。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的流加转化补料培养基的方式包括:流加速度初始时设定为lml/h/L发酵液，Ih后调整为3ml/h/L发酵液，1.5h后调整为5ml/h/L发酵液，2h后调整为7ml/h/L发酵液，保持7ml/h/L的流速。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)的补料过程中，通过调整通气量将溶解氧含量控制在30%左右。
全文摘要
本发明公开了一种制备棕榈酸辅酶A的方法，该方法包括(1)克隆编码乙酰辅酶A合成酶的基因并将其转化到大肠杆菌细胞中进行表达，获得表达乙酰辅酶A合成酶的基因工程菌株；(2)将基因工程菌株种子接入发酵初始培养基进行初始培养；(3)初始培养结束后，加入诱导补料培养基进行诱导培养产生乙酰辅酶A合成酶；(4)诱导培养结束后加入SDS进行预转化培养；流加转化补料培养基继续进行转化培养，得到棕榈酸辅酶A。本发明使用乙酰辅酶A合成酶重组菌，在温和的条件下，利用生物体本身所能够产生的ATP、辅酶A等物质，转化生产高附加值的棕榈酰辅酶A，其成本远低于现有的制备棕榈酸辅酶A的酶转化方法。
文档编号C12N15/63GK103074400SQ201210554748
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司