专利名称：烟叶微生物选择性培养基配制及培养烟叶微生物的方法
技术领域：
本发明专利属于烟叶微生物的选择性培养技术领域。
背景技术：
烟叶醇化的发酵过程中有微生物、酶及化学物质的协同作用，诱发一系列与香气物质变化有关的生化反应。其中微生物贯穿烟叶发酵始终，很多致香物质都是通过微生物的生化代谢途径而获得的。因此，烟叶微生物区系的检测对于提高烟叶品质相关的醇化技术研究起着较为重要的作用。微生物区系主要包括三大类细菌、真菌、放线菌。随着科学技术的进步，检测微生 物区系的技术手段也越来越丰富，但目前主要集中于分子技术鉴定法及传统平板培养法两种方法。传统分子技术所需要的仪器、试剂、耗材等比较昂贵，克隆测序成本较高、操作较繁琐，周期长，而且通过传统分子技术手段仅能做到定性，难做定量。而采用新型的用荧光定量分子技术进行定量，其检测成本将更加高昂。因此，分离和统计这三类微生物数量较为快速经济、简便易行的方法仍然是平板培养法，它主要是利用不同营养成分的固体培养基对烟叶微生物进行选择性培养，然后根据菌落形成单位(CFU)和菌落形态来分析鉴定微生物种类，该法的核心及关键在于选择性培养基的分离效果。而现有用于微生物区系的选择性培养基大都是针对土壤微生物区系来设计的，因此对于烟叶微生物的培养适宜性以及抗生素适用性都较差，从而影响了烟叶微生物的培养及分离效，最终导致检测结果偏离真实值。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的问题，提供一种烟叶微生物选择性培养基的配制方法以及培养烟叶微生物的方法，以烟叶微生物的培养及分离为出发点，针对性的设计烟叶微生物区系检测中所涉及的真菌、细菌、放线菌进行选择性培养基的配方设计，提供一种能够解决传统选择性培养基培养不完全以及分离效果差的方法，并且为检测结果的准确性及检测操作的便利性提供支持。本发明的目的通过如下技术方案实现。烟叶微生物选择性培养基的配制方法，包括如下步骤
(O制备烟叶提取物取废弃烟叶或烟叶碎末500g加10-15倍水提取2-4h，提取完成后将提取液过滤进行减压浓缩，浓缩至其相对密度d2020为1. 053±0. 008、折光指数Nd20为1. 372±0. 008，放置于4°C温度保存使用；
(2)制作烟叶选择性培养基，包括
a、制作烟叶细菌选择性培养基配制烟叶细菌选择性培养基的配方为牛肉膏2. 5-3. 5g/L、蛋白胨9-10 g/L、NaC15-6g/L、烟叶提取物15_20g/L、琼脂10_15g/L、余量为水；烟叶细菌选择性培养基的PH7. 0-7. 2 ;将配制好的烟叶细菌选择性培养基于115°C灭菌30分钟，临用前待烟叶细菌选择性培养基稍冷至40-50°C时，加入10-15Pg/L潮霉素B稀释液，混匀后倒板；b、制作烟叶真菌选择性培养基配制烟叶真菌选择性培养基的配方为葡萄糖9-12g/L、蛋白胨 4-6g/L、KH2PO4O. 8-1. 2g/L、MgSO4. 7Η200· 4-0. 6 g/L、烟叶提取物 15_20g/L、1/3000孟加拉红90-120 ml、琼脂10-15 g /L、余量为水；烟叶真菌选择性培养基的pH按自然所得；将配制好的烟叶真菌选择性培养基于115°C灭菌20分钟，临用前待烟叶真菌选择性培养基稍冷至40-50°C时，加入8-12 mg/L的链霉素稀释液混匀后倒板；
C、制作烟叶放线菌选择性培养基配制烟叶放线菌选择性培养基的配方为可溶性淀粉 15-20 g/L、KH2PO4O. 3-0. 5 g/L、MgSO4. 7Η200· 3-0. 5 g/L、KNO3O. 8-1. Og/L、FeSO4. 7H200. 008-0. 01 g/L、NaC10. 3-0. 5 g/L、烟叶提取物 15_20g/L、琼脂 10-15 g/L、余量为水；配制时，需先将可溶性淀粉加少量冷水调制成糊状，再加入沸水中；烟叶放线菌选择性培养基的PH7. 2-7. 4 ;将配制好的烟叶放线菌选择性培养基于115°C灭菌30分钟，临用时在已灭菌的培养基中加入45-60 mg/L的重铬酸钾溶液，摇匀后倒板。
利用选择性培养基培养烟叶微生物的方法，称取IOg新鲜或4°C保存的烟样置于盛有90mL无菌的磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌三角瓶内，放入适量玻璃珠，于150r/min转速下震荡30min，静置20min，制成1:10的一次样品匀液；用ImL无菌吸管或微量移液器吸取一次样品匀液lmL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中且吸管或吸头尖端不触及稀释液面，振摇无菌试管或换用I支无菌吸管反复吹打使一次样品匀液与稀释液混合均匀，制成1:100的二次样品匀液；以此类推，制备得到10倍系列稀释的十次样品匀液;每递增稀释一次，换用I次ImL无菌吸管或吸头；选择2个 3个样品匀液，吸取O.1mL样品匀液涂布于烟叶细菌选择性培养基或烟叶真菌选择性培养基或烟叶放线菌选择性培养基上，每个稀释度做三个平皿；细菌于30°C ±1°C培养2-3d ;真菌于28°C ±1°C培养3_4d ；放线菌于28°C ±1°C培养4-5d，即得到烟叶微生物。本发明的各类微生物选择性培养基，针对烟叶微生物的选择性培养而配制，通过添加不同抗生素或其他抑菌试剂，能做到将烟叶中的细菌、真菌、放线菌较好的分离开，杂菌率低于5%，极大地方便了分别统计细菌、真菌、放线菌这三类微生物的数量，使传统的分离培养方法得到有效改善。
具体实施例方式实施例1
本发明具体的烟叶细菌选择性培养基的配制方法如下
(1)烟叶提取物的制备
取废弃烟叶或烟末500g加10-15倍水提取2-4h，提取完成后将提取液过滤进行减压浓缩，浓缩至其相对密度d2020为1.053±0. 008、折光指数Nd20为1. 372±0· 008，放置于4°C温度保存使用；
(2)烟叶细菌选择性培养基的配制
按照表I的配方进行烟叶细菌选择性培养基的配制，烟叶细菌选择性培养基配制完后，于115°C灭菌30分钟，临用前待烟叶细菌选择性培养基稍冷至40-50°C时，加入10-15Pg/L潮霉素B稀释液,混匀后倒板；
表I烟叶细菌选择性培养基配方
I试剂名称 I用量—
权利要求
1.烟叶微生物选择性培养基的配制方法，其特征在于，包括如下步骤(O制备烟叶提取物取废弃烟叶或烟叶碎末500g加10-15倍水提取2-4h，提取完成后将提取液过滤进行减压浓缩，浓缩至其相对密度d2020为1. 053±0. 008、折光指数Nd20为1. 372±0. 008，放置于4°C温度保存使用；(2)制作烟叶选择性培养基，包括a、制作烟叶细菌选择性培养基配制烟叶细菌选择性培养基的配方为牛肉膏2.5-3. 5g/L、蛋白胨9-10 g/L、NaC15-6g/L、烟叶提取物15_20g/L、琼脂10_15g/L、余量为水；烟叶细菌选择性培养基的PH7. 0-7. 2 ;将配制好的烟叶细菌选择性培养基于115°C灭菌30分钟，临用前待烟叶细菌选择性培养基稍冷至40-50°C时，加入10-15Pg/L潮霉素B稀释液，混匀后倒板；b、制作烟叶真菌选择性培养基配制烟叶真菌选择性培养基的配方为葡萄糖9-12g/L、蛋白胨 4-6g/L、KH2PO4O. 8-1. 2g/L、MgSO4. 7Η200· 4-0. 6 g/L、烟叶提取物 15_20g/L、1/3000孟加拉红90-120 ml、琼脂10-15 g /L、余量为水；烟叶真菌选择性培养基的pH按自然所得；将配制好的烟叶真菌选择性培养基于115°C灭菌20分钟，临用前待烟叶真菌选择性培养基稍冷至40-50°C时，加入8-12 mg/L的链霉素稀释液混匀后倒板；C、制作烟叶放线菌选择性培养基配制烟叶放线菌选择性培养基的配方为可溶性淀粉 15-20 g/L、KH2PO4O. 3-0. 5 g/L、MgSO4. 7Η200· 3-0. 5 g/L、KNO3O. 8-1. Og/L、FeSO4. 7H200. 008-0. 01 g/L、NaC10. 3-0. 5 g/L、烟叶提取物 15_20g/L、琼脂 10-15 g/L、余量为水；配制时，需先将可溶性淀粉加少量冷水调制成糊状，再加入沸水中；烟叶放线菌选择性培养基的PH7. 2-7. 4 ;将配制好的烟叶放线菌选择性培养基于115°C灭菌30分钟，临用时在已灭菌的培养基中加入45-60 mg/L的重铬酸钾溶液，摇匀后倒板。
2.利用权利要求1所述选择性培养基培养烟叶微生物的方法，其特征在于，称取IOg新鲜或4°C保存的烟样置于盛有90mL无菌的磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌三角瓶内，放入适量玻璃珠，于150r/min转速下震荡30min,静置20min,制成1:10的一次样品勻液；用ImL无菌吸管或微量移液器吸取一次样品匀液lmL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中且吸管或吸头尖端不触及稀释液面，振摇无菌试管或换用I支无菌吸管反复吹打使一次样品匀液与稀释液混合均匀，制成I 100的二次样品匀液；以此类推，制备得到10倍系列稀释的十次样品匀液；每递增稀释一次，换用I次ImL无菌吸管或吸头；选择2个 3个样品匀液，吸取O.1mL样品匀液涂布于烟叶细菌选择性培养基或烟叶真菌选择性培养基或烟叶放线菌选择性培养基上，每个稀释度做三个平皿；细菌于30°C ±1°C培养2-3d ;真菌于28°C ±1°C培养3-4d;放线菌于28°C ± 1°C培养4_5d，即得到烟叶微生物。
全文摘要
烟叶微生物选择性培养基配制及培养烟叶微生物的方法，先用废弃烟叶或烟叶碎末制备烟叶提取物，再制作烟叶细菌、真菌和放线菌的选择性培养基。称取10g新鲜或4℃保存的烟样置于盛有90mL无菌的磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌三角瓶内，于150r/min转速下震荡30min，静置20min，制成1:10的一次样品匀液；再用一次样品匀液经过多次稀释制备得到10倍系列稀释的十次样品匀液；选择2个～3个样品匀液，吸取0.1mL样品匀液涂布于烟叶细菌选择性培养基或烟叶真菌选择性培养基或烟叶放线菌选择性培养基上；细菌于30℃±1℃培养2-3d；真菌于28℃±1℃培养3-4d；放线菌于28℃±1℃培养4-5d，即得到烟叶微生物。本发明可将烟叶中的细菌、真菌、放线菌较好分离，杂菌率低。
文档编号C12N1/20GK103014122SQ20121055441
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者周丽娟, 薛红芬, 史云涛, 周芳芳, 王娟, 张晓龙, 资文华, 邓国宾 申请人:云南瑞升烟草技术(集团)有限公司