专利名称：颌下腺特异表达多拷贝人源ngf基因的转基因小鼠构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因技术领域，具体地涉及颌下腺特异表达多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠构建。基因组，是分子生物学的专有名词，其就是指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子，而BAC是指其中的一个比较长的片段。
背景技术：
目前，临床使用的NGF多为动物(小鼠)基因表达产物或为单拷贝人源NGF基因的转基因小鼠生产，因此小鼠颌下腺中NGF的表达量有限。因此，如何在保证小鼠颌下腺中特异性表达，同时能够增加其在颌下腺中的表达量是人们有待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供颌下腺特异表达多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠构建，通过如下步骤实现:(I)将5-6个hNGF基因串联并克隆到小鼠的KLK1B22基因的启动子后面；(2)所述小鼠的KLK1B22基因的启动子从BAC或基因组上面克隆，并采用ATG上游2kb左右的序列；(3)将所述小鼠的KLK1B22基因启动子的区域中REl和RE2之间的片段从载体上切下来，且所述REl和RE2之间的片段包括KLK1B22基因启动子及5_6个hNGF基因；(4)将切下来的所述REl 和RE2之间的片段中的hNGF基因片段纯化；(5)将经过纯化的hNGF基因片段通过原核显微注射的方法注射到小鼠受精卵细胞核内，以生产出具有在小鼠颌下腺内特异表达的多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:通过上述技术方案，本发明提供的颌下腺特异表达多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠构建，由于所述REl和RE2之间的片段包括5-6个hNGF基因，当把经过纯化的hNGF基因片段通过原核显微注射的方法注射到小鼠受精卵细胞核内，就可以生产出能够表达多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠。
具体实施例方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。小鼠的KLK1B22基因启动子区域为chr7:51367043_51368116，长度为1074bp，其序列为:chr7:51367043-51368116TGTTGAGGGACATATGGGTTCTTTCCACCTTCTGGCTATTATAAAAAGGGCTGCTATGAACATAGTATAACATGTATCCTTATTACCAGTTGGAACATCTTCTGGGTATATGCCCAGGAGAGGTATTGCTGGATCTACCAGTAGTGTCCAGTTTTCTGAGGAACCTCCAGACTGATTTCCAGAGTGGTTGTATAAGCTTGCAAACCCACCAGCAATGGAGGAGTGTTCCTCTTTCTCCAC
ATCCTCGCCAGCATCTGCTGTCACCAGAATTTTTGATCCTAGCCATTCTGACTGGTGTAAGGTGGAATCTCAGGGTTGTTTTGATTTGCATTTCCCTGATGATTAAGTATGCTCAACATTTTTTCAAGTACTTCTCAGTCTTTCAGTATTCCTTGATTGAGAATTCTTTGTTTAGCAATTTTTAATGAGGTTATTTGAATTTCTGGAATTCAGCTCCTAATAGGAAAAGTAAAATCAGTGATCCAACTTCCAAGTCCAAAATGAAGCATTTTGGCATTCTCCAAGGAAGGATTTGTATCTACAGGGAGCTTGCAGCCCTCTAGGCTACCACTTGTGCAAAGACTCTGTTCTAACTGCAACTTTCTGGGATAATCTTGGACTTGAGGTACAGGACCTTCCTTAGAGGTGTGGGTTAGGCAGCACTCGCTCCACTACCCTCCGTTAACACCAATTCACCATTGCCACGACCTTGACATCTGGCTAAGGTCCCTGGAACACTAACAGCTCCAGAAACAAAAGTCCATGCCCCACCCGATTTTATCCTTGGGAAGGTATCCAGGGTGACCTAGGGCCTACTGGACATCAGGTGCAACAGGACCGCCCCTTACCACAGCAGGGAGGGTAAGTGCAGGGAATCCACCTCTGTCAGCAAGGGAAGAGCTTTGGTCAGCATTTGGCTGCCACAGGACAGGGGTGGGGCTGTGGGGGAGAATGAGGGTTTTTAAAGTCTCCCTGAGGAGCCTCCACAGCTCCAAGCTCACCTCCTGCAGCTCCTGGACA
CCTGTTACCATGAGGTTCCTGATCCTGTTCCTAACCCTGTCCCTAGGAGGGATT本发明所提供的颌下腺特异表达多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠构建，通过如下步骤实现:(I)将5-6个hNGF基因串联并克隆到小鼠的KLK1B22基因的启动子后面；(2)所述小鼠的KLK1B22基因的启动子从BAC或基因组上面克隆，并采用ATG上游2kb左右的序列；(3)将所述小鼠的KLK1B22基因启动子的区域中REl和RE2之间的片段从载体上切下来，且所述REl和RE2之间的片段包括KLK1B22基因启动子及5_6个hNGF基因；(4)将切下来的所述REl和RE2之间的片段中的hNGF基因片段纯化；(5)将经过纯化的hNGF基因片段通过原核显微注射的方法注射到小鼠受精卵细胞核内，以生产出具有在小鼠颌下腺内特异表达的多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠。由此可见，本发明提供的颌下腺特异表达多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠构建，由于所述REl和RE2之间的片段包括5-6个hNGF基因，当把经过纯化的hNGF基因片段通过原核显微注射的方法注射到小鼠受精卵细胞核内，就可以生产出能够表达多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠。再通过鉴定获得稳定遗传的多拷贝hNGF转基因小鼠，繁殖扩大种群，就可以高效率生产人源化NGF。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
权利要求
1.颌下腺特异表达多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠构建，其特征是，包括如下步骤: (1)将5-6个hNGF基因串联并克隆到小鼠的KLK1B22基因的启动子后面； (2)所述小鼠的KLK1B22基因的启动子从BAC或基因组上面克隆，并采用ATG上游2kb左右的序列； (3)将所述小鼠的KLK1B22基因启动子的区域中REl和RE2之间的片段从载体上切下来，且所述REl和RE2之间的片段包括KLK1B22基因启动子及5_6个hNGF基因； (4)将切下来的所述REl和RE2之间的片段中的hNGF基因片段纯化； (5)将经过纯化的hNGF基因片段通过原核显微注射的方法注射到小鼠受精卵细胞核内，以生产出具有在小鼠 颌下腺内特异表达的多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠。
全文摘要
本发明公开了颌下腺特异表达多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠构建，包括如下步骤(1)将5-6个hNGF基因串联并克隆到小鼠的KLK1B22基因的启动子后面；(2)小鼠的KLK1B22基因的启动子从BAC或基因组上面克隆，并采用ATG上游2kb左右的序列；(3)将小鼠的KLK1B22基因启动子的区域中RE1和RE2之间的片段从载体上切下来，且所述RE1和RE2之间的片段包括KLK1B22基因启动子及5-6个hNGF基因；(4)将切下来hNGF基因片段纯化；(5)将经过纯化的hNGF基因片段注射到小鼠受精卵细胞核内，以生产出具有在小鼠颌下腺内特异表达的多拷贝人源NGF基因的转基因小鼠。
文档编号C12N15/89GK103146706SQ20121055409
公开日2013年6月12日 申请日期2012年12月19日 优先权日2012年12月19日
发明者毛富祥, 左从林, 李洪贞, 邓乐, 官敏 申请人:昭衍(苏州)新药研究中心有限公司